&ARM 0RZEGL.AUK Streszczenie Summary Key words; Słowa kluczowe; ' Ö

Transkrypt

1 Streszczenie Leptyna indukuje wzrost komórek nowotworowych poprzez aktywację różnych ścieżek sygnałowych w komórce. Celem pracy było porównanie transkryptomów tkanek endometrium wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) oraz wyselekcjonowanie z puli transkryptów genów kodujących białka związane z aktywnością biologiczną leptyny, które na poziomie mrna różnicują tkanki endometrium. W badaniu analizowano wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraka endometrium G1-G4, Na podstawie bazy Affymetrix, bazy NCBi i danych literaturowych wyselekcjonowano 91 transkryptów genów kodujących białka związane z aktywnością biologiczną leptyny. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wyników w programie RMA Expres wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.6,0, Excel oraz SAM (significance analysis of microarrays) Wśród tych genów w gruczolakoraku endometrium obserwowano nadekspresję MMP2, MMP9 i VEGFA. w porównaniu do endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej. Słowa kluczowe; leptyna, mikromacierz oligonukleotydowa, rak enometrium Summary Intracellular signalling pathways are activated by leptin and are involved in cancerogenesis. The aim of the study was to analyze of endometrial tissues transcriptome by using oligonucleotide microarray technique (HGU133A Affymetrix). Next, among from 91 transcripts connecting with biological activity of leptin there were choose genes which differentiated investigated tissues of endometrium. There were analyzed: endometrium histopatological estimated as healthy in proliferative phase and endometrial adenocarcinoma (G1-G4). The obtained values of fluorescence for each probe on microarray chips were normalized with the RMAExpress.. Differences in mrna levels were evaluated with SAM program (Significance Analysis of Microarrays), Statistica v.6,0 and Excel. Among from 91 transcripts connecting with biological activity of leptin including transcripts involved in leptin induced intracellular signaling pathway; MMP2, MMP9 i VEGFA occurred overexpression in cancer tisssues. Key words; leptin, oligonucleotide microarray, endometrial cancer Leptyna (LEP) początkowo zidentyfikowana jako hormon związany z regulacją przyjmowania pokarmu, jest adipokiną o wielokierunkowym działaniu. Plejotropowa natura leptyny związana jest z występowaniem w organizmie receptora leptyny Ob-R. Znanych jest kilka izoform receptora leptyny będących wynikiem alternatywnego składania eksonów i proteolitycznego rozszczepienia białek już istniejących izoform receptora (ryc. 1). Wewnątrzkomórkowa domena receptora leptyny Ob-Rb zawiera region box1 złożony z 29 aminokwasów, który przyłącza domenę kinazy tyrozynowej Janusa JAK2, region box2 również odpowiedzialny za przyłączenie kinazy JAK oraz region box3, miejsce wiązania białek STAT (ang. signal transducer and activator of transcription), które po ufosforylowaniu i utworzeniu dimerów pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych w regulacji ekspresji genów [1,] (ryc. 1). Badania Myers a dowodzą, że w przypadku długiej izoformy receptora leptyny Ob-Rb do aktywacji kinaz JAK oprócz regionu box1

2 Ryc. 1. Izoformy receptora leptyny; Ob-Ra krótka izoforma receptora leptyny, Ob- Rb długa izoforma receptora leptyny, Ob-Re rozpuszczalna forma receptora leptyny, Lep leptyna, regiony box-1, box-2, box-3; JAK2 kinaza tyrozynowa Janusa 2 (ang. Janus Kinase 2), Tyr 985, Tyr 1077, Tyr 1138 reszty tyrozynowe w obrębie wewnątrz komórkowej domeny długiej izoformy receptora leptyny, p fosforylacja, białka STAT (ang. the Signal Transducers and Activators of Transcription), MAP kinazy aktywowane mitogenami (ang. mitogen-activated protein kinases) wymagana jest także obecność odcinka złożonego z reszt aminokwasowych [2]. Długa izoforma receptora leptyny OB-Rb, ze względu na podobieństwo strukturalne do podjednostki gp 130, aktywuje po połączeniu się z ligandem ścieżki przekazu sygnału w komórce. Białko gp 130 oddziałuje z kinazami tyrozynowymi z rodziny JAK (Janus Kinase) i jest łącznikiem przenoszącym pobudzenie z aktywowanego receptora na kinazę tyrozynową Jak pokazano na rycinie 1, Ob-Rb posiada w obrębie wewnątrzkomórkowej domeny trzy konserwatywne reszty tyrozynowe; Tyr 985, Tyr 1077 i Tyr 1138, które wykazują różną zdolność aktywowania przekazu sygnału w komórce i określają plejotropową naturę receptora leptyny. Leptyna łącząc się na powierzchni komórki z receptorem OB-Rb powoduje jego dimeryzację i aktywuje poprzez transfosforylację kinazę tyrozynową Janusa JAK2, co w dalszej kolejności prowadzi do fosforylacji reszt tyrozynowych w obrębie wewnątrzkomórkowej domeny OB-Rb. Tyr 985 uczestniczy w aktywacji w komórce szlaku ERK1/2 szlaku kinaz regulowanych przez sygnały zewnątrzkomórkowe (ang. extra cellular signal-regulated kinases). Kinaza tyrozynowa JAK 2 asocjuje z Ob-Rb za pośrednictwem domeny box1 oraz fragmentu złożonego z aminokwasów. Ufosforylowane reszty tyrozynowe na powierzchni Ob-Rb stanowią miejsca przyłączania białek sygnałowych z domenami SH2 (ang. Src homology). Ufosforylowana reszta Tyr 985 przyłącza fosfatazę tyrozynową SHP-2, która następnie ulega fosforylacji i przyłącza białko adaptorowe Grb2. W konsekwencji w komórce zostaje uruchomiony przekaz sygnału za pośrednictwem kaskady kinaz MAP-2 białkowych kinaz aktywowanych przez czynniki mitogenne (ang. mitogen activated protein kinases), w który ostatecznie zaangażowane są kinazy ERK (ERK1; MAPK3 ang. extracelluarly regulated protein kinases1; mitogenactivated protein kinase 3 i ERK2; MAPK1 extracelluarly regulated protein kinases2; mitogen-activated protein kinase1) oraz kinazy MEK1/MAP2K1 i MEK2/MAP2K2 (ang. mitogen-activated protein kinase kinase 1; mitogenactivated protein kinase kinase 2) i kinaza Raf [2]. Kinazy MAP przemieszczają się do jądra komórkowego, gdzie dochodzi do fosforylacji i aktywacji czynników transkrypcyjnych, takich jak c-jun, c-fos, c-myc, erg-1 i w konse kwencji prowadzi do indukcji ekspresji genów związanych z procesami proliferacji i różnicowania]. Ufosforylowana Tyr 985 jest miejscem przyłączania się zarówno fosfatazy tyrozynowej SHP-2 jak i białka hamującego przekaz sygnału, białka SOCS3 (ang. suppressor of cytokine signaling 3). Przyłączenie białka SOCS3 do reszty Tyr 985 znosi sygnał przekazywany za pośrednictwem Ob-Rb z powodu uniemożliwienia przyłączenia się JAK2 do receptora. Białko SOCS3 oddziałuje poprzez domeny SH2 z ufosofrylowaną resztą Tyr 985 receptora leptyny blokując jego aktywność [2]. Badania ostatnich lat wykazały obecność jej receptorów (LEPR) w wielu komórkach i narządach, a co za tym idzie zaangażowanie leptyny w: angiogenezę, dojrzewanie układu rozrodczego, tworzenie kości, gojenie ran, a także funkcjonowanie układu immunologicznego [3,4,5,]. Badania ostatnich lat dowodzą, że leptyna indukuje wzrost komórek nowotworowych poprzez aktywację różnych ścieżek sygnałowych w komórce [6,7,8,9,10,]. Poznanie plejotropowej aktywności leptyny w komórkach zmienionych nowotworowo może w przyszłości być wykorzystane do projektowania strategii terapeutycznych w walce z rakiem. Chociaż ilość prac dotyczących funkcji leptyny i jej receptora w różnych typach nowotworów stale wzrasta, to jednak nadal jest to temat nie do końca poznany. Do dzisiaj nie została w pełni poznana funkcja leptyny i jej receptora w progresji różnych typów nowotworów, w tym w raku endometrium, który jest piątym pod względem częstości występowania nowotworem złośliwym kobiet [11]. Nowotwory zaliczane na podstawie badania klinicznego i patomorfologicznego do tego samego stadium zaawansowania, leczone w ten sam sposób, w różnym stopniu poddają się terapii. Różnice te przypisywane są cechom molekularnym, które odpowiedzialne są za różny przebieg kliniczny nowotworów o podobnym obrazie histologicznym. Analiza molekularna nowotworów umożliwia poszukiwanie genów, które są zaangażowane w proces nowotworzenia. Duże nadzieje w leczeniu nowotworów wiąże się z terapią celowaną, której głównym przesłaniem jest poszukiwanie leków z grupy związków oddziałujących na receptory substancji będących czynnikami wzrostu. Szlaki przekazywania sygnału w komórce odgrywające rolę w regulacji proliferacji, apoptozie i transformacji nowotworowej stanowią podstawę badań mających na celu poszukiwanie potencjalnych markerów mających znaczenie w procesie nowotworzenia. Ponieważ zasadniczym założeniem terapii celowanej jest poszukiwanie leków, które byłyby w stanie hamować receptory komórkowe, za pośrednictwem których dochodzi w ko-

3 mórce do pobudzenia szlaków związanych z procesami nowotworzenia, coraz większe znaczenie mają badania prowadzone na poziomie całego, genomu, transkryptomu lub proteromu Celem przedstawionej pracy było porównanie transkryptomów związanych z aktywnością biologiczną leptyny w endometrium prawidłowym w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraku endometrium, wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix). Materiał do badań stanowiły wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraka endometrium G1-G4, pobieranych od chorych leczonych w Katedrze i Klinice Położnictwa i Ginekologii w Katowicach. Ekstrakcja całkowitego RNA: Po homogenizacji mg wycinków endometrium przy użyciu homogenizatora Pozytron (Kinematyka AG, Szwajcaria), ekstrahowano RNA z użyciem odczynnika TRIZOL (Gibco BRL) (Invitrogen Life Technologies, Kalifornia, USA), zgodnie z protokołem producenta Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit, Qiagen w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń DNA. Ekstrakty RNA oceniano ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia) Wartość absorbancji przy długości fali 260 nm była podstawą do obliczenia stężenia RNA, przy założeniu, że wynik pomiaru w kuwecie o drodze optycznej 1 cm równy 1 OD 260 odpowiada stężeniu 40 μg RNA w 1 cm 3 ekstraktu, oraz jakościowo techniką elektroforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wyznaczanie transkryptomu metodą mikromacierzy oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HG- U133A (Affymetrix). Około 8 μg całkowitego RNA zostało wykorzystane do syntezy dwuniciowego cdna (Gibco BRL SuperScript Choice system). W następnym etapie otrzymany crna wyznakowano biotyną (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego crna przeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3 oraz HG-U133A (Affymetrix) Znakowanie produktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem streptawidyna fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGE- WS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG U133A w przewodniku Gene Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix, Kalifornia, USA). W następnym etapie płytki mikromacierzy poddano skanowaniu skanerem Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies, Kalifornia, USA). Otrzymane wyniki intensywności fluoroscencji zostały zapisane i zarchiwizowane w programie Microarray Suite. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wynikow Ryc 2. Geny związane z aktywnością biologiczną leptyny charakteryzujące się nadekspresją aktywności transkrypcyjnej w raku endometrium w porównaniu do aktywności transkrypcyjnej genów w endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej w programie RMA Expres wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.6,0, Excel oraz SAM (significance analysis of microarrays). Analizę profilu ekspresji genów kodujących białka kaskad sygnałowych aktywowanych przez leptynę w wycinkach endometrium, rozpoczęto od porównania raportów wygenerowanych w programie Microarray Suite Affymetrix bezpośrednio po odczycie sygnałów fluorescencji na mikromacierzy. Rozkład sygnałów fluorescencji na płytce, zgodny z zaleceniami producenta mikromacierzy (Affymetrix Technical Manual GeneChip Expression Analysis ) był podstawą do akceptacji kolejnych transkryptomów do analizy porównawczej, którą rozpoczęto od normalizacji wyników w programie RMA Express, w celu wyrównania zróżnicowanych wartości tła oraz szumu, zmniejszającego prawdopodobieństwo błędnej interpretacji wyników. Analizę porównawczą transkryptomów, rozpoczęto od grupowania transkryptomów wykonując aglomeracyjną analizę skupień. Jako miarę odległości między mikromacierzami wykorzystano odległość Czebyszewa, a zastosowaną metodą aglomeracji była metoda średnich połączeń ważonych. Oceniono w ten sposób zgodność grupowania wycinków na podstawie charakterystyki klinicznej, histopatologicznej i molekularnej. Do analizy porównawczej typowano te transkryptomy, które były kwalifikowane do tej samej grupy, niezależnie od zastosowanego kryterium podziału (klinicznego, histopatologicznego czy molekularnego). W dalszym etapie analizy porównawczej z grupy mrna, które można analizować na mikromacierzy HG- U133A, na podstawie danych literaturowych oraz bazy NCBI i Affymetrix wyselekcjonowano 91 transkryptów, których geny kodują białka uczestniczące w ścieżkach przekazu sygnału w komórce, aktywowanych przez leptynę. Następnie wykorzystując technikę Blanda i Altmana wy-

4 ID mrna SLR 2 SLR _at 1,41 4,09 MMP2 Metaloproteinaza 2 (gelatinase A), _s_at _s_at EGR1 białko odpowiedzi wczesnego wzrostu (early growth response 1) 2,24 9,4 MMP9 metallopeptidase 9 (gelatinase B), 1,81 6, _x_at czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular VEGFA endothelial growth factor A 1,58 4,85 Tabela 1 Transkrypty różnicujące raka endometrium wybrane z 91 mrna związanych z aktywnością biologiczną leptyny. SLR ang. signal log ratio stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych grupach, 2 SLR wartość opisująca wielokrotność różnicy sygnału fluorescencji pomiędzy porównywanymi transkryptomami, strzałka - oznacza, nadekspresję genu w wycinkach gruczolakoraka endometrium selekcjonowano geny, które różnicują wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej i gruczolakoraka endometrium G1-G4 (tab. 1, ryc 2). Technika mikromacierzy oligonukleotydowych została wykorzystana w celu analizy transkryptów wchodzących w skład ścieżek sygnałowych aktywowanych w komórce po połączeniu się leptyny z jej receptorem. Spośród 91 transkryptów genów związanych z aktywnością biologiczną leptyny, Wyznaczenie dla wszystkich transkryptów parametru SLR wskazującego wielokrotność różnicy sygnału fluorescencji charakterystycznych dla transkryptomów endometrium kontrolnego i gruczolakoraka, stanowilo jedno z kryteriów typowania genów różnicujących endometrium. Otrzymane wyniki wskazują, że obserwowane różnice aktywności transkrypcyjnej genów tj. MMP2, MMP9 i VEG- FA mogą mieć związek z procesem angiogenezy, W danych literaturowych wciąż poszerzana jest lista czynników i cząsteczek stymulujących ten proces. Istnieją doniesienia literaturowe, w których podkreśla się udział leptyny jako czynnika proangiogennego stymulującego proces angiogenezy in vivo i in vitro. Badania Somasundar i wsp. [13] na przykład dowodzą, że in vitro leptyna ma zdolność wzmagania proliferacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z siłą działania podobną do tej, jaką posiada VEGF (vascular endothelial growth factor). Badania prowadzone na modelach zwierzęcych potwierdziły, że leptyna ma zdolność stymulowania procesu angiogenezy synergistycznie z dwoma innymi kluczowymi czynnikami proangiogennymi, tj. z FGF-2 (fibroblast growth factor) i VEGF. Ponadto leptyna zwiększa ekspresję genów zaangażowanych w proces angiogenezy, tj.: MMP-2 (matrix metalloproteinases 2) i MMP-9 (matrix metalloproteinases 9) [14]. W świetle otrzymanych wyników wydaje się jednak, że proces angiogenezy w raku endometrium stymulowany jest raczej poprzez aktywację VEGF a nie leptynę, o czym świadczy brak tej ostatniej wśród genów różnicujących badane tkanki nowotworowe i histopatologicznie ocenione jako zdrowe. Piśmiennictwo 1. Frühbeck G. Intracellular signalling pathways activated by leptin. Biochem J 2006; 1(393): Myers MG, Jr. Leptin receptor signaling and the regulation of mammalian physiology. The Endocrine Society 2004; 59: Trentz O.A, Handschin A.E., Hemmi S., Zund G, Wanner G.A., Trentz O. Leptin regulates human osteoblast proliferation and phenotype marker expression in vitro. European Cells and Materials. 2004; 7(1), Frank S., Stallmeyer B., Kampfer H., Kolb N., Pfeilschifter J. Leptin enhances wound re-epithelialization and constitutes a direct function of leptin in skin repair. J- Clin-Invest. 2000; 106(4), Matarese G. Leptin and the immune system: how nutritional status influences the immune response. Eur Cytokine Netw. 2000; 11(1), Pai R, Lin C, Tran T, Tarnawski A. Leptin activates STAT and ERK2 pathways and induces gastric cancer cell proliferation. Biochem Biophys Res Commun Jun 17;331(4): Frankenberry KA, Skinner H, Somasundar P, McFadden DW, Vona-Davis LC. Leptin receptor expression and cell signaling in breast cancer. Int J Oncol Apr;28(4): Somasundar P, Frankenberry KA, Skinner H, Vedula G, McFadden DW, Riggs D, Jackson B, Vangilder R, Hileman SM, Vona-Davis LC. Prostate cancer cell proliferation is influenced by leptin. J Surg Res May 1;118(1):71-82] 9. Attoub S., Noe V., Pirola L., Bruyneel E., Chastre E., Mareel M., Wymann M.P., Gespach Ch. Leptin promotes invasiveness of kidney and colonic epithelial cells via phosphoinositide 3-kinase-, Rho-, and Rac-dependent signaling pathways. The FASEB Journal. 2000;14, Koda M., Sulkowska M., Wincewicz A., Kanczuga-Koda L., Musiatowicz B., Szymanska M, Sulkowska S. Expression of leptin, leptin receptor, and hypoxia inducible factor 1α in human endometrial cancer. Annals of the New York Academy of Sciences. 2007; 1095(1), Kaźmierczak W. Rak endometrium aspekty hormonalne. Ginek Prakt. 2004; 12( 2), Somasundar P, Yu AK, Vona-Davis L, McFadden DW. Differential effects of leptin on cancer in vitro. J Surg Res 2003; 113:

5 13. Park HY, Kwon HM, Lim HJ, Hong BK, Lee JY, Park BE, Jang Y, Cho SY, Kim HS. Potential role of leptin in angiogenesis: leptin induces endothelial cell proliferation and expression of matrix metalloproteinases in vivo and in vitro. Exp Mol Med. 2001; 33(2): Adres do korespondencji: mgr Małgorzata Stachowicz Katedra i Zakład Biologii Molekularnej Wydziału Farmaceutycznego i Oddziału Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Sosnowiec, ul. Narcyzów 1, tel.: , fax: , g_stach@o2.pl