(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/NL02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/NL02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/ (51) Int.Cl. C12N 7/04 ( ) C12N 15/86 ( ) C07K 14/165 ( ) A61K 39/225 ( ) A61K 39/215 ( ) (54) Wyizolowana lub zrekombinowana replikatywna cząsteczka podobna do koronawirusa, kompozycja zawierająca tą cząsteczkę do zastosowania terapeutycznego, do zastosowania jako immunogen lub szczepionka i do zastosowania diagnostycznego (30) Pierwszeństwo: , EP, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 22/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/11 (73) Uprawniony z patentu: STICHTING VOOR DE TECHNISCHE WETENSCHAPPEN, Utrecht, NL UNIVERSITEIT UTRECHT, Utrecht, NL (72) Twórca(y) wynalazku: PETRUS JOSEPHUS MARIE ROTTIER, Groenekan, NL CORNELIS ALEXANDER MARIA DE HAAN, Houten, NL BERT JAN HAIJEMA, Utrecht, NL BEREND JAN BOSCH, Utrecht, NL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana lub zrekombinowana replikatywna cząsteczka podobna do koronawirusa, kompozycja zawierająca tą cząsteczkę do zastosowania terapeutycznego, do zastosowania jako immunogen lub szczepionka i do zastosowania diagnostycznego. Koronawirusy mają raczej prostą budowę. Posiadają nukleokapsyd otoczony błoną lipidową. Helikalny nukleokapsyd składa się z genomowego RNA otoczonego jednym typem białka, nukleokapsydowym białkiem N. Otoczka wirusowa ogólnie zawiera trzy białka błonowe: białko kolca (S), białko błonowe (M) i białko otoczki (E). Niektóre koronawirusy mają w swojej błonie czwarte białko, białko esterazy hemaglutyniny (HE). Jak wszystkie wirusy koronawirusy kodują ogromną różnorodność produktów genowych i białkowych. Najważniejszymi z nich są oczywiście białka odpowiedzialne za funkcje związane z replikacją wirusa i strukturą wirionu. Poza tymi funkcjami wirusy ogólnie określają różnorodne zbiory białek, których funkcja jest nadal nieznana, a o których wiadomo lub przypuszcza się, że w jakiś sposób są korzystne dla wirusa. Białka te mogą być zarówno funkcjonalnie zasadniczymi dla replikacji wirusa w hodowli komórkowej lub mogą być niepotrzebne. Koronawirusy stanowią rodzinę dużych RNA wirusów o nici plus, które zazwyczaj powodują zakażenia układu oddechowego i jelitowe u wielu różnych gatunków. Opierając się na antygenowym, genetycznym i strukturalnym kryterium białka mogą być one podzielone na trzy różne grupy: grupa I, II i III. Obecnie, z uwagi na znaczne różnice pomiędzy grupami klasyfikacja do trzech, różnych rodzajów jest dyskutowana przez znaną grupę badawczą ICTV. Właściwościami posiadanymi przez wszystkie te wirusy jest specyficzny zespół genów warunkujących replikację i funkcje strukturalne. Sekwencje występujące pomiędzy i otaczające te geny różnią się znacznie pomiędzy grupami i są bardziej lub mniej specyficzne dla każdej grupy. Podstawowe geny zajmują około dwóch trzecich genomu. Umiejscowiony po jego 5' stronie tzw. gen polimerazy koduje dwa duże prekursory dające liczne funkcjonalne produkty cięcia, które są wspólnie odpowiedzialne za replikację i transkrypcję RNA. Inne, podstawowe geny określają białka strukturalne N, M, E i S. Białko nukleokapsydu (N) upakowuje wirusowy RNA tworząc rdzeń wirionu. Ta struktura (RNP) jest otoczona przez otoczkę lipidową, w której białko błony (M) występuje powszechnie tworząc gęstą macierz. Z białkiem M związane jest małe białko otoczki (E) i białko kolca (S), to ostatnie tworzy peplomery wirusa związane z fuzją wirus-komórka i komórka- -komórka. Geny dla tych białek strukturalnych niezmiennie występują w genomie wirusa w porządku 5'-S-E-M-N-3'. W zakażonych komórkach nukleokapsydy koronawirusa są składane w cytoplazmie. Nukleokapsydy oddziałują z białkami otoczki wirusa, które po ich syntezie w retikulum endoplazmatycznym gromadzą się w kompartmencie pośrednim, systemie błonowym umiejscowionym pomiędzy retikulum endoplazmatycznym (ER) i kompleksem Golgiego. Ten system błon działa jako kompartment pączkowania: oddziaływanie nukleokapsydów z białkami otoczki wirusa prowadzi do oddzielenia wirionów, które są następnie uwalniane z komórki przez egzocytozę. Obecnie pokazano, że składanie cząsteczek koronawirusa nie wymaga udziału nukleokapsydów. Cząsteczki pozbawione nukleokapsydu są składane w komórce, gdzie współekspresji ulegają geny białka otoczki wirusa. Minimalnymi wymaganiami dla tworzenia wiruso-podobnych cząsteczek wirusa (ang. virus-like particles) (VLP) są: białko M i E; białko S jest zbędne, lecz jest włączane jeśli występuje dzięki swojemu oddziaływaniu z białkiem M. Analizy biochemiczne i elektronomikroskopowe pokazały, że VLP są homogenne pod względem wielkości i mają podobne wymiary jak prawdziwe koronawirusy. Jasnym jest, że białka M i E mają zdolność do wiązania się ze sobą w płaszczyźnie błon komórkowych i wywoływania krzywizny prowadzącej do wypączkowania specyficznych nośników", które są następnie wydzielone z komórek. Artykuł opisujący te wyniki ukazał się w EMBO Journal (tom 15, str , 1996). W kolejnym artykule pokazano cząsteczki typu koronawirusa, które nie posiadały nukleokapsydu, tutaj składanie nie miało miejsca niezależnie od nukleokapsydu (Bos i wsp., Virology, 218, 52-60, 1995). Ponadto, pakowanie RNA nie było bardzo wydajne. Ponadto, żadna z tych dwóch publikacji nie dostarcza dostatecznych właściwości adresowania i dostarczenia, które uczyniłyby VLP użytecznymi jako terapeutyczny nośnik, przykładowo wyposażonymi w specyficzną informację pozwalającą na adresowanie i/lub informację genetyczną i nie genetyczną. Jednakże, koronawirusy posiadają szereg znaczących korzyści teoretycznych co do ich zastosowania jako wektorów w stosunku do innych wirusowych systemów ekspresji (patrz również WO 98/49195): (i) koronawirusy są jednoniciowymi wirusami RNA, które replikują się w cytoplazmie bez

3 PL B1 3 pośredniczącego DNA, czyniąc mało prawdopodobnym integrowanie wirusowego genomu do chromosomu komórki gospodarza; (ii) wirusy te mają największe znane genomy RNA mające dostatecznie dużo miejsca dla wprowadzenia dużych, obcych genów; (iii) ponieważ koronawirusy ogólnie zarażają powierzchnię śluzówki układu oddechowego jak i śluzówki jelitowej, mogą być użyte dla indukcji silnej, wydzielniczej odpowiedzi immunologicznej; (iv) tropizm koronawirusów może być zmodyfikowany przez manipulowanie białkiem kolca (S) pozwalającym na przebudowę tropizmu i wirulentności wektora; i (v) nie patogenne szczepy koronawirusów zarażające większość interesujących gatunków są dostępne dla opracowania systemów ekspresji. Opracowano dwa typy wektorów ekspresyjnych opartych na genomach koronawirusów. Jeden wymaga dwóch składników (zależny od wirusa pomocniczego) a drugi genomu pojedynczego, który jest zmodyfikowany zarówno przez rekombinację nacelowywaną lub poprzez przebudowanie cdna kodującego zakaźny RNA. Zależne od wirusa pomocniczego systemy ekspresji, nazwane również mini genomami zostały opracowane przy pomocy przedstawicieli tych trzech grup koronawirusów. Minigenomy pochodzące od koronawirusa posiadają teoretyczną pojemność klonowania zbliżoną do 25 kb, podczas gdy minigenomy RNA o około 3 kb są wydajnie powielane i pakowane przez wirus pomocniczy i ten genom wirusa ma około 30 kb. Jest to zasadniczo największa pojemność klonowania dla wektora opartego na wirusowych genomach RNA. Odwrotna genetyka była możliwa przez ukierunkowaną rekombinację pomiędzy wirusem pomocniczym a niezdolnym do replikacji lub replikującym, pochodzącym z koronawirusa RNA (9). Ukierunkowana rekombinacja realizowana jest przez jeden lub dwa crossing-over. Zmiany wprowadzono w genie S, które zmodyfikowały patogenność MHV. Do MHV wprowadzono gen kodujący zielone białko fluorescencyjne (GFP) pomiędzy genami S i E przez ukierunkowaną rekombinację tworzącą wektor, który jest największym znanym RNA genomem wirusowym (1d). Mutacje uzyskano również przez ukierunkowaną mutagenezę w obrębie genów dla E i M pokazując kluczowe znaczenie tych genów dla składania. Konstrukcja pełnej długości klonu genomowego cdna może znacząco usprawnić manipulacje genetyczną koronawirusem. Obecnie możliwą stała się konstrukcja zakaźnego klonu TGEV cdna (1c). Dla uzyskania zakaźnych cdna połączono trzy strategie: (i) konstrukcje pełnej długości cdna rozpoczęto od DI, który był stabilnie i wydajnie zastąpiony przez wirus pomocniczy. Przy pomocy tego DI pełnej długości genom został skompletowany i powiększenie genomu sprawdzono po każdym etapie. Podejście to pozwoliło na zidentyfikowanie fragmentu cdna, który był toksyczny dla bakteryjnego gospodarza. Spostrzeżenie to wykorzystano dla uzyskania korzyści przez ponowne wprowadzenie toksycznego fragmentu do wirusowego cdna w ostatnim etapie klonowania; (ii) w celu uzyskania ekspresji długiego genomu koronawirusa i w celu dodania użyto 5' cap dwuetapowego systemu amplifikacji, który umożliwia transkrypcje w jądrze komórkowym z promotora CMV z drugą amplifikacją w cytoplazmie, prowadzoną przez wirusową replikazę; i (iii) w celu zwiększenia stabilności wirusowego cdna w bakterii, cdna sklonowane jako sztuczny chromosom bakteryjny (BAC) wytwarzający jedynie jedną lub dwie kopie plazmidu na komórkę. Pełnej długości cdna podzielono na dwa plazmidy ponieważ jego włączenie do jednego zmniejszało stabilność cdna. Jeden plazmid zawiera wszystkie sekwencje wirusowe z wyjątkiem fragmentu Clal do Clal o długości około 5 kb, który był włączony do drugiego BAC. W pełni funkcjonalny zakaźny klon cdna, prowadzący do wirulentnego wirusa zdolnego do zarażenia zarówno układu pokarmowego jak i oddechowego zbudowano przez wbudowanie fragmentu Clal do pozostałości sekwencji cdna TGEV. Jak wspomniano, skonstruowano systemy ekspresji zależne od wektora pomocniczego, oparte na dwóch składnikach i pojedynczych genomach skonstruowanych przez ukierunkowaną rekombinację lub przy użyciu infektywnego cdna. Scharakteryzowano sekwencje, które regulują transkrypcję. Uzyskano ekspresję dużych ilości heterologicznych antygenów (1 do 8 μg/10 6 komórek) i utrzymywano ekspresję przez około 10 szczepień. Te poziomy ekspresji powinny być dostateczne dla wywołania ochronnych odpowiedzi immunologicznych. Pojedynczy genom wektorów koronawirusowych został skonstruowany w celu osiągnięcia wydajnej ekspresji obcego genu takiego jak GFP. W ten sposób utworzony został nowy kierunek dla koronawirusów, które mają unikalne właściwości takie jak duży genom oraz tropizm jelitowy, co czyni je bardzo interesującymi jako wektory ekspresyjne, przy czym zarówno dla opracowania szczepionki jak i dla terapii genowej spełnione muszą być również i inne warunki, to znaczy w granicach wymagań musi mieścić się zarówno znacząca wirulencja konstruktów wektora dla gospodarza jak i żywotność konstruktów wektora w hodowli komórkowej. Z drugiej strony, wektor może nie pozostawać zbyt wiru-

4 4 PL B1 lentnym, lecz powinien posiadać przynajmniej kilka atenuowanych właściwości czyniąc go użytecznym dla replikacji in vivo jako nośnika dostarczającego gen lub szczepionkę gospodarzowi lub podmiotowi podlegającemu leczeniu. Z drugiej strony wektor powinien dobrze replikować się w hodowli komórkowej, przynajmniej gdy pożądane jest jego komercyjne użycie. Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana lub zrekombinowana replikatywna cząsteczka podobna do koronawirusa, w której naturalny porządek genów dla białek strukturalnych 5'-S-E-M-N-3' jest zmieniony przez reanranżację genów. W cząsteczce według wynalazku korzystnie usunięty jest co najmniej funkcjonalny fragment z kwasu nukleinowego kodującego produkt genu wirusowego innego niż polimeraza lub białko strukturalne N, M, E lub S. Cząsteczka według wynalazku jest dostarczona z co najmniej jednym białkiem związanym z powierzchnią wspomnianej cząsteczki podobnej do korona wirusa, który to fragment jest wybrany z grupy składającej się z ektodomeny białka kolca lub jego części innego koraonawirusa, ektodomeny białka otoczki lub jego części wirusa nie należącego do koronawirusów, enzymatycznie aktywnej cząsteczki i domeny aminokońcowej lub jej części jakiegokolwiek błonowego nie-wirusowego białka typu I. W następnym korzystnym wykonaniu, cząsteczka według wynalazku dostarczona jest z co najmniej jednym biologicznie aktywnym białkiem lub jego fragmentem związanym z wnętrzem wspomnianej cząsteczki podobnej do koronawirusa, innej niż naturalna endodomena któregokolwiek białka oryginalnego koronawirusa. Również korzystnie, cząsteczka dostarczona jest z co najmniej jednym funkcjonalnym środkiem adresowania związanym z powierzchnią wspomnianej cząsteczki podobnej do koronawirusa, innej niż naturalne białko kolca koronawirusa. W kolejnym korzystnym wykonaniu, cząsteczka według wynalazku jest dostarczona z genomem koronawirusa, do którego został wbudowany obcy gen lub jego część. Ponadto, cząsteczka według wynalazku korzystnie jest cząsteczką atenuowaną. Cząsteczka według wynalazku jest korzystnie nośnikiem dostarczającym gen. Cząsteczka według wynalazku, korzystnie jest antygenem lub epitopem dostarczającego nośnika. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja zawierająca wyizolowaną lub zrekombinowaną replikatywną cząsteczkę podobną do koronawirusa, w której naturalny porządek genów dla białek strukturalnych 5'-S-E-M-N-3' jest zmieniony przez reanranżację genów dla zastosowania terapeutycznego. Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca cząsteczkę jak zdefiniowano powyżej i farmaceutycznie akceptowalny nośnik dla zastosowania jako immunogen lub szczepionka. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja zawierająca szczepionkę jak zdefiniowano powyżej dla zastosowania diagnostycznego. Ogólnie w wynalazku opisano replikującego się koronawirusa i replikujące się cząsteczki typu korona (VLP), w których usunięto duże części ich genomu (przynajmniej funkcjonalnie) i/lub przebudowano nie znosząc ich zdolności do replikacji. Wspomniana delecja jest korzystnie uzyskana jako przynajmniej delecja funkcjonalna pod tym względem, że gen koronawirusa nie ulega wcale lub ulega jedynie częściowej ekspresji, w konsekwencji czego brak jest produktu genu, gen jest pozbawiony swojej funkcji lub przynajmniej funkcjonalnie odmienny od odpowiadającego mu genowego produktu typu dzikiego. Pewien zaskakujący wynik obserwowany dla VLP dostarczonych z delecjami i/lub przebudowaniami jakie tu opisano jest taki, że wspomniane delecje lub rearanżacje VLP zachowują zdolność do replikacji in vitro i in vivo i ogólnie są dobrze attenuowane pod tym względem, że nie powodują choroby (lub wywołują ją w znacznie mniejszym stopniu) u docelowego gospodarza, czyniąc go bardzo użytecznym dla zastosowania terapeutycznego, przykładowo jako nośnik dostarczania genu lub innej transportowanej substancji (co za tym idzie zapewnione może być specyficzne adresowanie, gdy jest to pożądane) lub dla użycia jako szczepionka, będąc attenuowanymi gdy przenoszą ważną determinantę immunogenową pozwalającą na wywołanie odpowiedzi immunologicznej. Takie determinanty (homologiczne lub heterologiczne) koronawirusów mogą także pochodzić z innych patogenów. Innymi słowy wynalazek pozwala na zastosowanie replikującej się VLP z częściowo usuniętym i/lub przebudowanym genomem jako wektora. Do wektora tego może być wprowadzona sekwencja obcego kwasu nukleinowego. Ta sekwencja obcego genu koduje (część) białko. To białko lub jego część, kodowane przez wbudowaną sekwencję, może służyć jako immunogen lub element adresujący" (ligand zdolny do wiązania się z receptorem).

5 PL B1 5 W korzystnej postaci, wspomniane VLP jakie tu dostarczono są dalej modyfikowane na jeden lub wiele sposobów, genomicznie lub w ich białkowym składzie, przez co eksponują na swojej powierzchni różne biologiczne lub docelowe cząsteczki i/lub przenoszą w tych cząstkach cząsteczki z aktywnością biologiczną, która powinna być zabezpieczona lub osłabiana i/lub zawierają genomy do których włączono obce geny lub sekwencje. Jednymi z głównych potrzeb współczesnej medycyny są systemy dla ukierunkowanego dostarczenia do ciała czynników terapeutycznych. W konsekwencji, opracowanie nośników, które mogą skierować zawartość do specyficznych grup komórek i wprowadzić tą zawartość do tych komórek tak, że może ona ujawnić swoją aktywność biologiczną, jest głównym celem w badaniach biomedycznych. W opracowanie i testowania systemów opartych na liposomach, mikrosferach, przeciwciałach itp. dla dostarczenia leków, genów, peptydów i białek już został włożony wielki wysiłek. Choć wiele tych podejść jest obiecujących to do chwili obecnej sukces w tym względzie jest ograniczony. Genom VLP jaki tu dostarczono posiada delecję i/lub uległ rearanżacji w takim zakresie, że nie zniesiona jest jego zdolność do replikacji i służy on bardzo dobrze jako adresujący nośnik dla wspomnianej zawartości. Dostarczając wspomniane VLP z zawartością lub użycie VLP jako wektora jest np. dokonane przez wbudowanie sekwencji obcego genu kodującej pożądaną cząsteczką taką jak ligand lub cząsteczka wiążąca, czy jest immunogenem czy cząsteczką wiążącą receptor lub jakimkolwiek innym białkiem lub peptydem. W korzystnej postaci wspomniany ładunek obejmuje kwas nukleinowy, do którego włączono obce geny lub sekwencje. Obce geny mogą być wyrażone przez VLP zarówno poprzez dodatkowe wbudowanie takiego genu do genomu lub przez zastosowanie przestrzeni genetycznej stworzonej przez usunięcie nieistotnych genów. Dla dalszego zwiększenia bezpieczeństwa leczenia dostarczeniem genu przy pomocy wirusów typu korona, takiego jak dostarczony tu VLP, wynalazek pozwala na rozwinięcie metody hamowania lub ogólnie blokowania zakażenia koronawirusami i cząsteczkami typu koronawirusów w szczególności, obejmującego leczenie organizmu lub komórek zagrożonych zakażeniem lub zakażonych takimi koronawirusami lub VLP z tzw. hepta powtórzonymi peptydami jak tu opisano. W przypadku wszystkich koronawirusów stwierdzono, że posiadają jeden lub dwa charakterystyczne hepta powtórzone obszary w ich białku S, które są narzędziem podczas wnikania koronawirusa do komórki. Peptydy pochodzące z proksymalnego błonowego obszaru hepta powtórzeń (HR2; np. dla szczepu MHV peptyd A59 składa się z aminokwasów białka S, patrz również Fig. 20) i są szczególnie silnymi inhibitorami zakażenia jak również fuzji zakażonych komórek otaczającymi je cząsteczkami, jak określono w szczegółowym opisie ilustrującym dostarczone korzyści. Oczywiście leczenie peptydem nie jest ograniczone do przypadku terapii genowej lub terapii dostarczenia nośnika jaki tu przedstawiono, lecz może być również użyta w zapobieganiu lub ogólnie leczeniu zarażeń koronawirusowych. Wynalazek dostarcza replikatywnych VLP, które są również zmodyfikowane w ektodomenie i/lub endodomenie białka wirusowego. Przykładowo, modyfikując ektodomenę białka kolca, dostarczony jest VLP ze zmodyfikowanymi cząsteczkami biologicznymi w sensie adresowania, które służą do kierowania VLP do oddziaływania z innymi cząsteczkami biologicznymi, które odzwierciedlają lub mogą oddziaływać z celem takim jak receptory białkowe na komórkach, być receptorami hormonu, specyficznymi immunoglobulinami na komórkach B, MHC i cząsteczkami towarzyszącymi MHC obecnymi na komórkach T i innymi komórkami przenoszącymi białka lub innymi cząsteczkami receptora znanymi fachowcom w dziedzinie powierzchniowych receptorów komórkowych. Adresowanie może również być zapewnione dla oddziaływania ze znanymi miejscami wiązania wybranych enzymów z białkami lub innymi cząsteczkami służącymi jako substraty dla wybranego enzymu. Replikujące się VLP według wynalazku są dostarczone w postaci prezentującej determinantę immunogeniczną, taką jak toksyna bakteryjna lub heterologiczne białko wirusowe lub bakteryjne zawierające odpowiednią determinantę antygenową specyficzną dla patogenności. Jest to przykład, w którym VLP służy jako immunogen lub szczepionka, przykładowo tu skierowana przeciwko toksynie bakteryjnej. Limfocyty B niosące odpowiednią immunoglobulinę na swojej powierzchni są przypadkiem adresowania komórek do VLP rozpoznanych przez limfocyt B, ta komórka(i) będzie powielała się wytwarzając odpowiednie przeciwciała. Przygotowanie koronawirusów lub VLP ze zmodyfikowanymi kolcami może być osiągnięte genetycznie przez modyfikowanie genomu wirusowego tak, że wyraża on w zarażonych komórkach zmodyfikowane białko S. Dostarczone są również tu preparaty koronawirusów o zmienionych kolcach, na różne sposoby, przez ekspresję zmodyfikowanych genów S w komórkach, które są ponadto zarażone koronawirusami. Współwbudowanie zmienionych w wyniku mutacji kolców dostarcza wirusów o nowych właściwościach adresujących. W jednej postaci wynalazek dostarcza cząsteczkę typu koro-

6 6 PL B1 nawirusa (VLP) zawierający genom z przynajmniej fragmentem szeregu genów lub grup genów nie należących do genów związanych z funkcjami polimerazy (ORF1a/1b) lub strukturalne białka N, M, E i S usunięte bez całkowitej utraty zdolności do replikacji, co za tym idzie dostarczając te VLP o korzystnych właściwościach dla zastosowania terapeutycznego, przykładowo jako wektora celem dostarczenia genu lub dla zastosowania jako szczepionki dostarczającej dogodny antygen lub epitop dla wywołania odpowiedzi immunologicznej w interesującym gospodarzu. Innymi słowy, nie istotne geny koronawirusów nie są kluczowe dla wzrostu in vivo lecz określają wirulentność wirusa. Attenuacja spowodowana ich delecją dostarcza, co za tym idzie, doskonałych szczepionek wirusowych i leczniczych wektorów. Dostarczenie genu lub szczepienie koronawirusami może obecnie być osiągnięte dzięki wiedzy dającej pewność, że cząsteczki typu wirusowego dostarczające gen lub interesujący antygen są dostatecznie attenuowane, aby nie powodować specyficznej choroby wywołanej koronawirusem. Oczywiście, wśród VLP, którym usunięto jakikolwiek lub szereg z wyżej wspomnianych nieistotnych genów, wynalazek dostarcza również VLP dostarczonych z korzystnie funkcjonalnymi pod względem istotnego fragmentu peptydu z przynajmniej 4 oryginalnych aminokwasów, korzystnie przynajmniej 40, i nie jest wyrażany, usunięty żaden lub geny kodujące białka struktury, w szczególności taka delecja białka struktury prowadzi do VLP o zmodyfikowanym kolcu, o innej niż naturalna ektodomenie (lub endodomenie) białka kolca oryginalnego koronawirusa. Wirusy z grupy I, włącznie z wirusem powodującym zapalenie jelit kotów (VIPV) prawdopodobnie jako najbardziej złożonym przedstawicielem, posiadają swoje typowe geny umiejscowione pomiędzy genami S i E i poniżej genu N, tj. pomiędzy genem N i 3' UTR (obszar nie podlegający translacji). Wirusy grupy II, do których należą wirusy mysiej żółtaczki (MHV), posiadają swoje szczególne geny pomiędzy genem kodującym polimerazę i genami S i genami dla białek S i E. Jedno z kodowanych białek charakterystycznych dla tej grupy to białko esterazy hemaglutyniny (HE), które jest wbudowane do wirionów i którego aktywności hemaglutynizujące i esterazy zostały wykazane. Aktywności HE nie są istotne i ich znaczenie wymaga oceny. Ostatecznie, również wirusy grupy III, których prototypem jest wirus zarażający oskrzela (IBV), posiadają sekwencje pomiędzy genami S i E, lecz również pomiędzy genami M i N. Podczas gdy dla pewnych genów grupowo specyficznych nie można wykryć produktów ekspresji w zarażonych komórkach, dla innych (np. gen HE w MHV) naturalnie występujące mutanty wirusa, które zaobserwowano posiadają delecje w tych genach, istniej możliwość, że w przypadku pewnych z tych genów istotne lub kluczowe są nie produkty białkowe lecz inne produkty ekspresji genów, takie jak sekwencje nukleotydowe (DNA lub RNA). Rozważając, że w oparciu o organizacje genomu, rozróżnione mogą być trzy grupy koronawirusów, wynalazek dostarcza dla grupy I (FCoV) zrekombinowanego VLP, z którego korzystnie fragment (korzystnie dający przynajmniej funkcjonalną delecję odpowiedniego genu, który nie jest lub jedynie częściowo ulega ekspresji w konsekwencji czego brak jest produktu genu, pozbawiony funkcji lub przynajmniej funkcjonalnie inny od odpowiadającego mu produktu genu typu dzikiego) z genu 3a, 3b, 3c, 7a lub 7b lub wspomniany gen jako całość został usunięty. Takie VLP z delecją pozostają zdolne do replikacji in vitro i in vivo i są dobrze attenuowane i co jest kluczowe, nie powodują choroby u docelowego gospodarza, co czyni je bardzo dogodnymi dla zastosowania terapeutycznego, przykładowo jako dostarczające nośników dla genów i innych ładunków (gdy specyficzne adresowanie może być dostarczone, gdy jest to pożądane) i dla użycia jako szczepionka, będąc attenuowanymi i jednocześnie niosąc ważne determinanty immunogeniczne pozwalające na wywołanie odpowiedzi immunologicznej. Takie wirusy grupy I z delecją, szczególnie kocie koronawirusy, takie jak FIPV, z których fragment odpowiadający genowi 3c i/lub 7b został usunięty, jest szczególnie bezpośrednio użyteczny jako szczepionka, bowiem wyraża odpowiednie determinanty antygenowe i immunogeniczne przez swoje strukturalne (przykładowo kolec) białka i ma funkcjonalną delecję tak, że uzyskana jest attenuacja prowadząca do bezpiecznej i skutecznej szczepionki. Takie żywe, attenuowane wirusy nadal wywołują najpełniejsze spektrum humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej wymaganej dla ochrony przed zarażeniem i/lub chorobą. Ponadto, tak jak usunięte VLP dla zapobiegania chorobie kotów mogą być dostarczone heterologiczne białka (lub ich funkcjonalne fragmenty), takie jak (gliko)proteiny wirusa białaczki kota, kociego kalicywirusa, kociego wirusa opryszczki, pozwalające na wytworzenie szczepionki biwalentnej lub nawet multiwalentnej. Gdy jest to pożądane inne immunologicznie lub terapeutycznie ważne białka, takie jak cytokiny, są włączone zamiast lub równocześnie. Ponadto, wynalazek dostarcza dla grupy II (MHV) zrekombinowanego VLP, z którego korzystnie fragment (korzystnie dający przynajmniej funkcjonalną delecję) z genu 2a HE, 4a, 4b lub 5a wspomnianego genu jak również cały zostały usunięte. Wirusy grupy II z takimi delecjami, szczególnie MHV, są

7 PL B1 7 dostarczone z korzystnymi właściwościami dla zastosowania terapeutycznego, przykładowo szczególnie jako wektor dla dostarczania. Takie VLP z delecją pozostają zdolne do replikacji in vitro i in vivo jak również attenuowane tak, że zasadniczo nie powodują choroby u docelowego gospodarza tworząc go bardzo dogodnym dla zastosowania terapeutycznego, jako nośniki dla genów i innego ładunku (gdy dostarczone może być specyficzne adresowanie, jeśli jest to pożądane) i dla użycia jako szczepionka, będąc attenuowanymi, niosąc jednocześnie ważne determinanty immunogenowe pomagające w wywołaniu odpowiedzi immunologicznej. Dla grupy III (IBV) dostarczony jest zrekombinowany VLP, z którego korzystnie fragment (korzystnie powodujący przynajmniej funkcjonalną delecję) z genu 3a, 3b, 5a lub 5b lub cały wspomniany gen, zostały usunięte. W innej postaci dla grup I, II lub III wynalazek dostarcza cząsteczkę typu wirusa zdolną do replikacji, wspomniana cząsteczka pochodzi w koronawirusa, w którym geny dla białek struktury nie występują w kolejności 5'-S-E-M-N-3'. Takie replikatywne VLP o przebudowanej kolejności genu mają dwie ważne właściwości. Jedną jest bezpieczeństwo wynikające z faktu, że homologiczna rekombinacja genomu VLP z przypadkowym wirusem o naturalnym pochodzeniu jest nieprawdopodobna jako wytwarzająca żywotne, nowe potomstwo. Inną, jest attenuowanie wynikające z przetasowania tych genów. Takie, replikatywne VLP o zmienionej kolejności genów dostarczają dobrze attenuowanych VLP dla szczepienia lub zastosowania dla dostarczenia genu i jest dostarczony tu z delecjami również nieistotnych genów. Pokazano tu, że zmiany w tzw. niezmiennym porządku genów wpływają na funkcje polimerazy (ORF1a/1b) i białek struktury S, E, M i N w genomie koronawirusa jest, co zaskakujące dobrze tolerowane, przykładowo, VLP o porządku genów S, M, E, N lub E, S, M, N są proste do uzyskania. Również w różnych miejscach genomu wirusa mogą być wbudowane obce geny, zarówno jako gen dodatkowy lub zastępując usunięte nieistotne geny; geny te ulegają ekspresji i są stabilnie utrzymywane podczas pasażowania wirusa. W kolejnej postaci, wynalazek dostarcza zrekombinowanego VLP, w którym kwas nukleinowy kodujący białko S został zmodyfikowany przynajmniej przez częściową delecję. Białko S tych wirusów jest odpowiedzialne za wiązanie z receptorem komórkowym i następnie za fuzje błony wirusa i komórkowej podczas wnikania. Te dwie funkcje te zachodzą w oddzielnych obszarach cząsteczkowych: wiązanie receptora w części amino-końcowej i fuzja w części karboksy-końcowej. Dlatego, przez zastąpienie domeny wiążącej receptora (części) przez cząsteczki biologiczne o innej specyficzności adresowania koronawirus może być skierowany na oddziaływanie z różnymi cząsteczkami docelowymi, które są przykładowo wyrażone na powierzchni komórek. Czyniąc tak bez wpływania na funkcję fuzji białka S, VLP według wynalazku może ulec fuzji z lub wniknąć do komórek normalnie nie zarażanych przez oryginalny wirus. Wynalazek dostarcza cząsteczki wiruso-podobne (VLP) pochodzące z koronawirusów, w których jedną lub więcej kopii wirusowych białek błonowych zmodyfikowano tak, aby zawierały cząsteczki obcego białka wirusowego (zarówno koronawirusa lub nie koronawirusa) lub nie pochodzące od wirusa, które to cząsteczki są albo zastępują części białek błony VLP lub są wbudowane do tych białek błonowych, przez co stanowiąc ich integralną część. W związku z tym, VLP są zaopatrywane w nowe właściwości biologiczne takie jak nowe sposoby adresowania lub informacje immunologiczne lub białka o specyficznej aktywności biologicznej zawarte w cząsteczce wiruso-podobnej, której właściwości biologiczne są związane z VLP za lub w miejscu naturalnego białka kolca oryginalnego koronawirusa. W pewnej postaci wynalazku, jest dostarczony zrekombinowany VLP z usuniętym i/lub przebudowanym genomem tak, że (część) ektodomeny (tj. część eksponowana na zewnątrz cząsteczki wirusa) białka kolca została zastąpiona przez odpowiadającą jej domenę (lub jej część) białka kolca innego koronawirusa. W ten sposób, VLP nabył innej komórkowej, specyficzności substratowej, przez co VLP jest zdolny do wniknięcia do innych komórek niedostępnych lub wrażliwych na oryginalny koronawirus. W dalszej postaci wynalazku dostarczone są VLP złożone z białek M i E mysiego koronawirusa żółtaczki (MHC) białek i które zawierają cząsteczki chimerowego kolca obejmujące transbłonowe lub końcową karbosylową domenę MHV S, lecz endodomenę białka kolca koronawirusa powodującego zapalenie jelit u kota (FIPV). Te VLP mogą teraz wnikać do komórek kota i dostarczać cząsteczki typu MHV. Cząsteczki o takich chimerowych kolcach są wytwarzane przez sporządzenie konstruktów genu S koronawirusów MHV, w których obszar kodujący amino-końcową domenę jest zastąpiony przez odpowiednią domenę FIPV. Konstrukty te są wbudowane do plazmidów za promotorem polimerazy bakteriofaga T7. Konstrukty są następnie współtransfekowane z plazmidami niosącymi geny MHV M i E, oba również pod promotorem T7 w komórkach OST-7, które zarażono zrekombinowaną

8 8 PL B1 szczepionką wirusa wyrażającą polimerazę T7. Otrzymane VLP zawierają chimerowe białko MHV/FIPV. W innej postaci wynalazku, dostarczony jest VLP sposobami użytymi jak wyżej z ektodomenami białka kolca zakaźnego koronawirusa zapalenia oskrzeli (IBV) lub ektodomeny (lub jej części) białka otoczki z jakiejkolwiek otoczki wirusowej nie należącej do koronawirusów. Przykładowo, oparte na MHV VLP są dostarczone przez wynalazek tak, że przenoszą na swojej powierzchni ektodemenę glikoproteiny gd wirusa choroby Aujeszkyego (pseudorabies virus) (PRV) zamiast ektodomeny kolca MHV lub zewnętrznej (amino-końcowej) domeny (lub jej części) jakiegokolwiek nie błonowego białka typu 1 nie pochodzącego z wirusa. W ten sposób dostarczony jest VLP specyficzny dla komórek kurczaka lub komórek świni lub komórek reaktywnych względem błonowego białka typu 1. W kolejnej postaci wynalazku, replikujące się VLP są wytworzone z modyfikacjami zawartymi w cząsteczkach. Jest to osiągnięte przez włączenie zmodyfikowanych konstruktów któregokolwiek z białek koronawirusa S, M, E i HE. W cząsteczkach koronawirusa białka te mają karboksy-końcową domenę wbudowaną do wewnętrznej otoczki wirusowej. Zatem są tam również zawarte włączone do niej sekwencje obcego białka, które są dodane lub zastępujące karboksy-końcową domenę. W ten sposób dostarczony może być VLP zawierający cząsteczki białka lub jego fragmenty z innego wirusa lub nie wirusowe białka, takie jak hormony, takie jak erytropoetyna. Pozwala to na wytworzenie VLP zawierającego biologicznie aktywne białko lub jego fragment, które jest/są osłonięte przez otoczkę wirusa i mogą być uwolnione i/lub odzyskane później, gdy błona wirusa ulega degradacji lub jest połączona przez fuzję z inną błoną. Pozwala to na wytwarzanie in vitro w komórkach, lub wytwarzanie in vivo w gruczołach wydzielniczych takich jak gruczoły mlekowe, substancji aktywnej biologicznie, która w innym wypadku jest szkodliwa lub toksyczna dla wytwarzających ją komórek lub które z innych powodów powinne być wytworzone w zabezpieczonej postaci. W kolejnej postaci dostarczone są VLP oparte na MHV niosące na swojej powierzchni lub wewnątrz, cząsteczki aktywne enzymatycznie takie jak furyna lub cytokina, lub receptor hormonów, lub inny wirusowy, lub nie wirusowy peptyd o aktywności biologicznej. W tych przykładach, VLP są dostarczane z (dodatkowym) środkiem adresowania służącym kierowaniu VLP do komórek, w innym wypadku, niedostępnych dla oryginalnego koronawirusa. Wynalazek dostarcza otrzymane rekombinacyjnie, replikatywne VLP, które są ponadto modyfikowane w ektodomenie i/lub ektodomenie któregokolwiek z białek wirusa. Przez modyfikację ektodomeny białka kolca, VLP są dostarczone ze zmodyfikowanymi cząsteczkami biologicznymi jako środkiem adresowania służącym kierowaniu VLP do oddziaływania z innymi cząsteczkami biologicznymi będącymi partnerem lub mogącymi oddziaływać z celem takim jak białka receptora na komórkach, być ich receptorami hormonu, specyficznymi immunoglobulinami na komórkach B, MHC i towarzyszącymi MHC cząsteczkami obecnymi na komórkach T i innych komórkach, lub innymi cząsteczkami znanymi osobie biegłej w dziedzinie receptorów powierzchniowych komórki. Środki adresowania mogą być również dostarczone dla oddziaływania ze znanymi miejscami wiązania wybranych enzymów na białkach lub innych cząsteczkach służących jako substrat dla wybranego enzymu. Przygotowanie VLP lub koronawirusów ze zmodyfikowanymi kolcami może być osiągnięte genetycznie przez modyfikowanie genomu wirusa tak, ze wyraża on zmodyfikowane białko S w zarażonych komórkach. Dostarczono tu również preparatu koronawirusów zawierającego zmienione kolce w różny sposób wyrażających zmodyfikowane geny S w komórkach, które są dodatkowo zarażone koronawirusem. Współwłączenie, zmienionego w wyniku mutacji kolca dostarcza wirusowi nowego środka adresowania. Przykładowo, pokazano wytwarzanie cząsteczek MHV zwierających chimerowe białko S z MHV/FIPV. Konstrukt chimerowego genu S jest wyrażony w komórkach L, które są następnie zarażone dzikiego typu szczepem MHV A59 (MHV-A59) lub jego mutantem. Potomstwo wirusa uwalniane przez komórki zawiera zmodyfikowane białko S. Dla pokazania zmienionego adresowania użyto wirus zarażając nim komórki kocie, które normalnie są niewrażliwe na MHV. Komórki są następnie zarażone co pokazano przez immunofluorescencję i wytwarzają normalny MHV. W następnym przykładzie pokazano, że wytwarzanie MHV zawierającego chimerowe białka S, w których część ektodomeny S zastąpiono przez odpowiadającą jej część (tj. prezentowaną na zewnątrz lub aminokońcową domenę) ludzkiej cząsteczki CD4 jako przykładu nie wirusowego białka. Tak zmodyfikowane koronawirusy zachowały zdolność do zarażenia komórek zarażonych HIV i komórek prezentujących glikoproteinę otoczki HIV przez specyficzne rozpoznawanie kompleksu CD4 i gp120 z HIV. W wyniku tego, zarażone komórki HIV podlegają litycznemu zarażeniu co skutecznie ogranicza liczbę komórek zarażonych HIV w ciele i co za tym idzie zmniejsza ostrość przebiegu choroby i ewentualnie powoduje koniec infekcji.

9 PL B1 9 Jako kolejny przykład pokazano wytwarzanie VLP według wynalazku zawierających cząsteczki kolca, w których amino-końcową część zastąpiono jednołańcuchowym fragmentem przeciwciała rozpoznającym białko powierzchniowe komórki, które jest prezentowane na komórkach, które normalnie mogą nie być zarażone koronawirusem stanowiącym podstawę dla wspomnianego VLP. Zmodyfikowany wirus jest zdolny do zarażenia tych, w innym wypadku odpornych, komórek. Przykład ilustruje zasadę, że w ten sposób, tj. przez wbudowanie bardzo specyficznej informacji o adresowaniu do kloca wirusa, koronawirus może być skierowany do wybranych komórek lub tkanek. Jednoniciowy fragment przeciwciała może przykładowo być wybrany systemami prezentacji faga lub w innych systemach selekcji klonalnej jednołańcuchowych fragmentów przeciwciała znanych nauce. Kolejny aspekt tego wynalazku dotyczy zastosowania wspomnianych, zdolnych do replikacji VLP lub koronawirusów jako nośników dostarczających gen. Można to osiągnąć różnymi sposobami. Jednym sposobem jest włączenie obcych genów lub sekwencji do genomu wirusa tak, że po wprowadzeniu wirusa do komórek geny te ulegają ekspresji lub wbudowane sekwencje stają się aktywne biologicznie w inny sposób (jak w przypadku rybozymów lub anty-sensownego RNA wytworzonego przez wirusy w komórkach). Inny sposób wykorzystuje VLP do pakowania obcego RNA do cząsteczek przez użycie sygnału(ów) koronawirusowych dla pakowania wirusa. Wbudowanie obcych sekwencji do genomu koronawirusa może być osiągnięte przez manipulacje genetyczną przy pomocy infektywnego klonu (c-)dna, pełnej wielkości kopii DNA genomu wirusa. Może to osiągnąć również przez rekombinację RNA, w którym to przypadku, RNA stanowiący część genomu wirusa i zawierający obce sekwencje, jest wprowadzona do zarażonych komórek pozwalając obcym sekwencjom na ich wbudowanie przez rekombinację homologiczną. Ponieważ koronawirusy będą zazwyczaj zabijały zarażone nimi komórki, jest ważnym dla większości celów aby je attenuować tak, żeby nie zabijały komórek, z którymi oddziałują. Attenuacja jest osiągnięta tu przez zmianę genomu wirusa przez delecję lub rearanżację. W wynalazku attenuację przykładowo wykonuje się przez przygotowanie zmutowanej postaci MHV, z której istotny gen został usunięty przez rekombinację. Dostarczona jest mysia linia komórkowa, w której gen E z MHV został wbudowany do chromosomu, pozwalając białku E na jego wytwarzanie przez ekspresję genu. MHV pozbawiony genu E został wytworzony w normalnych komórkach mysich przez rekombinowanie przy pomocy syntetycznego RNA zawierającego doskonałą kopię 3'-końca genomu MHV z wyjątkiem braku niezmienionego genu E. Wirus defektywny pod względem E jest zdolny do wzrostu jedynie w komórkach uzupełniających tą wadę. Wytwarzany wirus jest attenuowany tak, że może zarażać inne mysie komórki, lecz nie produktywnie: utrata białka E zapobiega składaniu potomstwa. Jako przykład zasad wbudowywania obcych genetycznie sekwencji do attenuowanego lub nie attenuowanego VLP lub koronawirusów i jego ekspresja jest w dalszej kolejności zapewniona przez wynalazek. VLP pochodzący od MHV jest dostarczony w taki sposób by gen reporterowy taki jak LacZ lub zielonego białka fluorescencyjnego został zrekombinowany tak, że jest do niego wbudowany chimerowy gen MHV/FIPV S. Ekspresja genów jest uwidoczniona przez niebieskie lub zielone zabarwienie fluorescencyjne komórek zarażonych VLP i przez nabyte zdolności do zarażenia komórek kocich. Inny sposób uzyskania transportujących nośników opartych na koronawirusie wykorzystują YLP zawierające obce sekwencje RNA. Włączenie obcych sekwencji RNA do tych cząsteczek wymaga ich zapakowania do nukleokapsydów. Wirusowe RNA zapakowane przez cząsteczki białka nukleokapsydu (N) zachodzi przez rozpoznanie specyficznych sekwencji, sygnału(ów) pakowania przez białko N. W MHV sygnał pakowania obejmuje obszar 69 nukleotydów długości genu 1b. Obcy (nie pochodzący od koronawirusa) RNA zwierający sekwencję(e) pakujące koronawirusa lub defektywne genomy koronawirusa, w których ten sygnał(y) zostały zachowane, lecz do których obce sekwencje zostały wbudowane, są składane w VLP i wprowadzone do komórek wyrażających geny N, M i E (±S). VLP może wprowadzić do docelowej komórki określony RNA, który może posiadać jedną z szeregu funkcji. Przykładem dostarczony przez wynalazek jest RNA działający jak mrna i określający szczególne białka takie jak toksyna lub czynnik indukujący apoptozę lub fragment przeciwciała. Kolejnym przykładem jest anty-sensowny RNA lub RNA o aktywności rybozymu. Dla większości celów kluczowym jest uzyskanie wielu kopii RNA w każdej komórce, dla uzyskania pożądanego efektu. Może to nie być łatwe w przypadku VLP, które będą przenosiły jeden lub kilka pseudo-nc. Tym samym wynalazek dostarcza RNA z sygnałami dla amplifikacji tak, że mogą być one namnażane w docelowej komórce. Dla osiągnięcia tego celu użyte są sekwencje odpowiedzialne za replikację z wirusa Semliki Forest (SFV) stanowiąc podstawę konstruktu RNA. Pochodzący z SFV mrna zawiera ponadto sekwencję odpowiedzialną za zamkniecie w kapsydzie z koronawirusa i wytwarzający specyficzne białko reporte-

10 10 PL B1 rowe złożony w VLP. Amplifikacją prowadzona przez SFV pozwala na syntezę w komórce białka reporterowego; u zwierząt pojawienie się przeciwciał przeciwko białku reporterowemu testowanemu świadczy o skutecznym dostarczenia zawartości VLP. Wynalazek dostarcza również VLP, który jest nośnikiem dostarczającym antygen lub epitop pomyślanym dla wywołania specyficznej odpowiedzi immunologicznej, komórkowej i/lub humoralnej, ogólnej i/lub miejscowej obejmujących wywoływanie i wytworzenie specyficznych przeciwciał przeciw białkom dla uzyskania ochrony przed zarażeniem przez patogeny o wirusowym i nie wirusowym pochodzeniu. Przykładowo, wynalazek opisuje indukcję przeciwciał przeciwko białku reporterowemu pochodzącemu z mrna SFV, które zawiera ponadto sekwencje koronawirusa odpowiedzialne za zamknięcie w kapsydzie i określa repertuar białka opisanego powyżej. Jako kolejny przykład przedstawia się indukcję przeciwciał u myszy przeciwko kolcom FIPV i przeciw gd PRV przez immunizację VLP opisaną również powyżej. Co za tym idzie, odpowiedzi immunologiczne mogą być wywołane zarówno przeciw białkom, które mogą być kodowane przez zmieniony genom VLP i/lub przeciw białkom, które zostały wbudowane jako środki adresowania do VLP, przez co, częściowo lub w całości zastępują oryginalne białko kolca. Przykłady ilustrujące możliwość zastosowania podejścia dla indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciw białkom tak zróżnicowanym jak przykładowo pochodzące od wirusów, bakterii, pasożyta, komórki i hormonalnych. Wynalazek ponadto dostarcza VLP, które w pełni zachowały oryginalne białko kolca, lecz które zostały zmienione genomicznie dla attenuowania VLP i/lub dla kodowania sekwencji nukleotydowej, która powinna być dostarczona do komórek, do których adresowany był oryginalny koronawirus. Przykładowo, w ten sposób komórki nabłonka jelita lub komórki nabłonka oddechowego, które normalnie są zarażane odpowiednio TGEV lub PRCV mogą obecnie oddziaływać z VLP pochodzącymi z TGEV lub PRCV lub innymi komórkami specyficznymi dla koronawirusów, jeśli jest taka potrzeba, dla ekspresji białek normalnie nie wyrażanych przez wspomniane wirusy. W ten sposób, komórki nabłonka oddechowego pacjentów z mukowiscydozą mogą być indukowane przez ekspresję cząsteczek powierzchniowych kodowanych przez zmieniony genom VLP. Dla dalszego zademonstrowania wynalazku dostarczone są różne przykłady w szczegółowym opisie, które nie ograniczają wynalazku. Fig. 1: A. Część górna przedstawia zasady technologii rekombinowania RNA. Komórki kota są zarażone fmhv (pochodna MHV niosąca chimerowe białko S z okta-domeną z białka FIPV S pozwalającego wirusowi na wzrost na komórkach kota) i stransfekowane syntetycznym donorowym RNA niosącym, m.in. niezmieniony gen MHV S. Odpowiednie rekombinowanie RNA prowadzi do wirusów, które odzyskały zdolność do wzrostu na mysich komórkach przez dostarczenie niezmienionego kolca. Dolna część przedstawia po lewej schematyczne przedstawienie odpowiednich części plazmidu, z których wytworzono RNA dawcy. Po prawej przedstawiono organizację genomowego DNA zrekombinowanych wirusów wytworzonych z tym donorowym RNA. B. Sekwencje nukleotydowe przedstawiają nowe połączenia utworzone w konstruktach plazmidowych (i otrzymanych wirusach), pozycje i numery których podano w części A (lewa strona). Fig. 2: Analiza RT-PCR zrekombinowanych wirusów z delecjami genetycznymi. RNA wyizolowano ze sklonowango wirusa, cdna przygotowano przez RT przy pomocy odpowiednich starterów (1092 i 1127) i PCR przeprowadzono przy pomocy starterów lub starterów dla analizy rejonów genów 4a/b/5a lub genów 2a+HE, odpowiednio. Zakres analiz przedstawiono po prawej stronie, wyniki analizy w żelu agarozowym produktów PCR przedstawiono po stronie lewej. Zbadane wirusy przedstawiono powyżej na żelu. Na ścieżce po prawej stronie rozdzielono znacznik DNA. Fig. 3: Wirusowy RNA zsyntetyzowany w zarażonych komórkach przez różne mutanty delecyjne MHV zbadano przez ekstrakcje całkowitego cytoplazmatycznego RNA wyznakowanego metabolicznie [ 33 P]ortofosforan w obecności aktynomycyny D, a następnie elektroforezę w 1% żelu agarozowym. Genetyczne przysposobienie wirusów z delecją przedstawiono na górze podczas gdy subgenomowe rodzaje RNA oznaczono po prawej stronie również zgodnie z ich kompozycją genetyczną. Fig. 4: Jednoetapowe krzywe wzrostu zrekombinowanych wirusów z delecją. Po zarażeniu wysokim mianem wirusa (m.o.i.) komórek LR7 wirusami z delecją i MHV-WT z każdej pożywki hodowlanej pobrano próbki MHV-WT po różnym czasie i przez miareczkowanie zbadano infektywność tych próbek.

11 PL B1 11 Fig. 5: Tak jak na Fig. 1 przedstawiono konstrukcję wirusów z przebudowaną kolejnością genów. Po lewej, odpowiednie części konstruktów plazmidowych: organizacja genomu ich sekwencji cdna dla MHV i oznaczenia plazmidów. Po prawej, odpowiednie wirusy z ich strukturą genomu i ich nazwami. Fig. 6: Jednoetapowa krzywa wzrostu dla zrekombinowanych wirusów z przebudowanym genomem. Po zarażeniu przy wysokim m.o.i. komórek LR7 wirusami MHV-Ä2aHE (DELTA2aHE), MHV-1bMS, MHV-MSmN lub MTV-WT próbki pobrano z każdej pożywki hodowlanej po różnym czasie i przez miareczkowanie zbadano infektywność tych próbek. Fig. 7: A. Jak na Fig. 1 przedstawiono stężenie wirusów ze wstawionym obcym genem. Po lewej stronie, różne konstrukty plazmidowe (wektor) przedstawiono wraz z ich nazwami. Po prawej, genetyczny make-up otrzymanych z tych plazmidów przez rekombinowanie RNA w komórkach kota jak przedstawiono razem wraz z ich nazwami. Poniżej: sekwencje startera (i liczby) użyto dla wprowadzenia sekwencji wewnątrzgenowego promotora (IGS) przed genem renilla (RL) i genem dla lucyferazy świetlika (FL). B. Analiza RT-PCR zrekombinowanych wirusów niosących gen RL. cdna przygotowano przy pomocy startera 1412 przez RT na wirusowym RNA; dla każdego wirusa zbadano równolegle dwie niezależne jego pochodne (oznaczone kolejno A1A i B1A; A2 i B1; A7A i B2D). Następnie przeprowadzono PCR na uzyskanym cdna jak również na plazmidach użytych dla wytworzenia wirusów (patrz Fig. 7A) przy pomocy pary starterów wskazanych poniżej na Fig.. Dla każdego zestawu uwzględniono również próbkę kontroli negatywnej (H 2 O). Analizę w żelu agarozowym fragmentów pcr przeprowadzono wraz ze znacznikami DNA (otaczające linie) co przedstawiono i wielkość produktów podano po prawej stronie. Fig. 8: Jednoetapowe krzywe wzrostu zrekombinowanych wirusów niosących obce geny. Po zarażeniu wysokim m.o.i. komórek LR7 wirusami próbki pobrano z każdej pożywki hodowlanej po różnym czasie i infektywność tych próbek zbadano przez miareczkowanie. A. krzywe wzrostu różnych wirusów posiadających gen lucyferazy renilla jak to porównano z MHV-WT. B. Wzrost trzech niezależnie uzyskanych klonów wirusa MHV-EFLM niosącego gen lucyferazy świetlika przedstawiono w porównaniu z MHC-WT. Fig. 9: Ekspresja lucyferazy przez zrekombinowane wirusy. Komórki RL7 zarażono wirusem wyrażającym renilla (A) lub świetlikową (B) lucyferazę z MHV-WT i wytworzoną w komórkach aktywność lucyferazy śledzono przez cały czas. W B dwa niezależnie uzyskane klony wirusa MHV-EFLM (patrz Fig. 8B) porównano z MHV-WT. Fig. 10: Stabilność wirusów niosących obce geny. Zrekombinowane wirusy MHV-ERLM i MHV-EFLM (dwa niezależnie otrzymane klony w każdym przypadku) przesiano ośmiokrotnie przez komórki RL7 przy niskim m.o.i.. Po każdym przesianiu określono infektywność wirusa (TCID50) w zebranej pożywce hodowlanej. Tak zebranymi wirusami zaszczepiono równolegle komórki RL7 przy m.o.i.5 i oznaczono ilościowo ekspresję lucyferazy w komórkach po 8 godz. po zarażeniu. Wyniki odłożono jako funkcje liczby pasaży. Fig. 11: Hamowanie infekcji MHV przez peptyd HR2. Komórki LR2 zarażono wirusem MHV-EFLM w obecności różnych stężeń peptydu HR2 lub jako kontrolę, peptyd odpowiada aminokwasom wirusowego białka S. Po godzinie inkubacji komórki wypłukano i dalej zaszczepiono przy braku peptydu. Szacunek powodzenia zarażenia komórek badano po 4 godz. po zarażeniu dla ekspresji lucyferazy. Na Fig. aktywność lucyferazy jest odłożona względem różnych, użytych stężeń peptydu. Fig. 12: Hamowanie fuzji komórka-komórka przez peptyd HR2. Po zaszczepieniu równoległych hodowli komórek RL7, komórki MHV-A59 zalano pożywką z agarem zawierającą różne stężenia peptydu HR2 i następnego dnia policzono łysinki.