(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 14/605 ( ) A61K 38/26 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/40 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Analogi glukagonu (30) Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/40 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/03 (73) Uprawniony z patentu: Zealand Pharma A/S, Glostrup, DK (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 EDDI MEIER, Værløse, DK DITTE RIBER, Frederiksberg, DK MARIE SKOVGAARD, København, DK BJARNE DUE LARSEN, Roskilde, DK JENS ROSENGREN DAUGAARD, Virum, DK TRINE SKOVLUND RYGE NEERUP, Frederikssund, DK (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 18451/13/P-RO/MW EP Opis DZIEDZINA WYNALAZKU Analogi glukagonu [0001] Wynalazek dotyczy analogów glukagonu i ich zastosowania medycznego, na przykład w leczeniu nadmiernego spożywania pokarmu, otyłości i nadmiaru masy. TŁO WYNALAZKU [0002] Preproglukagon jest polipeptydem prekursora 158 aminokwasów, który jest różnie przetwarzany w tkankach, tworząc pewną liczbę strukturalnie pochodnych peptydów pochodzących od proglukagonu, włączając glukagon (Glu), glukagonopodobny peptyd-1 (GLP-1), glukagonopodobny peptyd-2 (GLP-2) i oksyntomodulinę (OXM). Cząsteczki te biorą udział w wielu różnych czynnościach fizjologicznych, włączając homeostazę glukozy, wydzielanie insuliny, opróżnianie żołądka i wzrost jelit, a także regulację przyjmowania pokarmu. [0003] Glukagon jest peptydem 29 aminokwasów, który odpowiada aminokwasom od 53 do 81 pre-proglukagonu i ma sekwencję His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys- Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1). Oksyntomodulina (OXM) jest peptydem 37 aminokwasów, który obejmuje kompletną sekwencję 29 aminokwasów glukagonu z oktapeptydowym karboksyterminalnym przedłużeniem (aminokwasy od 82 do 89 pre-proglukagonu, mającym sekwencję Lys- Arg- Asn- Arg- Asn- Asn- Ile- Ala (SEQ ID NO: 2) i określanym peptydem wtrąconym 1 lub IP-1; pełną sekwencją ludzkiej oksyntomoduliny jest tym samym His- Ser- Gln- Gly- Thr- Phe- Thr- Ser- Asp- Tyr- Ser- Lys- Tyr- Leu- Asp- Ser- Arg- Arg- Ala- Gln- Asp- Phe- Val- Gln- Trp- Leu- Met- Asn- Thr- Lys- Arg- Asn- Arg- Asn- Asn- Ile- Ala) (SEQ ID NO: 3). Główny biologicznie aktywny fragment GLP-1 wytwarzany jest jako 30-aminokwas, peptyd amidowany na C-końcu, który odpowiada aminokwasom od 98 do 127 pre-proglukagonu. [0004] Glukagon pomaga utrzymać poziom glukozy we krwi poprzez wiązanie receptorów glukagonu na hepatocytach, powodując uwalniania glukozy z wątroby - przechowywanej w postaci glikogenu - poprzez glikogenolizę. Gdy zasoby te się wyczerpują, glukagon pobudza wątrobę do syntezy dodatkowej glukozy przez glukoneogenezę. Glukoza ta uwalniana jest do krwiobiegu, zapobiegając rozwojowi hipoglikemii. [0005] OXM jest uwalniana do krwi w odpowiedzi na spożywanie pokarmu i proporcjonalnie do wartości kalorycznej posiłku. Wykazano, że OXM tłumi głód i hamuje spożywanie pokarmu u ludzi (Cohen et al, Journal of Endocrinology and Metabolism, 88, , 2003; WO 2003/022304). Oprócz tych działań anorektycznych, które są podobne do działań GLP-1, OXM musi również wpływać na masę ciała za pomocą innego mechanizmu, ponieważ szczury leczone oksyntomoduliną wykazują mniejszy przyrost masy ciała niż szczury karmione parami (Bloom, Endocrinology 2004, 145, 2687). Leczenie otyłych gryzoni przy pomocy OXM poprawia również ich tolerancję glukozy (Parlevliet et al, Am J Physiol Endocrinol Metab, 294, E142-7, 2008) i hamuje przyrost masy ciała (WO 2003/022304).

3 2 [0006] OXM aktywuje zarówno receptor glukagonu, jak i receptor GLP-1 z dwa razy większą potencją dla receptora glukagonu niż dla receptora GLP-1, ale jest słabszy niż natywny glukagon i GLP-1 na swoich kolejnych receptorach. Glukagon jest również zdolny do aktywacji obu receptorów, przy dużej preferencji dla receptora glukagonu w porównaniu z receptorem GLP-1. GLP-1 z drugiej strony nie jest zdolny do aktywacji receptora glukagonu. Mechanizm aktywacji oksyntomoduliny nie jest dobrze poznany. W szczególności nie wiadomo, czy działania hormonu zachodzą wyłącznie za pośrednictwem receptora glukagonu i receptora GLP-1 czy poprzez jeden lub więcej niezidentyfikowanych jeszcze receptorów. [0007] Wykazano, że inne peptydy wiążą i aktywują zarówno glukagon, jak i receptor GLP-1 (Hjort et al, Journal of Biological Chemistry, 269, ) oraz hamują przyrost masy ciała, i zmniejszają spożycie pokarmu (WO 2006/134340; WO 2007/100535; WO 2008/101017). [0008] Otyłość klasyfikuje się jako rosnący problem zdrowotny na całym świecie i związana jest z różnymi chorobami, w szczególności z chorobami układu krążenia (CVD), cukrzycą typu 2, obturacyjnym bezdechem sennym, niektórymi rodzajami raka i chorobą zwyrodnieniową stawów. W rezultacie wykazano, że otyłość skraca długość życia. Według prognoz Światowej Organizacji Zdrowia z 2005 roku na całym świecie żyje 400 milionów dorosłych osób (wiek > 15) sklasyfikowanych jako otyłe. Uważa się, że w USA otyłość jest drugą, po paleniu, wiodącą przyczyną śmierci, której można zapobiec. [0009] Wzrost otyłości prowadzi do wzrostu cukrzycy, przy czym w przybliżeniu 90% ludzi z cukrzycą typu 2 można zaklasyfikować do otyłych. Na całym świecie żyje 246 milionów ludzi z cukrzycą i szacuje się, że w milionów ludzi będzie miało cukrzycę. Wielu ma dodatkowe czynniki ryzyka dla układu krążenia, w tym wysokie/nieprawidłowe LDL i triglicerydy, oraz niskie HDL. [0010] Ludzie z cukrzycą są od 2 do 4 razy bardziej narażeni na rozwój chorób układu krążenia niż ludzie bez cukrzycy, co sprawia, że jest to najpowszechniejsze powikłanie cukrzycy. Choroby układu krążenia stanowią około 50% poziomu śmiertelności u chorych na cukrzycę. Młodzi dorośli z cukrzycą są razy bardziej zagrożeni chorobą wieńcową (CHD) niż młodzi dorośli bez cukrzycy, a wraz z wysoką zachorowalnością i występowaniem otyłości i cukrzycy typu 2 zachorowalność i umieralność związana z tymi zaburzeniami metabolicznymi uwypukla zapotrzebowanie medyczne na skuteczne opcje leczenia. [0011] Odpowiednio istnieje duże zapotrzebowanie medyczne na leczenie otyłości i poprawę tolerancji glukozy. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0012] Wynalazek zapewnia związek o wzorze R 1 -X-Z-R 2, przy czym R 1 oznacza H, C 1-4 alkil, acetyl, formyl, benzoil lub trifluoroacetyl; R 2 oznacza OH lub NH 2 ;

4 3 X oznacza peptyd o wzorze I: lub różni się od wzoru I w co najwyżej 4 z następujących pozycji, przy czym jeżeli jest inny niż wzór I: resztę w pozycji 2 dobiera się spośród: Aib, D-Ser; resztę w pozycji 16 dobiera się spośród: Arg, His, Lys, Glu, Gly, Asp; resztę w pozycji 17 dobiera się spośród: Lys, Leu; resztę w pozycji 18 dobiera się spośród: Lys, His, Ala, Ser, Tyr; resztę w pozycji 20 dobiera się spośród: Gln, His, Arg, Glu, Asp; resztą w pozycji 21 jest: Glu; resztę w pozycji 23 dobiera się spośród: Val, Leu; resztę w pozycji 24 dobiera się spośród: Gln, Leu, Ala, Lys, Arg, Asp; resztę w pozycji 27 dobiera się spośród: Met, Cys, Lys, Arg, Leu; resztę w pozycji 28 dobiera się spośród: Asn, Arg, Lys, Glu, Ala, Leu, Asp; a resztę w pozycji 29 dobiera się spośród: Thr, Glu, Lys; a Z jest nieobecne lub jest sekwencją peptydu 1-20 jednostek aminokwasów dobranych spośród grupy składającej się z Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr i Orn; lub jego farmaceutycznie dopuszczalną solą. [0013] W pewnych przykładach wykonania X różni się od wzoru I w co najwyżej 4 z następujących pozycji, przy czym jeżeli jest inny niż wzór I: resztę w pozycji 2 dobiera się spośród: Aib, D-Ser; resztę w pozycji 16 dobiera się spośród: Arg, His, Lys, Glu, Gly; resztę w pozycji 17 dobiera się spośród: Lys, Leu; resztę w pozycji 18 dobiera się spośród: Lys, His, Ala, Ser, Tyr; resztę w pozycji 23 dobiera się spośród: Val, Leu; resztę w pozycji 27 dobiera się spośród: Met, Cys, Lys, Arg, Leu; resztę w pozycji 28 dobiera się spośród: Asn, Arg, Lys, Glu, Ala, Leu; a resztę w pozycji 29 dobiera się spośród: Thr, Glu, Lys; [0014] W pewnych przykładach wykonania X różni się od wzoru I w co najwyżej 4 z następujących pozycji, przy czym jeżeli jest inny niż wzór I: resztę w pozycji 2 dobiera się spośród: Aib, D-Ser;

5 4 resztę w pozycji 16 dobiera się spośród: Arg, His, Lys, Glu, Gly; resztę w pozycji 17 dobiera się spośród: Lys, Leu; resztę w pozycji 18 dobiera się spośród: Lys, His, Ala, Ser, Tyr; a resztę w pozycji 23 dobiera się spośród: Val, Leu. [0015] W pewnych przykładach wykonania X różni się od wzoru I w co najwyżej 4 z następujących pozycji, przy czym jeżeli jest inny niż wzór I: resztę w pozycji 2 dobiera się spośród: Aib, D-Ser; resztę w pozycji 23 dobiera się spośród: Val, Leu; resztę w pozycji 27 dobiera się spośród: Met, Cys, Lys, Arg, Leu; resztę w pozycji 28 dobiera się spośród: Asn, Arg, Lys, Glu, Ala, Leu; a resztę w pozycji 29 dobiera się spośród: Thr, Glu, Lys. [0016] Zachowując zgodność z powyższymi definicjami, może być korzystne, aby X zawierało jeden lub więcej z następujących zestawów reszt: 20-Lys, 24-Glu; 20-Lys, 24-Glu, 29-Ala; 20-Lys, 23-Ile, 24-Glu; 27-Glu, 28-Ser, 29-Ala; 29-Ala; 20-Gln; 23-Val; 24-Gln; 29-Thr; 27-Met, 28-Asn, 29-Thr; 20-Gln, 23-Val, 24-Gln; 20-Glu, 24-Lys; lub 28-Arg [0017] Na przykład X może mieć sekwencję: HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFIEWLESA (SEQ ID NO: 5); HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFVEWLESA (SEQ ID NO: 6); HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIQWLESA (SEQ ID NO: 7); HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLEST (SEQ ID NO: 8);

6 5 HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLMNT (SEQ ID NO: 9); HSQGTFTSDYSLYLDSRRAQDFVQWLESA (SEQ ID NO: 10); HSQGTFTSDYSLYLDSRRAEDFIKWLESA (SEQ ID NO: 11); lub HSQGTFTSDYSLYLDSRRAKDFIEWLERA (SEQ ID NO: 12). [0018] Wynalazek zapewnia ponadto kwas nukleinowy (którym może być DNA lub RNA) kodujący związek według wynalazku, wektor ekspresyjny zawierający taki kwas nukleinowy i komórkę gospodarza zawierającą taki kwas nukleinowy lub wektor ekspresyjny. [0019] W kolejnym aspekcie wynalazek zapewnia glukagonowy peptyd analogowy, jak tu zdefiniowano, lub sól lub jej pochodną, kwas nukleinowy kodujący taki glukagonowy peptyd analogowy, wektor ekspresyjny zawierający taki kwas nukleinowy lub komórkę gospodarza zawierającą taki kwas nukleinowy lub wektor ekspresyjny w mieszaninie z nośnikiem. W korzystnych przykładach wykonania kompozycja jest farmaceutycznie dopuszczalną kompozycją, a nośnik jest farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Analog peptydu glukagonowego może być farmaceutycznie dopuszczalną solą addycyjną z kwasem analogu glukagonowego. [0020] Opisane związki znajdują zastosowanie w zapobieganiu przyrostu masy lub promowaniu utraty masy. Poprzez zapobieganie należy rozumieć hamowanie lub zmniejszenie masy ciała w porównaniu z brakiem leczenia i niekoniecznie ma oznaczać całkowite zaprzestanie przyrostu masy. Peptydy mogą powodować obniżenie spożycia pokarmu i/lub zwiększone zużycie energii, powodując widoczny wpływ na masę ciała. Niezależnie od wpływu na masę ciała związki według wynalazku mogą mieć korzystny wpływ na tolerancję glukozy i poziomy obiegowego cholesterolu, będąc w stanie obniżyć poziomy obiegowego LDL i zwiększając współczynnik HDL/LDL. Tym samym związki według wynalazku można stosować w bezpośrednim lub pośrednim leczeniu dowolnego stanu spowodowanego lub charakteryzującego się nadmierną masą ciała, takim jak leczenie i/lub zapobieganie otyłości, chorobliwej otyłości, stanu zapalnego związanego z otyłością, choroby pęcherzyka żółciowego związanej z otyłością, bezdechu sennego wywołanego przez otyłość. Można je również stosować w leczeniu syndromu metabolicznego, oporności na insulinę, nietolerancji glukozy, cukrzycy typu 2, nadciśnienia, dyslipidemii aterogennej, miażdżycy tętnic, stwardnienia tętnic, choroby wieńcowej lub udaru. Ich działania w tych stanach mogą wynikać lub być powiązane z ich wpływem na masę ciała lub mogą być od niej niezależne. [0021] Tym samym wynalazek przewiduje zastosowanie związku według wynalazku w leczeniu stanu, jaki opisano powyżej, u osoby, która tego potrzebuje. [0022] Wynalazek zapewnia również związek według wynalazku do zastosowania w sposobie leczenia medycznego, w szczególności do zastosowania w sposobie leczenia stanu, jaki opisano powyżej. [0023] Wynalazek przewiduje również zastosowanie związku według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia stanu, jaki opisano powyżej.

7 6 [0024] Jak już opisano, wynalazek obejmuje wektory ekspresyjne zawierające opisaną wyżej sekwencję kwasu nukleinowego, opcjonalnie w połączeniu z sekwencjami do kierowania jego ekspresją i komórki gospodarza zawierające wektory ekspresyjne. Korzystnie komórki gospodarza są zdolne do ekspresji i wydzielania związku według wynalazku. W kolejnym aspekcie wynalazek zapewnia sposób wytwarzania związku, przy czym sposób obejmuje hodowanie komórek gospodarza w warunkach odpowiednich dla ekspresji związku i oczyszczania tak wytworzonego związku. [0025] Wynalazek zapewnia ponadto kwas nukleinowy według wynalazku i wektor ekspresyjny według wynalazku, lub komórkę gospodarza zdolną do ekspresji i wydzielania związku według wynalazku, do zastosowania w sposobie leczenia medycznego. Należy rozumieć, że kwas nukleinowy, wektor ekspresyjny i komórki gospodarza można stosować w leczeniu dowolnych opisanych zaburzeń, które można leczyć przy pomocy samych związków. Dlatego też odniesienia do kompozycji terapeutycznej zawierającej związek według wynalazku, podawania związku według wynalazku lub dowolnego jego zastosowania terapeutycznego należy interpretować tak, aby obejmowały równoważne zastosowanie kwasu nukleinowego, wektora ekspresyjnego lub komórki gospodarza według wynalazku, chyba że z kontekstu wynika inaczej. OPIS FIGUR [0026] Figura 1. Wpływ ZP2653 (SEQ ID NO: 4) na tolerancję doustnej glukozy u myszy db/db. Myszy db/db utrzymywano na czczo przez noc i pobrano wstępną próbkę krwi (poziom glukozy we krwi na czczo) tuż przed podaniem (dootrzewnie) nośników lub ZP2653 (SEQ ID NO: 4) (45 nmol/l). Piętnaście minut później podano doustnie dawkę glukozy (1 g/kg w 5 ml/kg) i zmierzono poziomy glukozy we krwi (BG) przy t=30 min, t=60 min, t=120 min i t=240 min. Obliczono różnicę miedzy wartością wyjściową (t=0) dla każdego punktu czasowego i określono wartości AUC min. ZP2653 (SEQ ID NO: 4) znacznie poprawiło tolerancję glukozy u myszy chorych na cukrzycę db/db. Figura 2. Wpływ 28 dniowego leczenia przy pomocy ZP2653 (SEQ ID NO: 4) na masę ciała u myszy z otyłością wywołaną dietą (DIO). Samce myszy C57BI/6 poddano wysokotłuszczowej diecie (HFD) i leczono (b.i.d.; podskórnie) przy pomocy 2653 (SEQ ID NO: 4) (500 nmol/kg) (ZP2653 (SEQ ID NO: 4)) lub nośnika. Nieotyłą grupę kontrolną utrzymywaną na regularnej karmie leczono nośnikiem (CHOW) według tego samego schematu leczenia co grupy DIO. Masy ciała rejestrowano codziennie i stosowano do podawania dawek peptydów skorygowanych o masę ciała w ciągu całego badania. ZP2653 (SEQ ID NO: 4) znacznie zmniejszyło przyrost masy ciała w porównaniu z VEH-PBS osiągającym poziom podobny do tego obserwowanego przy podawaniu regularnej karmy.

8 7 Figura 3. Wpływ leczenia dualnym agonistą GluGLP-1 myszy DIO przez 4 tygodnie (b.i.d.) na stężenia cholesterolu LDL. PBS (ph 7,4) był nośnikiem stosowanym dla OXM, eksendyny-4 i ZP2653 (SEQ ID NO: 4). Wpływ OXM (P = 0,002) i ZP2653 (SEQ ID NO: 4) (P = 0,019) był znaczący w porównaniu z nośnikiem. Figura 4. Wpływ leczenia dualnym agonistą GluGLP-1 myszy DIO przez 4 tygodnie (b.i.d.) na współczynniki HDL/LDL. PBS (ph 7,4) był nośnikiem stosowanym dla OXM, eksendyny-4 i ZP2653 (SEQ ID NO: 4). Wpływ OXM (P = 0,004) i ZP2653 (SEQ ID NO: 4) (P = 0,026) był znaczący w porównaniu z nośnikiem. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0027] W całym opisie stosuje się konwencjonalne jednoliterowe i trójliterowe kody dla naturalnie występujących aminokwasów, jak również ogólnie dopuszczalne trójliterowe kody dla innych aminokwasów, takie jak Aib (kwas α-aminoizomasłowy), Orn (ornityna), Dbu (kwas 2,4-diaminomasłowy) i Dpr (kwas 2,3-diaminopropionowy). [0028] Termin natywny glukagon odnosi się do natywnego ludzkiego glukagonu o sekwencji H- His- Ser- Gln- Gly- Thr- Phe- Thr- Ser- Asp- Tyr- Ser- Lys- Tyr- Leu- Asp- Ser- Arg- Arg- Ala- Gln- Asp- Phe- Val- Gln- Trp- Leu- Met- Asn- Thr- OH (SEQ ID NO: 1). [0029] Terminy oksyntomodulina i OXM odnoszą się do natywnej ludzkiej oksyntomoduliny o sekwencji H- His- Ser- Gln- Gly- Thr- Phe- Thr- Ser- Asp- Tyr- Ser- Lys- Tyr- Leu- Asp- Ser- Arg- Arg- Ala- Gln- Asp- Phe- Val- Gln- Trp- Leu- Met- Asn- Thr- Lys- Arg- Asn- Arg- Asn- Asn- Ile- Ala- OH (SEQ ID NO: 3). [0030] Wynalazek zapewnia związki, jakie zdefiniowano powyżej. Dla uniknięcia wątpliwości w zapewnionych definicjach ogólnie należy rozumieć, że sekwencja X różni się od wzoru I jedynie w tych pozycjach, w których dopuszcza się zmienność. Aminokwasy w sekwencji X można uznać za numerowane kolejno od 1 do 29 w konwencjonalnym kierunku od N-końca do C-końca. Odniesienie do pozycji w X należy interpretować odpowiednio, jak odniesienia do pozycji w natywnym ludzkim glukagonie i innych cząsteczkach. [0031] Związki według wynalazku mogą mieć jeden lub więcej mostków wewnątrzcząsteczkowych w sekwencji X peptydu. Każdy taki mostek utworzony jest między łańcuchami bocznymi dwóch reszt aminokwasowych X, które są zwykle oddzielone przez trzy aminokwasy w liniowej sekwencji X (tj. między aminokwasem A a aminokwasem A+4). [0032] Bardziej szczegółowo mostek może być utworzony między łańcuchami bocznymi par reszt 16 i 20, 17 i 21, 20 i 24 lub 24 i 28. Dwa łańcuchy boczne mogą być połączone ze sobą poprzez oddziaływania jonowe lub przez wiązania kowalencyjne. Tym samym te pary reszt mogą zawierać łańcuchy boczne o przeciwnych ładunkach, aby tworzyć mostek elektrolityczny poprzez oddziaływania jonowe. Na przykład jedną z reszt może być Glu lub Asp, podczas gdy drugą może być Lys lub Arg. Pary Lys i Glu oraz Lys i Asp również mogą być zdolne do przereagowania, tworząc pierścień laktamowy. Podobnie Tyr i Glu lub Tyr i Asp są zdolne do utworzenia pierścienia laktamowego.

9 8 [0033] W szczególności reszty w pozycjach 20 i 24 mogą być zdolne do utworzenia mostka wewnątrzcząsteczkowego. Przykłady odpowiednich par reszt w tych pozycjach obejmują: 20-Asp, 24-Lys; 20-Glu, 24-Lys; 20-Asp, 24-Arg; 20-Glu, 24-Arg; 20-Lys, 24-Asp; 20-Arg, 24-Asp; 20-Lys, 24-Glu; i 20-Arg, 24-Glu. [0034] Nie wiążąc się żadną szczególną teorią, uważa się, że takie mostki wewnątrzcząsteczkowe stabilizują strukturę helisy alfa cząsteczki, a tym samym zwiększają potencję i/lub selektywność na receptorze GLP-1 i ewentualnie również na receptorze glukagonu. [0035] Obecność Leu w pozycji 12 zwiększa potencję i/lub selektywność na receptorze GLP- 1. [0036] Podstawienie w pozycji 23 (tj. przez Ile) może zwiększyć potencję i/lub selektywność na receptorze GLP-1. [0037] Podstawienie w pozycji 24 (tj. przez Glu) również może zwiększyć potencję i/lub selektywność na receptorze GLP-1. [0038] Nie wiążąc się żadną szczególną teorią, reszty argininy w pozycjach 17 i 18 natywnego glukagonu wydają się zapewniać znaczną selektywność dla receptora glukagonu. Pewna liczba podstawień w jednej lub większej liczbie tych pozycji może zwiększyć potencję i/lub selektywność dla receptora GLP-1. Lys lub Leu w pozycji 17 mogą zwiększyć potencję na receptorze glukagonu. Lys może być szczególnie skuteczny, zwłaszcza gdy w pozycji 21 znajduje się reszta (np. Asp) o ujemnym ładunku, z powodu potencjału do utworzenia mostka wewnątrzcząsteczkowego. Reszta hydrofobowa (np. Ala) w pozycji 18 może zwiększyć potencję zarówno na receptorze GLP-1, jak i receptorze glukagonu, chociaż inne zmiany w tej pozycji (np. Lys, His, Ser lub Tyr) mogą mieć podobne działanie. [0039] Nie wiążąc się żadną szczególną teorią, reszty w pozycjach 27, 28 i 29 natywnego glukagonu wydają się zapewniać znaczną selektywność dla receptora glukagonu. Podstawienia w jednej, dwóch lub wszystkich trzech pozycjach w stosunku do sekwencji natywnego glukagonu mogą zwiększyć potencję i/lub selektywność dla receptora GLP-1, potencjalnie bez znacznego zmniejszenia potencji na receptorze glukagonu. Szczególne przykłady obejmują Glu w pozycji 27, Ser w pozycji 28 i Ala w pozycji 29.

10 9 [0040] Podstawienie reszty naturalnie występującego Met w pozycji 27 (np. przez Leu, Lys lub Glu) również zmniejsza potencjał utleniania, zwiększając tym samym stabilność chemiczną związków. [0041] Podstawienie reszty naturalnie występującego Asn w pozycji 28 (np. przez Arg, Lys, Glu, Ala, Ser lub Leu) również zmniejsza potencjał deamidacji w kwaśnym roztworze, zwiększając tym samym stabilność chemiczną związków. [0042] Potencję i/lub selektywność na receptorze GLP-1 również można zwiększyć, wprowadzając reszty, które mogą utworzyć strukturę helisy amfipatycznej, potencjalnie bez znacznej straty potencji na receptorze glukagonu. Można to osiągnąć, wprowadzając naładowane reszty w jedną lub więcej pozycji 16, 20, 24 i 28. Tym samym wszystkie reszty w pozycjach 20 i 24 mogą być naładowane, wszystkie reszty w pozycjach 20, 24 i 28 mogą być naładowane lub wszystkie reszty w pozycjach 16, 20, 24 i 28 mogą być naładowane. Na przykład resztą w pozycji 20 może być Lys, His, Arg lub Glu. Resztą w pozycji 24 może być Glu, Lys lub Arg. Resztą w pozycji 28 może być Arg, Lys lub Glu. Na przykład związki mogą niezależnie mieć Lys lub Glu w obu pozycjach 20 i 24 oraz mogą mieć dodatkowo Ser lub Arg w pozycji 28. [0043] Podstawienie jednej lub obu reszt naturalnie występującego Gln w pozycjach 20 i 24 również zmniejsza potencjał deamidacji w kwaśnym roztworze, zwiększając tym samym stabilność chemiczną związków. [0044] Związek może zawierać sekwencję Z peptydu na C-końcu 1-20 aminokwasów, na przykład aby stabilizować konformację i/lub strukturę drugorzędową glukagonowego peptydu analogowego, i/lub sprawić, że glukagonowy peptyd analogowy będzie bardziej odporny na hydrolizę enzymatyczną, np. jak opisano w WO99/4628. [0045] Gdy występuje, Z oznacza sekwencję peptydu 1-20 reszt aminokwasowych, np. w zakresie 1-15, korzystniej w zakresie 1-10, w szczególności w zakresie 1-7 reszt aminokwasowych, np. 1, 2, 3, 4, 5, 6 lub 7 reszt aminokwasowych, takich jak 6 reszt aminokwasowych. Każda z reszt aminokwasowych w sekwencji Z peptydu może zostać niezależnie wybrana z Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu (kwas 2,4- diaminomasłowy), Dpr (kwas 2,3-diaminopropionowy) i Orn (ornityna). Korzystnie reszty aminokwasowe wybiera się z Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr i Orn, korzystniej można je wybrać wyłącznie z Glu, Lys i Cys. Wyżej wspomniane aminokwasy mogą mieć D- lub L-konfigurację, ale korzystnie mają L-konfigurację. Szczególnie korzystne sekwencje Z są sekwencjami czterech, pięciu, sześciu lub siedmiu kolejnych reszt lizyny (tj. Lys3, Lys4, Lys5, Lys6 lub Lys7), a w szczególności pięciu lub sześciu kolejnych reszt lizyny. Inne przykładowe sekwencje Z przedstawione są w WO 01/ Alternatywnie resztą na C- końcu sekwencji Z może być reszta Cys. Może to wspomagać modyfikację (np. PEGylację) związku. W takich przykładach wykonania sekwencja Z może na przykład mieć tylko jeden aminokwas długości (tj. Z = Cys) lub może mieć dwa, trzy, cztery, pięć, sześć lub nawet więcej aminokwasów długości. Tym samym pozostałe aminokwasy służą jako spacer (ang. spacer) między peptydem X a końcową resztą Cys.

11 10 [0046] Sekwencja Z ma nie więcej niż 25% identyczności sekwencji z odpowiednią sekwencją fragmentu IP-1 ludzkiej OXM (która ma sekwencję Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn- Ile-Ala). [0047] Procentowa (%) identyczność sekwencji aminokwasowej danego peptydu lub sekwencji polipeptydowej względem innej sekwencji polipeptydowej (np. IP-1) obliczana jest jako odsetek reszt aminokwasowych w danej sekwencji peptydowej, które są identyczne z odpowiednimi resztami aminokwasowymi w odpowiedniej sekwencji tego drugiego polipeptydu, gdy oba wyrównane są ze sobą, w razie potrzeby wprowadzając przerwy dla optymalnego wyrównania). Wartości % identyczności można określić za pomocą WU- BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: (1996)). WU-BLAST-2 stosuje kilka parametrów wyszukiwania, z których większość ustawiona jest do wartości domyślnych. Regulowane parametry ustawiane są do następujących wartości: długość nałożenia = 1, część nałożenia = 0,125, wartość progowa słowa (T) = 11. Wartość % identyczności sekwencji aminokwasowej określana jest za pomocą pewnej liczby pasujących identycznych reszt, jak określono przez WU-BLAST-2, podzielonej przez całkowitą liczbę reszt sekwencji referencyjnej (przerwy wprowadzane przez WU-BLAST-2 do sekwencji referencyjnej, aby zmaksymalizować ignorowany wynik wyrównania), pomnożoną przez 100. [0048] Tym samym gdy Z jest optymalnie wyrównane z 8 aminokwasami IP-1, ma ono nie więcej niż dwa aminokwasy, które są identyczne z odpowiednimi aminokwasami IP-1. [0049] Jeden lub więcej łańcuchów bocznych aminokwasów w związku według wynalazku można skoniugować z podstawnikiem lipofilowym. Podstawnik lipofilowy może być kowalencyjnie związany z atomem w łańcuchu bocznym aminokwasu lub alternatywnie może być skoniugowany z łańcuchem bocznym aminokwasu za pomocą spacer a. [0050] Nie wiążąc się żadną szczególną teorią, uważa się, że podstawnik lipofilowy wiąże albuminę w krwiobiegu, osłaniając tym samym związki według wynalazku przed degradacją enzymatyczną, co może zwiększyć okres półtrwania związków. Spacer, gdy występuje, stosowany jest, aby zapewnić odstęp między związkiem a podstawnikiem lipofilowym. [0051] Podstawnik lipofilowy może być przyłączony do łańcucha bocznego aminokwasu lub do spacer a za pośrednictwem estru, estru sulfonylowego, tioestru, amidu lub sulfonoamidu. Odpowiednio należy rozumieć, że korzystnie podstawnik lipofilowy zawiera grupę acylową, grupę sulfonylową, atom N, atom O lub atom S, który tworzy część estru, estru sulfonylowego, tioestru, amidu lub sulfonoamidu. Korzystnie grupa acylowa w podstawniku lipofilowym tworzy część amidu lub estru z łańcuchem bocznym aminokwasu lub spacerem. [0052] Podstawnik lipofilowy może zawierać łańcuch węglowodorowy mający od 4 do 3 atomów C. Korzystnie ma on co najmniej 8 lub 12 atomów C, a korzystnie ma 24 atomy C lub mniej albo 20 atomów C lub mniej. Łańcuch węglowodorowy może być liniowy lub rozgałęziony oraz może być nasycony lub nienasycony. Należy rozumieć, że łańcuch węglowodorowy jest korzystnie podstawiony częścią, która stanowi część przyłączenia do łańcucha bocznego aminokwasu lub spacer a, na przykład grupą acylową, grupą sulfonylową, atomem N, atomem O lub atomem S. Najkorzystniej łańcuch węglowodorowy podstawiony

12 11 jest acylem i odpowiednio łańcuch węglowodorowy może być częścią grupy alkanoilowej, na przykład palmitoilem, kaproil, lauroilem, mirystoilem lub stearoilem. [0053] Odpowiednio podstawnik lipofilowy może mieć wzór przedstawiony poniżej: [0054] A może być na przykład grupą acylową, grupą sulfonylową, NH, N-alkilem, atomem O lub atomem S, korzystnie acylem. n jest liczbą całkowitą od 3 do 29, korzystnie co najmniej 7 lub co najmniej 11 i korzystnie 23 lub mniejszą, korzystniej 19 lub mniejszą. [0055] Łańcuch węglowodorowy może być dodatkowo podstawiony. Na przykład może on być podstawiony co najwyżej trzema podstawnikami dobranymi spośród NH 2, OH i COOH. Jeżeli łańcuch węglowodorowy jest dodatkowo podstawiony, korzystnie jest on dodatkowo podstawiony tylko jednym podstawnikiem. Alternatywnie lub dodatkowo łańcuch węglowodorowy może zawierać cykloalkan lub heterocykloalkan, na przykład taki jak przedstawiono poniżej: [0056] Korzystnie cykloalkan lub heterocykloalkan jest pierścieniem sześcioczłonowym. Najkorzystniej jest on piperydyną. [0057] Alternatywnie podstawnik lipofilowy może opierać się na szkielecie cyklopentanofenantrenu, który może być częściowo lub całkowicie nienasycony lub nasycony. Każdy atom węgla w szkielecie może być podstawiony Me lub OH. Na przykład podstawnikiem lipofilowym może być cholyl, deoksycholyl lub litocholyl. [0058] Jak wspomniano powyżej, podstawnik lipofilowy może być skoniugowany z łańcuchem bocznym aminokwasu za pomocą spacer a. Spacer, gdy występuje, jest przyłączony do podstawnika lipofilowego i do łańcucha bocznego aminokwasu. Spacer może być przyłączony niezależnie do podstawnika lipofilowego i do łańcucha bocznego aminokwasu za pomocą estru, estru sulfonylowego, tioestru, amidu lub sulfonoamidu. Odpowiednio może on zawierać dwie części niezależnie dobrane spośród acylu, sulfonylu, atomu N, atomu O lub atomu S. Spacer może mieć wzór: w którym każde z B i D dobiera się niezależnie spośród acylu, sulfonylu, NH, N-alkilu, atomu O lub atomu S, korzystnie spośród acylu i NH. Korzystnie n jest liczbą całkowitą od 1 do 10, korzystnie od 1 do 5. Spacer może być dodatkowo podstawiony jednym lub większą liczbą

13 12 podstawników dobranych spośród alkilu C 1-6, alkiloaminy C 0-6, alkilohydroksy C 0-6 i alkilokarboksy C 0-6. [0059] Alternatywnie spacer może mieć dwie lub więcej powtarzalnych jednostek o powyższym wzorze. Każde z B, D i n dobierane jest niezależnie dla każdej powtarzalnej jednostki. Przyległe powtarzalne jednostki mogą być kowalencyjnie przyłączone do siebie za pośrednictwem swoich kolejnych części B i D. Na przykład części B i D przyległych powtarzalnych jednostek mogą razem tworzyć ester, ester sulfonylowy, tioester, amid lub sulfonoamid. Wolne jednostki B i D na każdym końcu spacer a są przyłączone do łańcucha bocznego aminokwasu i podstawnika lipofilowego, jak opisano powyżej. [0060] Korzystnie spacer ma pięć lub mniej, cztery lub mniej albo trzy lub mniej powtarzalne jednostki. Najkorzystniej spacer ma dwie powtarzalne jednostki lub pojedynczą jednostkę. [0061] Spacerem (lub jedną, lub większą liczbą powtarzalnych jednostek spacer a, jeżeli ma on powtarzalne jednostki) może być naturalny lub nienaturalny aminokwas. Należy rozumieć, że dla aminokwasów mających funkcjonalizowane łańcuchy boczne, B i/lub D mogą być częścią w łańcuchu bocznym aminokwasu. Spacerem może być naturalnie występujący lub nienaturalny aminokwas. Na przykład spacerem (lub jedną, lub większą liczbą powtarzalnych jednostek spacer a, jeżeli ma on powtarzalne jednostki) może być Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, α-glu, γ-glu, Asp, Ser Thr, Gaba, Aib, ß- Ala, 5-aminopentanoil, 6-aminoheksanoil, 7-aminoheptanoil, 8-aminooktanoil, 9- aminononanoil lub 10-aminodekanoil. [0062] Na przykład spacerem może być pojedynczy aminokwas dobrany spośród γ-glu, Gaba, b-ala i α-gly. [0063] Podstawnik lipofilowy może być skoniugowany z dowolnym łańcuchem bocznym aminokwasu w związkach według wynalazku. Korzystnie łańcuch boczny aminokwasu zawiera grupę karboksylową, hydroksylową, tiolową, amidową lub aminową, aby utworzyć ester, ester sulfonylowy, tioester, amid lub sulfonoamid z spacerem lub podstawnikiem lipofilowym. Na przykład podstawnik lipofilowy może być skoniugowany z Asn, Asp, Glu, Gln, His, Lys, Arg, Ser, Thr, Tyr, Trp, Cys lub Dbu, Dpr lub Orn. Korzystnie podstawnik lipofilowy jest skoniugowany z Lys. Jednakże aminokwas przedstawiony jako Lys w zapewnionych wzorach może zostać zastąpiony przez Dbu, Dpr lub Orn, gdzie dodany jest podstawnik lipofilowy. [0064] Przykładowy podstawnik lipofilowy i spacer przedstawione są we wzorze poniżej:

14 13 [0065] Tutaj Lys ze związku według wynalazku jest kowalencyjnie przyłączony do γ-glu (spacer) za pośrednictwem części amidowej. Palmitoil jest kowalencyjnie przyłączony do spacer a γ-glu za pośrednictwem części amidowej. Alternatywnie lub dodatkowo jeden lub większa liczba łańcuchów bocznych aminokwasu w związku według wynalazku może być skoniugowana z częścią polimerową na przykład dla zwiększenia rozpuszczalności i/lub okresu półtrwania in vivo (np. w surowicy) i/lub biodostępności. Wiadomo również, że taka modyfikacja zmniejsza klirens (np. klirens nerkowy) białek terapeutycznych i peptydów. [0066] Część polimerowa jest korzystnie rozpuszczalna w wodzie (amfifilowa lub hydrofilowa), nietoksyczna i farmaceutycznie obojętna. Odpowiednie części polimerowe obejmują glikol polietylenowy (PEG), homo- i kopolimery PEG, polimer PEG podstawiony monometylem (mpeg) lub polioksyetylenoglicerol (POG). Patrz na przykład Int. J. Hematology 68:1 (1998); Bioconjugate Chem. 6:150 (1995); i Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 9:249 (1992). [0067] Inne odpowiednie części polimerowe obejmują poliaminokwasy, takie jak polilizyna, kwas poliasparaginowy i kwas poliglutaminowy (patrz na przykład Gombotz, et al. (1995), Bioconjugate Chem., vol. 6 : ; Hudecz, et al. (1992), Bioconjugate Chem., vol. 3, 49-57; Tsukada, et al. (1984), J. Natl. Cancer Inst., vol 73, : ; i Pratesi, et al. (1985), Br. J. Cancer, vol. 52: ). [0068] Cześć polimerowa może być prostym łańcuchem lub rozgałęziona. Może ona mieć masę cząsteczkową Da, na przykład Da, Da, Da, lub Da. [0069] Związek może zawierać dwie lub więcej takich części, w którym to przypadku całkowita masa cząsteczkowa wszystkich takich części będzie ogólnie znajdowała się w zakresach podanych powyżej. [0070] Cześć polimerowa może być sprzężona (poprzez wiązanie kowalencyjne) z grupą aminową, karboksylową lub tiolową łańcucha bocznego aminokwasu. Korzystnymi

15 14 przykładami są grupa tiolowa reszt Cys i grupa epsilon aminowa reszt Lys, przy czym można zastosować również grupy karboksylowe reszt Asp i Glu. [0071] Znawca będzie w pełni świadomy odpowiednich technik, które można zastosować dla przeprowadzenia reakcji sprzęgania. Na przykład część PEG mająca grupę metoksylową może zostać sprzężona z grupą tiolową Cys poprzez wiązanie maleimidowe przy pomocy regentów dostępnych w handlu z Nektar Therapeutics AL. Patrz również WO 2008/ i odniesienia przywoływane powyżej dla uzyskania szczegółów odpowiedniej chemii. Synteza peptydów [0072] Związki według wynalazku można wytwarzać za pomocą standardowych sposobów syntezy, rekombinowanych układów ekspresji lub dowolnych innych sposobów ze stanu techniki. Tym samym analogi glukagonu można syntezować za pomocą wielu rozwiązań, włączając na przykład sposób, który obejmuje: (a) syntezowanie peptydu za pomocą metodologii fazy stałej lub fazy ciekłej, stopniowo lub poprzez łączenie i izolowanie fragmentów oraz oczyszczanie produktu końcowego peptydu; (b) ekspresję konstruktu kwasu nukleinowego, który koduje peptyd w komórce gospodarza i odzyskiwanie produktu ekspresji z hodowli komórek gospodarza; lub (c) wykonywanie bezkomórkowej ekspresji in vitro konstruktu kwasu nukleinowego, który koduje peptyd i odzyskiwanie produktu ekspresji; lub jakąkolwiek kombinację sposobów (a), (b) i (c), aby uzyskać fragmenty peptydu, następnie ligację fragmentów, aby uzyskać peptyd i odzyskanie peptydu. [0073] Korzystne jest syntezowanie analogów według wynalazku za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej lub w fazie ciekłej. W tym kontekście odwołanie dotyczy WO 98/11125 i, wśród wielu innych, Fields, GB et al., 2002, Principles and practice of solidphase peptide synthesis. W: Synthetic Peptides (wydanie II) i podanych tu przykładów. [0074] W przypadku rekombinacyjnej ekspresji fragmenty kwasu nukleinowego według wynalazku normalnie wprowadza się w odpowiednie wektory, tworząc wektory genetyczne lub ekspresyjne mające fragmenty kwasu nukleinowego według wynalazku; takie nowe wektory również są częścią wynalazku. Wektory mogą, zależnie od celu i rodzaju zastosowania, mieć postać plazmidów, fagów, kosmidów, minichromosomów lub wirusa, ale również ważnym wektorem jest nagie DNA, które ulega jedynie przejściowej ekspresji w pewnych komórkach. Korzystne wektory genetyczne i ekspresyjne (wektory plazmidowe) według wynalazku są zdolne do autonomicznej replikacji, pozwalając tym samym na wysokie liczby kopii dla ekspresji na wysokim poziomie lub replikacji na wysokim poziomie dla dalszego klonowania. [0075] W ogólnym zarysie wektor ekspresyjny zawiera następujące elementy w kierunku 5' 3' i w operacyjnym połączeniu: promotor do kierowania ekspresji fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku, opcjonalnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję sygnałową peptydu umożliwiającą wydzielanie (do fazy pozakomórkowej lub, w

16 15 [0076] Wektory według wynalazku stosuje się do przekształcania komórek gospodarza, wytwarzając związek według wynalazku. Takimi przekształconymi komórkami, które są również częścią wynalazku, mogą być hodowane komórki lub linie komórkowe stosowane do propagacji fragmentów kwasu nukleinowego i wektorów według wynalazku lub stosowane do rekombinowanej produkcji peptydów według wynalazku. [0077] Korzystnymi przekształconymi komórkami według wynalazku są mikroorganizmy, takie jak bakterie (takie jak gatunek Escherichia (np. E. coli), Bacillus (np. Bacillus subtilis), Salmonella lub Mycobacterium (korzystnie niepatogenne, np. M. bovis BCG), drożdże (takie jak Saccharomyces cerevisiae) i pierwotniaki. Alternatywnie przekształcone komórki mogą pochodzić od organizmu wielokomórkowego, tj. może to być komórka grzyba, komórka owada, komórka roślinna lub komórka ssaka. Dla klonowania i/lub zoptymalizowanej ekspresji korzystne jest, aby przekształcona komórka była zdolna do replikacji fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku. Komórki eksprymujące fragment nukleinowy są użytecznymi przykładami wykonania; można je stosować w wytwarzaniu na małą skalę lub na dużą skalę peptydów według wynalazku. [0078] Przy wytwarzaniu peptydu według wynalazku przy pomocy przekształconych komórek dogodne jest, choć wcale nie niezbędne, aby produkt ekspresji był wydzielany do pożywki hodowlanej. Skuteczność [0079] Wiązanie się odpowiednich związków z receptorami GLP-1 lub glukagonu (Glu) można zastosować jako wskazanie aktywności agonistycznej, ale ogólnie korzystne jest stosowanie próby biologicznej, która mierzy sygnalizację wewnątrzkomórkową wywołaną przez wiązanie się związku z odpowiednim receptorem. Na przykład aktywacja receptora glukagonu przez agonistę glukagonu będzie stymulować powstawanie komórkowego cyklicznego AMP (camp). Podobnie aktywacja receptora GLP-1 przez agonistę GLP-1 będzie stymulować powstawanie komórkowego camp. Tym samym wytwarzanie camp w odpowiednich komórkach eksprymujących jeden z tych dwóch receptorów można zastosować do monitorowania odpowiedniej aktywności receptora. Zastosowanie pary typów komórki, z których każda eksprymuje jeden receptor, natomiast nie drugi, może posłużyć do określenia aktywności agonisty względem obu typów receptora. [0080] Znawca będzie świadomy odpowiednich formatów testów, a przykłady zostaną podane poniżej. Receptor GLP-1 i/lub receptor glukagonu mogą mieć sekwencję receptorów, jak opisano w przykładach. Na przykład testy mogą wykorzystywać receptor ludzkiego

17 16 glukagonu (Glukagon-R) mający podstawowy numer dostępowy GI: i/lub receptor ludzkiego glukagonopodobnego peptydu 1 (GLP-1 R) mający podstawowy numer dostępowy GI: (Gdy mowa o sekwencjach białek prekursorowych, należy oczywiście rozumieć, że testy wykorzystują dojrzałe białka, pozbawione sekwencji sygnałowej.) [0081] Wartości EC 50 można stosować jako liczbową miarę potencji agonisty na danym receptorze. Wartość EC 50 jest miarą stężenia związku wymaganego do osiągnięcia połowy maksymalnej aktywności związku w danym teście. Tym samym można uznać, że na przykład związek mający EC 50 [GLP-1R] niższy niż EC 50 [GLP-1R] natywnego glukagonu w danym teście ma większą potencję na GLP-1 R niż glukagon. [0082] Związki przedstawione w tym opisie są zwykle dualnymi agonistami Glu-GLP-1, tj. są one zdolne do stymulacji tworzenia camp zarówno na receptorze glukagonu, jak i na receptorze GLP-1. Stymulację każdego receptora można zmierzyć w niezależnych testach, a następnie porównać ze sobą. [0083] Porównując wartość EC 50 dla receptora glukagonu (EC 50 [Glukagon-R]) z wartością EC 50 dla receptora GLP-1 (EC 50 [GLP-1R]) dla danego związku, można uzyskać względną selektywność (%) glukagonu dla tego związku: Względna selektywność Glukagonu-R [Związek] = (1/EC 50 [Glukagon- R])x100/(1/EC 50 [Glukagon-R] + 1/EC 50 [GLP-1R]) [0084] Podobnie można też uzyskać względną selektywność GLP-1 R: Względna selektywność GLP-1R [Związek] = (1/EC 50 [GLP-1R]x100/ (1/EC 50 [Glukagon-R] + 1/EC 50 [GLP-1R]) [0085] Względna selektywność związku umożliwia porównanie swojego działania na receptor GLP-1 lub glukagonu bezpośrednio z działaniem na drugi receptor. Na przykład im wyższa jest względna selektywność GLP-1 R związku, tym skuteczniejszy jest ten związek na receptor GLP-1 w porównaniu z receptorem glukagonu. [0086] Przy pomocy testów opisanych poniżej stwierdzono, że względna selektywność GLP- 1 dla ludzkiego glukagonu wynosi w przybliżeniu 5%. [0087] Związki według wynalazku mają wyższą względną selektywność GLP-1 R niż ludzki glukagon. Tym samym dla danego poziomu aktywności agonisty glukagonu-r związek wykaże wyższy poziom aktywności agonisty GLP-1 R (tj. większą potencję na receptorze GLP-1) niż glukagon. Należy rozumieć, że bezwzględna potencja danego związku na receptorach glukagonu i GLP-1 może być wyższa, niższa lub w przybliżeniu równa tej dla natywnego ludzkiego glukagonu, o ile osiągnięta jest odpowiednia względna selektywność GLP-1 R. [0088] Niemniej jednak związki według wynalazku mogą mieć niższy EC 50 [GLP-1 R] niż ludzki glukagon. Związki mogą mieć niższy EC 50 [GLP-1-R] niż glukagon, utrzymując równocześnie EC 50 [Glukagon-R], który jest niższy niż 10-krotność tego dla ludzkiego glukagonu, niższy niż 5-krotność tego dla ludzkiego glukagonu lub niższy niż 2-krotność tego dla ludzkiego glukagonu.

18 17 [0089] Związki według wynalazku mogą mieć EC 50 [Glukagon-R], który jest niższy od dwukrotności tego dla ludzkiego glukagonu. Związki mogą mieć EC 50 [Glukagon-R], który jest niższy niż dwukrotność tego dla ludzkiego glukagonu oraz mieć EC 50 [GLP-1 R], który jest niższy niż połowa tego dla ludzkiego glukagonu, niższy niż jedna piąta tego dla ludzkiego glukagonu lub niższy niż jedna dziesiąta tego dla ludzkiego glukagonu. [0090] Względna selektywność GLP-1 związków może wynosić między 5% a 95%. Na przykład związki mogą mieć względną selektywność 5-20%, 10-30%, 20-50%, 30-70% lub 50-80%; lub 30-50%, 40-60%, 50-70% lub 75-95%. Zastosowania terapeutyczne [0091] Związki według wynalazku mogą stanowić atrakcyjną opcję terapeutyczną dla otyłości i chorób metabolicznych, włączając cukrzycę typu 2. [0092] Diabetes mellitus, często określana po prostu jako cukrzyca, jest syndromem zaburzonego metabolizmu, zazwyczaj ze względu na połączenie dziedzicznych i środowiskowych przyczyn, co powoduje nieprawidłowo wysoki poziom cukru we krwi (hiperglikemia). [0093] Poziomy glukozy we krwi są regulowane przez insulinę hormonalną wytwarzaną w komórkach beta trzustki. Cukrzyca rozwija się z powodu zniszczenia komórek beta trzustki wytwarzającej insulinę (przy cukrzycy typu 1) lub odporności na działanie insuliny (przy cukrzycy ciążowej), po której następuje utrata komórek beta (przy cukrzycy typu 2). Oba typy cukrzycy prowadzą do hiperglikemii, która w dużym stopniu powoduje ostre objawy cukrzycy: nadmierne oddawanie moczu, powstające pragnienie wyrównawcze i zwiększone spożycie płynów, nieostre widzenie, niewyjaśniony spadek masy ciała, letarg i zmiany w metabolizmie energetycznym. [0094] Syndrom metaboliczny charakteryzuje się grupą metabolicznych czynników ryzyka u jednej osoby. Obejmują one otyłość brzuszną (nadmiar tkanki tłuszczowej wokół narządów wewnętrznych jamy brzusznej), aterogenną dyslipidemię (zaburzenia zawartości tłuszczu we krwi, włączając wysoki poziom triglicerydów, niski cholesterol HDL i/lub wysoki cholesterol LDL, które sprzyjają osadzaniu się kamienia na ścianach tętnic), podwyższone ciśnienie krwi (nadciśnienie), oporność na insulinę i nietolerancję glukozy, stan prozakrzepowy (np. wysoki fibrynogen lub inhibitor aktywatora plazminogenu -1 we krwi) i stan prozapalny (np. podwyższone stężenie białka C-reaktywnego we krwi). [0095] U osób z syndromem metabolicznym występuje zwiększone ryzyko zachorowania na cukrzycę typu 2, a także na chorobę wieńcową i inne choroby związane z osadzaniem się kamienia na ścianach tętnic (np. udar i choroba tętnic obwodowych). Dominującymi podstawowymi czynnikami ryzyka dla tego zespołu wydają się być otyłość brzuszna, oporność na insulinę, nietolerancja glukozy, stan prozakrzepowy (np. wysoki fibrynogen lub inhibitor aktywatora plazminogenu -1 we krwi) i stan prozapalny (np. podwyższone stężenie białka C-reaktywnego we krwi).

19 18 [0096] Nie wiążąc się żadną szczególną teorią, uważa się, że związki według wynalazku działają jako dualni agoniści GluGLP-1. Dualny agonista łączy działanie glukagonu na metabolizm tłuszczu i GLP-1 na poziomy glukozy we krwi, jak również spożycie pokarmu. Mogą one zatem działać synergistycznie, przyspieszając eliminację nadmiernego odkładania tłuszczu, wywołując trwałą utratę wagi i bezpośrednio zmniejszając chorobliwe poziomy glukozy do normalnych poziomów, bez ryzyka hipoglikemii, która związana jest z jednoczesnym stosowaniem agonistów GLP-1 i sulfonylomocznika. [0097] Synergistyczne działanie dualnych agonistów GluGLP-1 powoduje również zmniejszenie czynników ryzyka sercowo-naczyniowego, takich jak wysoki cholesterol i LDL, jak również poprawa tolerancji glukozy, które mogą być zupełnie niezależne od ich działania na masę ciała. [0098] Związki według wynalazku można zatem stosować jako środki farmaceutyczne do zapobiegania przyrostowi masy ciała, promowania utraty masy, zmniejszania nadmiaru masy ciała lub leczenia otyłości (np. poprzez regulację łaknienia, spożycia kalorii i/lub zużycia energii), włączając chorobliwą otyłość, jak również powiązane choroby i stany zdrowia, włączając bez ograniczania stan zapalny związany z otyłością, chorobę pęcherzyka żółciowego związaną z otyłością i bezdech senny wywołany przez otyłość. Związki według wynalazku można również stosować w leczeniu syndromu metabolicznego, oporności na insulinę, nietolerancji glukozy, cukrzycy typu 2, nadciśnienia, dyslipidemii aterogennej, miażdżycy tętnic, stwardnienia tętnic, choroby wieńcowej lub udaru. Wszystkie te stany można powiązać z otyłością. Jednakże działanie związków według wynalazku na te stany może zachodzić w całości lub częściowo poprzez oddziaływania na masę ciała lub może być od niego niezależne. Kompozycje farmaceutyczne [0099] Związki według wynalazku lub ich sole mogą być formułowane jako kompozycje farmaceutyczne wytwarzane do przechowywania lub podawania, które zwykle zawierają terapeutycznie skuteczną ilość związku według wynalazku lub jego soli w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. [0100] Terapeutycznie skuteczna ilość związku według wynalazku będzie zależała od drogi podawania, rodzaju leczonego ssaka i właściwości fizycznych rozpatrywanego konkretnego ssaka. Czynniki te i ich zależności do określenia tej ilości są dobrze znane wykwalifikowanemu praktykowi w dziedzinie medycyny. Tę ilość i sposób podawania można dopasować, aby osiągnąć optymalną skuteczność, przy czym mogą one zależeń od takich czynników jak masa, dieta, równoległe leczenie i inne czynniki dobrze znane znawcy w dziedzinie medycyny. Wielkości dawek i schemat dawkowania najbardziej odpowiednie do stosowania u ludzi mogą opierać się na wynikach uzyskanych przez wynalazek i mogą zostać potwierdzone w odpowiednio zaprojektowanych badaniach klinicznych. [0101] Protokół skutecznego dawkowania i leczenia można określić konwencjonalnymi środkami, zaczynając od małej dawki na zwierzętach laboratoryjnych, a następnie zwiększając dawkę, monitorując przy tym zmiany i systematycznie zmieniając również

20 19 schemat dawkowania. Klinicysta może uwzględnić wiele czynników przy określaniu optymalnego dawkowania dla danego osobnika. Takie względy znane są znawcy w dziedzinie. [0102] Termin farmaceutycznie dopuszczalny nośnik obejmuje dowolny ze standardowych nośników farmaceutycznych. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki do stosowania terapeutycznego są dobrze znane w dziedzinie farmaceutyki i opisane są na przykład w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Na przykład można zastosować sterylny roztwór soli i roztwór soli buforowany fosforanem przy lekko kwaśnym lub fizjologicznym ph. Środkami buforującymi ph mogą być fosforan, cytrynian, octan, tri(hydroksymetylo)aminometan (TRIS), kwas N-tri(hydroksymetylo)metylo -3- aminopropanosulfonowy (TAPS), wodorowęglan amonu, dietanoloamina, histydyna, która jest korzystnym buforem, arginina, lizyna lub octan, albo ich mieszaniny. Termin obejmuje ponadto dowolne środki wymienione w Farmakopei USA do stosowania na zwierzętach, włączając ludzi. [0103] Termin farmaceutycznie dopuszczalna sól odnosi się do soli związków. Sole obejmują farmaceutycznie dopuszczalne sole, takie jak sole addycyjne z kwasami i sole zasadowe. Przykłady soli addycyjnych z kwasami obejmują sole chlorowodorkowe, sole cytrynianowe i sole octanowe. Przykłady soli zasadowych obejmują sole, w których kation dobiera się z metali alkalicznych, takich jak sód i potas, metali ziem alkalicznych, takich jak wapń, i jony amonowe + N(R 3 ) 3 (R 4 ), gdzie R 3 i R 4 niezależnie oznaczają opcjonalnie podstawiony alkil C 1-6, opcjonalnie podstawiony alkenyl C 2-6, opcjonalnie podstawiony aryl lub opcjonalnie podstawiony heteroaryl. Inne przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych soli opisane są w Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 i nowszych wydaniach, oraz w Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology. [0104] Leczenie jest podejściem do uzyskania korzystnych lub pożądanych wyników klinicznych. Dla celów wynalazku korzystne lub pożądane wyniki kliniczne obejmują, ale nie ograniczają się do łagodzenia objawów, ograniczanie zakresu choroby, stabilnego (tj. nie ulegającego pogorszeniu) stanu choroby, opóźnienia lub spowolnienia postępu choroby, poprawy lub uśmierzenia stanu choroby i eliminacji (częściowej lub całkowitej), niezależnie, czy jest wykrywalna czy nie. Leczenie może również oznaczać wydłużenie czasu przeżycia w porównaniu z oczekiwanym czasem przeżycia w przypadku niestosowania leczenia. Leczenie jest interwencją przeprowadzoną z zamiarem zapobiegnięcia rozwoju lub dokonania zmian w patologii zaburzenia. Odpowiednio leczenie odnosi się do leczenia terapeutycznego, jak i środków profilaktycznych lub zapobiegawczych. Wymagający leczenia obejmują tych, już cierpiących na zaburzenie, jak również tych, u których należy zapobiec zaburzeniu. [0105] Kompozycje farmaceutyczne mogą występować w postaci dawki jednostkowej. W takiej postaci kompozycja jest dzielona na dawki jednostkowe zawierające odpowiednie ilości aktywnego składnika. Jednostkową postacią dawkowania może być opakowany preparat, przy czym opakowanie zawiera oddzielne ilości preparatów, na przykład opakowane tabletki,