Występowanie genów transferaz aminoglikozydowych u metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKOBIOL., 2010, 62: Andrzej Młynarczyk, Ksenia zymanek-majchrzak, Grażyna Młynarczyk Występowanie genów transferaz aminoglikozydowych u metycylinoopornych szczepów taphylococcus aureus Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: prof. dr hab. med. G. Młynarczyk Badano częstość występowania genów: aaca-aphd kodującego acetylotransferazę/fosfotransferazę AAC(6 ) Ie/APH(2 )-Ia, aadd kodującego nukleotydylotransferazę ANT(4 )-Ia oraz aph(3 )-IIIa kodującego fosfotransferazę APH(3 )-IIIa u grupy 50 metycylino-opornych szczepów taphylococcus aureus (MA), izolowanych z próbek materiału klinicznego. Najczęściej wykazywano łączną obecność genów aaca-aphd i aadd. Oporność na antybiotyki aminoglikozydowe u bakterii może być wynikiem kilku różnych mechanizmów (3, 8, 12, 13, 15) takich jak: synteza enzymów z grupy transferaz (acetylotransferazy, fosfotransferazy, nukleotydylotransferazy) modyfikujących cząsteczkę antybiotyku (3, 8, 12, 13, 15), mutacje w genach kodujących białka rybosomalne najczęściej dotyczące białka 12 i związane z wysokim poziomem oporności na streptomycynę (11, 13), brak enzymów odpowiedzialnych za aktywny transport aminoglikozydów do wnętrza komórki bakteryjnej (.aureus CV - wariant małych kolonii, rodzaje treptococcus i Enterococcus oraz wszystkie bakterie bezwzględnie beztlenowe) (10, 13), synteza metylaz 16 rna (ArmA, mta-tmd, NmpA) modyfikujących miejsce docelowe dla antybiotyku (mechanizm opisany dotąd tylko u niektórych pałeczek Enterobacteriaceae) (10, 15), aktywne usuwanie antybiotyku z komórki bakteryjnej - mechanizm różnych pomp błonowych (pałeczki Gram-ujemne zwłaszcza z rodzaju Pseudomonas) (10, 15). Najbardziej rozpowszechniony mechanizm oporności na aminoglikozydy u.aureus polega na syntezie enzymów z grupy transferaz (1, 6, 8, 14, 20). ą to: dwudomenowa acetylotransferaza/fosfotransferaza AAC(6 )-Ie/APH(2 )-Ia, kodowana przez gen aaca- -aphd i warunkująca oporność na gentamycynę, tobramycynę, kanamycynę oraz często na amikacynę i netilmycynę, nukleotydylotransferaza ANT(4 )-Ia kodowana przez gen aadd i warunkująca oporność na tobramycynę, kanamycynę, neomycynę oraz fosfotransferaza APH(3 )-IIIa kodowana przez gen aph(3 )-IIIa warunkująca oporność na kanamycynę, neomycynę, lividomycynę (6, 12, 13). U wankomycyno-opornych taphylococcus aureus (VA) opisano również fosfotransferazę APH(3 )-III (oporność na kanamycynę i neomy-

2 290 A. Młynarczyk, K. zymanek-deresz, G. Młynarczyk cynę) kodowaną przez gen apha-3 (aph(3 )-IIIa), występujący w plazmidach przekazanych do.aureus z ziarenkowców z rodzaju Enterococcus w obrębie wbudowanych w te plazmidy transpozonów Tn3851, Tn4031 i Tn5404 (13, 18). Ponadto. aureus może syntetyzować transferazy, np. ANT(6), kodowaną przez gen ant(6) plazmidu p194, lub ant(6)-ia (aade), inaktywujące streptomycynę (13, 18, 19). Oporność na streptomycynę u.aureus może być również wynikiem mutacji genu kodującego rybosomalne białko 12 (13, 18). Obniżona wrażliwość lub oporność na aminoglikozydy może być wynikiem zakłócenia transportu aminoglikozydów do wnętrza komórki bakteryjnej. Ten typ oporności występuje najczęściej u.aureus CV (small colony variants) spowodowana mutacjami w genach enzymów transportowych (13, 18). Celem podjętych przez nas badań było ustalenie częstości występowania genów transferaz aminoglikozydowych oraz określenie warunkowanego przez nie fenotypu oporności na różne antybiotyki aminoglikozydowe u grupy 50 szczepów MA. MATEIAŁ I METODY zczepy bakteryjne. Przedmiot badań stanowiło 50 szczepów MA wyhodowanych i oznaczonych do gatunku w Pracowni Diagnostyki Mikrobiologicznej w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Każdy izolat pochodził od innego chorego hospitalizowanego w zpitalu Dzieciątka Jezus w Warszawie. zczepy identyfikowano i określano ich lekowrażliwość z zastosowaniem systemu Vitek 2 lub ID32taph i ATB taph. Metycylino-oporność była potwierdzana przy użyciu testu dyfuzyjno-krążkowego z cefoksytyną. Do dalszych badań wybrano 34 szczepy MA oporne na gentamycynę oraz 16 szczepów MA wrażliwych na gentamycynę ale opornych na kanamycynę. Jako szczepy kontrolne zastosowano: NCTC 8325 i 209P (wrażliwe na wszystkie antybiotyki), Mu3 i Mu50 (posiadające geny aaca-aphd i aadd oraz P85 posiadający gen aph(3 )-IIIa. Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki aminoglikozydowe. Oznaczenia metodą dyfuzyjno-krążkową wykonywano zgodnie z zaleceniami (2). Wyniki ozna- Tabela I. Kryteria wrażliwości.aureus na antybiotyki aminoglikozydowe FM MIC Metoda MIC Metoda MIC Metoda Antybiotyk (mg/l) dyfuzyjna (mg/l) dyfuzyjna (mg/l) dyfuzyjna K K K Gentamycyna > Amikacyna > Netilmycyna >1 10 IP IP Tobramycyna > Kanamycyna Neomycyna tosowane oznaczenia: -Clinical and Laboratory tandarts Institute (2) -European Committee on Antimicrobial usceptibility Testing (4), FM-ociété Française de Microbiologie (17), K-ilość antybiotyku w krążku (g -6 ), -wrażliwy, -oporny; IP-w przygotowaniu.

3 Transferazy aminoglikozydowe MA 291 Tabela II. Występowanie genów transferaz aminoglikozydowych i fenotyp oporności na antybiotyki aminoglikozydowe u szczepów MA Obecność genów transferaz aminoglikozydowych aacaaphd aph(3 )- aadd -IIIa Liczba szczepów Kryterium wrażliwości FM FM FM FM FM FM FM Mu50 FM Mu3 FM P85 FM NCTC Liczba szczepów opornych (), średniowrażliwych (I), wrażliwych () GEN /I/ TOB /I/ 2/0/0 2/0/0 2/0/0 2/0/0 2/0/0 19/0/0 19/0/0 19/0/0 19/0/0 19/0/0 9/0/0 9/0/0 9/0/0 9/0/0 9/0/0 1/0/0 0/0/1 1/0/0 0/0/1 1/0/0 4/0/0 4/0/0 4/0/0 4/0/0 4/0/0 5/0/0 0/0/5 5/0/0 1/0/4 5/0/0 0/0/10 0/0/10 0/0/10 0/0/10 0/0/10 zczepy kontrolne FM P FM KAN /I/ 2/0/0 2/0/0 19/0/0 19/0/0 9/0/0 9/0/0 1/0/0 1/0/0 4/0/0 4/0/0 5/0/0 5/0/0 10/0/0 10/0/0 NEO AMI /I/ /I/ 2/0/0 0/2/0 0/2/0 0/2/0 17/2/0 15/3/1 15/3/1 16/3/0 9/0/0 5/3/1 5/3/1 6/3/0 1/0/0 0/1/0 0/1/0 1/0/0 0/0/4 2/0/2 2/0/2 2/0/2 4/1/0 0/1/4 0/1/4 0/2/3 10/0/0 2/3/5 2/3/5 3/2/5 I NET /I/ 1/0/1 0/2/17 1/3/5 0/0/1 1/2/1 0/0/5 0/0/10 tosowane oznaczenia: FM-ociété Française de Microbiologie, - Clinical and Laboratory tandarts Institute, -European Committee on Antimicrobial usceptibility Testing, GEN-gentamycyna, TOB-tobramycyna, KAN-kanamycyna, NEO-neomycyna, AMI-amikacyna, NET-netilmycyna.

4 292 A. Młynarczyk, K. zymanek-deresz, G. Młynarczyk czeń interpretowano zgodnie z kryteriami wrażliwości na antybiotyki aminoglikozydowe wg (2), oraz w przypadku neomycyny podanymi przez ociété Française de Microbiologie (17). Kryteria te oraz kryteria przedstawiono w tabeli I. Do oznaczeń stosowano krążki produkcji Oxoid. tosowane przez nas stężenia antybiotyków w krążkach odpowiadały normom. Izolacja DNA i wykrywanie genów aaca-aphd, aadd oraz aph(3 )- -IIIa metodą PC. Badane szczepy bakteryjne namnażano przez noc w płynnym podłożu BHI w 35 C. 1,5 L -3 hodowli odwirowywano przez 3 min przy rpm i osad zawieszano w 0,6 L -3 buforu TE (50 mol -3 Tris, ph 8,0; 10 mol -3 EDTA, ph 8,0) i następnie wirowano 3 min przy rpm. Następnie osad bakterii zawieszano w 0,2 L -3 buforu TE i dodawano 10 jednostek roztworu lizostafiny i inkubowano przez 30 min. w temp. 37 C. Po tym czasie do lizatu komórek dodawano 0,3 L -3 DNazolu (Gibco BL, New York) w celu uzyskania całkowitej lizy komórek. Uwolnione DNA wytrącano dodając 2,5 objętości 96% etanolu i umieszczano na 20 min w temp -20 o C, Próbki wirowano przez 3 min przy 12 tys rpm a następnie uzyskany osad DNA przemywano 1 L -3 70% etanolu. Alkohol odparowywano przez 15 min. w temp 37 o C, a DNA rozpuszczano w 0,1 L -3 jałowej dejonizowanej wody. Próbki przechowywano w - 20 o C. eakcja PC. W skład każdej próbki wchodziły: 5 L -6 10x Taq bufor z KCl (Fermentans Live ciences; 100 mol -3 Tris-HCl (ph 8,8 w 25 o C, 500 mol -3 KCl, 0,8% octyl- -phenoxyl-polyethoxyl-ethanol NP40), 5 L mol -3 MgCl 2, 0,5 L -6 każdego z czterech 25 mol -3 dntp, 1 L -6 każdego startera (50 mol -6 ), 0,2 L -6 5,0 U polimerazy Taq (Gibco) oraz 3 L -6 badanego DNA. Całkowita objętość próbki po dopełnieniu dejonizowaną wodą wynosiła 50 L -6. W reakcji PC stosowano następujące parametry: wstępna denaturacja 94 o C, 5 min; denaturacja 94 o C, 30s 25 cykli, przyłączanie starterów 58 o C, 30s, 25 cykli, elongacja 72 o C, 30s, 25 cykli, końcowa elongacja 72 o C, 7 min. tartery zostały zsyntetyzowane przez TIB MolBiol Poznań i charakteryzowały się następującą kolejnością nukleotydów wg Ida i wsp. (6). Dla genu aaca-aphd: 5 -CGA TGT GGA TTG CGA AAA CT-3 ;3 -CAC CGA AAT AAC TAG AAC CC-5 ; amplifikowany fragment 273 bp. Dla genu aadd: 5 -ATG GCT CTC TTG GTC GTC AG-3 ; 3 -TAA GCA CAC GTT CCT GGC TG-5 ; amplifikowany fragment 367 bp. Dla genu aph(3 )-IIIa: 5 -CAT TAT ACA GAG CCT TGG GA-3 ; 3 - AGG TCC TCG TTA TTC CCG TA-5 ; amplifikowany fragment 152 bp. WYNIKI U 50 szczepów MA określano metodą PC obecność 3 genów: aaca-aphd, aadd oraz aph(3 )-IIIa. Do badań wybrano 34 szczepy MA oporne na gentamycynę oraz 16 szczepów wrażliwych na gentamycynę ale opornych na kanamycynę. U wszystkich 50 szczepów MA określono wrażliwość na gentamycynę, tobramycynę, kanamycynę, neomycynę, amikacynę i netilmycynę metodą dyfuzyjno-krążkową. Interpretacja uzyskanych wyników dotyczących wrażliwości bakterii na gentamycynę, tobramycynę i amikacynę przeprowadzono w oparciu o kryteria oraz, na kanamycynę i netilmycynę tylko w oparciu o kryteria (brak kryteriów ) a na neomycynę w oparciu o kryteria podawane przez oussy i wsp. (17). Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli II. Wśród 50 badanych szczepów MA u 34 szczepów wykazano obecność genu aaca-aphd, u 27

5 Transferazy aminoglikozydowe MA 293 szczepów występował gen aadd a u 22 szczepów występował gen aph(3 )-IIIa. U 19 szczepów (38%) wykazano występowanie tylko jednego genu, u 29 szczepów (58%) dwóch genów, a u 2 szczepów (4%) wszystkich trzech genów kodujących różne transferazy aminoglikozydowe. Najczęściej (38%) szczepy posiadały geny aaca-aphd i aadd. zczepy u których wykazano obecność genu aaca-aphd wykazywały oporność na gentamycynę (100%), tobramycynę (100%) i kanamycynę (100%) i były wrażliwe na neomycynę (100%). Oporność na netilmycynę wykazano u 6% szczepów, średnią wrażliwość u 14% szczepów a wrażliwość u 80% szczepów kodujących AAC(6 )-Ie/APH(2 )-Ia. zczepy u których wykazano obecność genu aadd wykazywały oporność na tobramycynę (100%) i kanamycynę (100%), neomycynę (80% opornych i 20% średnio wrażliwych) oraz były wrażliwe na gentamycynę i netilmycynę (100%). Nie stwierdzono w tej grupie szczepów opornych na amikacynę, 20% wykazywało średnią wrażliwość a 80% wrażliwość. zczepy, u których wykazano obecność genu aph(3 )-IIIa wykazywały oporność na kanamycynę (100%) i neomycynę (100%), oraz były wrażliwe na gentamycynę, tobramycynę i netilmycynę (100%). zczepy oporne na amikacynę stanowiły 20%, szczepów średnio wrażliwych było 30% a szczepów wrażliwych 50%. Wyniki przedstawiono w tabeli II. DYKUJA Geny aaca-aphd kodujące acetylotransferazę/fosfotransferazę AAC(6 )-Ie/APH(2 )- -Ia występują w transpozonach (np. Tn4001, Tn4001-like), zlokalizowanych w dużych plazmidach i chromosomie (np. CCmec IVc) (9, 10, 13). AAC(6 )-Ie/APH(2 )-Ia jest u.aureus jedynym dotychczas znanym enzymem warunkującym oporność na gentamycynę. MIC gentamycyny dla szczepów które mają ten enzym, waha się w przedziale od 8 mg/l do > 1024 mg/l (MIC 50 wynosi 128 mg/l, a MIC mg/l) (6). Dla szczepów wrażliwych na aminoglikozydy oraz szczepów syntetyzujących enzymy ANT(4 )-Ia lub APH(3 )-IIIa, wartości MIC gentamycyny mieszczą się w przedziale 0,25-1,0 mg/l. Dlatego pewne wątpliwości budzi nowe kryterium 2010, wg którego jeden z badanych przez nas szczepów.aureus, syntetyzujący tylko ANT(4 ), dla którego średnica strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z gentamycyną wyniosła 17 mm, należałoby klasyfikować wg kryterium u jako oporny na gentamycynę, podczas gdy wg obowiązującego jeszcze kryterium określany jest jako wrażliwy (tabela II). ynteza AAC(6 )-Ie/APH(2 )-Ia warunkuje również najczęściej oporność na tobramycynę. MIC tobramycyny dla szczepów syntetyzujących ten enzym, waha się w przedziale od 8 mg/l do 256 mg/l (MIC 50 wynosi 32 mg/l a MIC mg/l) (6). Ponadto, szczepy syntetyzujące ten enzym są zawsze oporne na kanamycynę (MIC 64 mg/l). Jedynym enzymem u.aureus rozkładającym netilmycynę jest AAC(6 )-Ie/APH(2 )-Ia. Netilmycyna jest bardzo słabym induktorem genu aaca-aphd, co jest powodem, że szczepy.aureus posiadające indukcyjny mechanizm regulacji tego genu są często oznaczane w rutynowych badaniach jako wrażliwe. Ida i wsp (5) opisał naturalne szczepy.aureus u których elementy Tn4001-like zawierające gen aaca-aphd zachowały promotor operonu beta-laktamazowego (zredukowany gen blaz), co może powodować silną indukcję oporności na aminoglikozydy przez antybiotyki beta-laktamowe i antagonizm beta-laktamów i aminoglikozydów. tosując jako induktor aztreonam w stężeniu 25 mg/l uzyskano wzrost wartości MIC netilmycyny z 4 do 32 mg/l oraz gentamycyny z 128 do

6 294 A. Młynarczyk, K. zymanek-deresz, G. Młynarczyk 1024 mg/l (5). Niektóre mutacje punktowe genu aaca-aphd mogą rozszerzać spektrum AAC(6 )-Ie/APH(2 )-Ia np. o arbekacynę (16). Gen aadd kodujący nukleotydylotransferazę ANT(4 )-Ia występuje zarówno w małych (pub110) i w dużych plazmidach np. koniugacyjnych. Kopia pub110 występuje w niektórych chromosomalnych kasetach metycylinowych CCmec (10, 11, 13). Gen aph(3 )-IIIa kodujący fosfotransferazę APH(3 )-IIIa występuje najczęściej w plazmidach. Wysokie MIC lividomycyny (>1024 mg/l) pozwala fenotypowo odróżnić ten gen od pozostałych (5). W prowadzonych przez nas badaniach wykazano, że geny transferaz aminoglikozydowych u badanych przez nas szczepów MA najczęściej występują łącznie, np aaca-aphd + aadd u 38% MA, aaca-aphd + aph(3 )-IIIa u 18% MA. Obecność genu aaca-aphd u badanych przez nas szczepów MA warunkowała zawsze oporność na gentamycynę, kanamycynę i tobramycynę. Tylko około 10% szczepów posiadających ten gen było opornych na netilmycynę, natomiast około 50% było opornych na amikacynę. Wszystkie szczepy posiadające tylko aaca-aphd były wrażliwe na neomycynę. Wg (2) szczepy.aureus oporne na gentamycynę (mające gen aaca-aphd ) są klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki aminoglikozydowe, pochodne distreptaminy. Obecność genu aadd warunkowała oporność badanych szczepów na tobramycynę, kanamycynę i neomycynę. zczepy te były wrażliwe na gentamycynę i netilmycynę. Obecność genu aph(3 )-IIIa warunkowała oporność badanych MA na kanamycynę i neomycynę. U ok. 20% szczepów posiadających ten gen wykazano również oporność na amikacynę. zczepy te pozostawały wrażliwe na gentamycynę, tobramycynę i netilmycynę. A. Młynarczyk, K. zymanek-majchrzak, G. Młynarczyk Occurence of aminoglycoside transpherase genes in methicillin-resistant strains of taphylococcus aureus UMMAY Fifty MA strains originated from clinical specimens were examined by the PC method, for the presence of three genes: aaca-aphd, aadd oraz aph(3 )-IIIa. The obtained results were correlated with the susceptibility of the strains to gentamicin, tobramicin, kanamicin, neomicin, amikacin and netilmicin. The susceptibility results were interpreted according with and guidelines. aaca-aphd gene was found in 34 strains, aadd in 27 strains and aph(3 )-IIIa was present in 22 strains. In 19 strains (38%) was present one of the investigated genes, in 29 (58%) strains two genes and in two strains (4%) all three genes were found. The most frequent variant was combination of aaca-aphd and aadd genes. PIŚMIENNICTWO 1. Ardic N, areyyupoglu B, Ozyurt M i inni. Investigation of aminoglycoside modifying enzyme genes in methicillin-resistant staphylococci. Microbiol es. 2006;161: Clinical and Laboratory tandarts Institute () antimicrobial susceptibility testing standards M2-A9 and M7-A7. M ; 28:

7 Transferazy aminoglikozydowe MA Emaneini M, Taherikalani M, Eslampour MA i inni. Phenotypic and genotypic evaluation of aminoglycoside resistance in clinical isolates of staphylococci in Tehran, Iran Microb Drug esist 2009;15: European Committee on Antimicrobial usceptibility Testing () org/eucastwt/eucastdefinition.htm 5. Ida T, Okamoto, Nonoyama M i inni. Antagonism between aminoglycosides and beta-lactams in a methicillin-resistant taphylococcus aureus isolate involves induction of an aminoglycosidemodifying enzyme. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: Ida T, Okamoto, himauchi C i inni. Identification of aminoglycoside-modifying enzymes by susceptibility testing: epidemiology of methicillin-resistant taphylococcus aureus in Japan. J Clin Microbiol 2001; 39: Jeljaszewicz J, Młynarczyk G, Młynarczyk A. Antibiotic resistance in Gram-positive cocci. Int J Antimicrob Agents 2000; 16: Kelmani Chandrakanth, aju, Patil A. Aminoglycoside-resistance mechanisms in multidrug- -resistant taphylococcus aureus clinical isolates. Curr Microbiol 2008; 56: Lowy D. Antimicrobial resistance: the example of. aureus. ci Med 2003; 111: Mlynarczyk A, Mlynarczyk B, Kmera-Muszynska M i inni. Mechanisms of the resistance and tolerance to beta-lactam and glycopeptide antibiotics in pathogenic Gram-positive cocci. Mini-ev Med Chem 2009; 9: Młynarczyk A, Młynarczyk G. Molecular mechanisms of resistance to antibacterial drugs in taphylococcus aureus. Post Mikrobiol 2008; 47: Młynarczyk A, Młynarczyk G, Łuczak M. Mechanizmy oporności na antybiotyki szczepów MA. Zakażenia 2004; 6: Młynarczyk B, Młynarczyk A, Kmera-Muszyńska M i inni. Mechanisms of resistance to antimicrobial drugs in pathogenic Gram-positive cocci. Mini ev Med Chem 2010; 10: aju, Kumar OA, Patil A, Kelmani Chandrakanth. Prevalence of multidrug-resistant taphylococcus aureus in diabetics clinical samples. World J Microbiol Biotechnol 2010; 26: ossolini GM, Mantengoli E. Antimicrobial resistance in Europe and its potential impact on empirical therapy. Clin Microb Infect 2008; 14: Fujimura, Tokue Y, Takahashi H i inni. Novel arbekacin- and amikacin-modifying enzyme ofmethicillin-resistant taphylococcus aureus. FEM Microbiol Lett 2000; 190: oussy CJ, Cavallo JD, Chardon H i inni. Comite de l antibiogramme de la societe francaise de microbiologie recommandations 2008 (Edition de Janvier 2008) ociété Française de Microbiologie Weigel LM, Donlan, M, hin DH i inni. High-level vancomycin-resistant taphylococcus aureus isolates associated with a polymicrobial biofilm. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51: Woodford N. Biological counterstrike: antibiotic resistance mechanisms of Gram-positive cocci. Clin Microbiol Infect 2005; 11: Yadegar A, attari M, Mozafari NA, Goudarzi G. Prevalence of the genes encoding aminoglycoside-modifying enzymes and methicillin resistance among clinical isolates of taphylococcus aureus in Tehran, Iran. Microb Drug esist 2009;15: Otrzymano: 26 X 2010 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego

8