AUTOREFERAT. A) tytuł Analiza Zmienności i zróżnicowania komórek enterokoków pod względem lekooporności i wirulencji.

Transkrypt

1 Załącznik nr 2 do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego 1. Imię i Nazwisko: Tomasz Jarzembowski 2. Posiadana dyplomy i stopnie naukowe: AUTOREFERAT magister biologii, Uniwersytet Gdański 1995 doktor nauk biologicznych, Uniwersytet gdański 2000 Specjalizacja I stopnia w zakresie mikrobiologii, Gdański Uniwersytet Medyczny 2004 Certyfikat ukończenia: International Course on biofilm, Minho University 2009 Certfikat studiów podyplomowych Menadżer badań naukowych i prac rozwojowych OIC Poland, Informacja o dotychczasowym zatrudnieniu 15.IX IV 2004: biolog, specjalista, Katedra Mikrobiologii, Gdański Uniwersytet Medyczny 1 IV IV 2005 asystent, katedra Mikrobiologii, Gdański Uniwersytet Medyczny od IV 2005 adiunkt, Katedra Mikrobiologii, Gdański Uniwersytet Medyczny 4. Osiągnięcie wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki A) tytuł Analiza Zmienności i zróżnicowania komórek enterokoków pod względem lekooporności i wirulencji. Osiągnięcie habilitacyjne stanowi jednotematyczny cykl publikacji oraz rozdział w książce (poz. 2) poświęcony analizie heterogenności bakterii z wykorzystaniem cytometrii przepływowej (IF: łącznie 7,545 ; MNiSW: łącznie 85): B) Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego 1. T. Jarzembowski, A. Daca, J. Witkowski, B. Rutkowski, J. Gołębiewska, A. Dębska- Ślizień. 2013, Does CMV infection impact the virulence of Enterococcus faecalis? Virulence, 4(7) T.Jarzembowski, A Jozwik, K Wisniewska, J Witkowski, 2012, Single cell level survey on heterogenic glycopeptide and b-lactams resistance w : Antibiotic Resistant Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium Marina Pana (red) Intech, T.Jarzembowski, A.Daca, E.Bryl, K. Wiśniewska, J.Gołębiewska, A. Dębska-Ślizień, B. Rutkowski, J. Witkowski, 2012, Increased Pheromone ccf10 Expression in Enterococcus faecalis Biofilm Formed by Isolates from Renal Transplant Patients Current microbiology, Volume 65, Issue 6, pp

2 4. T. Jarzembowski, A. Daca, J. Witkowski, B. Rutkowski, J. Gołębiewska, A. Dębska- Ślizień Changes of PBP5 gene expression in enterococcal isolates from renal transplantation recipients. BioMed Res. Int.; vol. 2013, art. ID T Jarzembowski, Bryl E, Galiński J, Witkowski JM.2005, Zróżnicowanie agregacji komórek Enterococcus faecalis pad1 [-] pod wpływem feromonu cad1, Med Dosw Mikrobiol. 57(3): T Jarzembowski, E Bryl, J Witkowski, 2005, Cytometryczna analiza indukcji agregacji szczepów Enterococcus faecalis aph2'[+] przez szczepy aph2'[-] o różnej częstości nabywania genu aph2 Med Dosw Mikrobiol 57, (4): C) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Głównym przedmiotem moich badań rozpoczętych po uzyskaniu stopnia doktora była lekooporność i wirulencja bakterii należących do rodzaju Enterococcus. U zdecydowanej większości osób bakterie te funkcjonują jako komensale w przewodzie pokarmowym i zaliczane są flory fizjologicznej. W ostatnich latach stały sie jednak one jednym z głównych czynników etiologicznych zakażeń szpitalnych. Enterokoki odpowiedzialne są za zakażenia dróg moczowych, zapalenie wsierdzia, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i posocznice. Rutynowe badania diagnostyczne pozwalają jedynie na uzyskanie informacji o uśrednionych właściwościach pewnej badanej grupy komórek bakterii (szczepu), pomijając szeroko dziś opisane zjawisku heterogenności. Zjawisko to, jest zdaniem wielu autorów źródłem niepowodzeń w antybiotykoterapii oraz przyczyną trudności w różnicowaniu szczepów wywołujących zakażenia oportunistyczne. Celem prowadzonych badań było porównanie cech szczepów klinicznych i izolowanych od zdrowych ochotników, uwzględniające zróżnicowanie pomiędzy komórkami (single cell level). Aby uwzględnić zmienność pojedynczych komórek, we wszystkich badaniach posłużono się cytometrem przepływowym. Zastosowanie cytometru pozwala na równoczesny odczyt kilku cech indywidualnie dla każdej z komórek szczepu bakterii i dzięki temu na gromadzenie ogromnej ilości informacji. Stwarza to możliwość bardzo efektywnego wyróżniania subpopulacji bakterii występujących w szczepach heterogennych. Najbardziej znanym przykładem heterogenności jest oporność na antybiotyki. Wg klasycznej definicji jest to oporność grupy komórek w obrębie szczepu identyfikowanego standardowymi metodami diagnostycznymi, jako wrażliwy. W warunkach klinicznych, po zastosowaniu wobec takiego szczepu antybiotyku dochodzi bardzo szybko do całkowitej dominacji komórek opornych.

3 Szczególne znaczenie ma heterogenna oporność na metycylinę, ponieważ wyklucza skuteczne stosowanie większości antybiotyków β-laktamowych. Jako jedną z pierwszych, opisano heterogenna oporność na metycylinę. Początkowo zjawisko to obserwowano u gronkowców złocistych (S. aureus) a w ostatnich latach także paciorkowców i enterokoków. Duże trudności diagnostyczne stwarza też heterogenna oporność tych bakterii na antybiotyki glikopeptydowe (wankomycynę). Rozprzestrzenianie się szczepów enterokoków opornych na wankomycynę (VRE) a także szczepów opornych na antybiotyki β laktamowe, określa potrzebę znalezienia efektywnej metody identyfikacji również szczepów heterogennych. Moje badania nad lekoopornością enterokoków obejmowały zarówno wiązanie antybiotyku przez komórki bakterii jak i ekspresje receptorów odpowiedzialnych za lekooporność. W opublikowany w książce Antibiotic Resistant Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium rozdziale Single cell level survey on heterogenic glycopeptide and b- lactams resistance opisuje fenotypowe oznaczenie lekooporności z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów antybiotyków β-laktamowych (Bocilinn@FL) i gilikopeptydowych (vancomycin@fl).łączą się one z natywnym receptorem komórek wrażliwych powodując ich fluorescencję, nie ulegają natomiast związaniu w komórkach opornych, ze zmodyfikowanym receptorem. W przeprowadzonych badaniach oporności na penicyliny, wiązanie Bocilinn@FL przez szczepy wzorcowe wykazało wysoką zbieżność z przynależnością do klasy heterogenności. Dowodzi to możliwości szybkiego i efektywnego identyfikowania szczepów heterogennych w cytometrii przepływowej. Jednocześnie oznaczenia przeprowadzone dla szczepów klinicznych pozwoliły mi potwierdzić postulowany przez innych autorów opinie, że heterogenność oporności na β -laktamy ma charakter liniowy, a wyróżnione klasy heterogenności mają jedynie charakter umowny. Oznaczenia oporności na wankomycynę napotyka na większe trudności. Między innymi, dlatego, że do chwili obecnej nie zostały opisane szczepy o wzorcowej heterogennej oporności na wankomycynę. W związku z powyższym, do oznaczeń wiązania wankomycyny skonstruowałem model złożony z serii różnych proporcji szczepu opornego i wrażliwego. Zastosowany model wykazał wysoka korelacje pomiędzy odsetkiem fluoryzujących komórek a zawartością w mieszaninie komórek wrażliwych (y = -0, 8906x + 100, 46 R 2 = 0, 9771). Model ten został następnie użyty do analizy szczepów klinicznych. Wśród badanych szczepów wyizolowanych w szpitalach regionu Gdańskiego odsetek wrażliwych komórek wynosił od (MF 9.01) do (MF 27.26), podczas gdy dla szczepów wzorcowych, odpowiednio (MF21.2; szczep wrażliwy) i 6.07 (MF 4.6;

4 szczep oporny) Ani na podstawie oznaczeń wiązania wankomycyny ani na podstawie wartości MIC dla tego antybiotyku wśród badanych szczepów nie stwierdzono szczepów opornych (VRE). Jednak obniżone wiązanie antybiotyku pozwoliło na stwierdzenie heterogennej oporności. Zarówno w oznaczeniach oporności na penicylinę jak i wankomycynę mediana fluorescencji przypadająca na pojedyncza komórkę okazała sie doskonałym estymatorem oporności na badany antybiotyk, a zastosowanie fluorescencyjnych antybiotyków szybkim i efektywnym sposobem oznaczania lekooporności. Kolejnym etapem moich badań było określenie ekspresji genu warunkującego oporność enterokoków na antybiotyki β-laktamowe (PBP5). Changes of PBP5 Gene Expression in Enterococcal Isolates from Renal Transplantation Recipients Ze względu na zwiększone ryzyko zakażeń wywołanych przez enterokoki u osób w immunosupresji, celem badań było ocena czy immunosupresja wpływa na ekspresję białka PBP5. Badania przeprowadzono metodą fluorescencji in situ (FISH), na podstawie wiązania się sondy fluorescencyjnej z matrycowym RNA badanego genu. Objęto nimi grupę szczepów izolowanych od pacjentów po przeszczepie nerki oraz grupę kontrolną, jaką stanowiły szczepy izolowane od zdrowych ochotników. Podobnie jak w przypadku badań fenotypowych, wynik tej reakcji był odczytywany w cytometrze przepływowym (modyfikacja FLOW-FISH). Wcześniejsze badania innych autorów wykazały, ze stosowanie metody (FLOW-FISH) do badania ekspresji genów związane jest z pewnymi ograniczeniami. W celu zwiększenia czułości i swoistości metody proponowane są więc modyfikacje sondy, w tym stosowanie sond molecular beacon oraz sond LNA o większym powinowactwie do cząsteczek DNA. Jednak w prowadzonych badaniach inaczej niż w większości dotychczasowych doniesień literaturowych sondy LNA wiązały się z mniejszym odsetkiem komórek kontroli (+) (72.4 %) niż sondy Molecular beacon (99.2 %). Sondy molecular beacon dodatkowo pozwalały na uzyskanie silniejszego sygnału. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdziłem, że ekspresja genu PBP5 jest wyższa u izolatów pochodzących od pacjentów w trakcie immunosupresji. Wartości estymatorów wynosiły odpowiednio 0, 48(FL1/FL3) dla szczepów komensalnych i 3, 09 (FL1/FL3) dla szczepów klinicznych. Wyniki te wykazywały korelacje z wartościami minimalnego stężenia antybiotyku hamującego namnażanie się drobnoustrojów (MIC). Udowodniłem również, że na ekspresje genu PBP5 wpływ ma rodzaj inhibitora kalcyneuryny stosowany w terapii. W obecności cyklosporyny ekspresja PBP5 była wyższa niż pod wpływem działania tacrolimusu. Różnice w ekspresji genów znajdowały też odzwierciedlenie w wartościach

5 MIC. Tym samym można stwierdzić, że terapia z użyciem antybiotyków β-laktamowych będzie bardziej efektywna u chorych otrzymujących tacrolimus niż u leczonych cyklosporyną. Równolegle z badaniami nad lekoopornością, przy użyciu cytometrii przepływowej analizowana była zmienność wybranych cech virulencji enterokoków. W pracy Increased Pheromone ccf10 Expression in Enterococcus faecalis Biofilm Formed by Isolates from Renal Transplant Patients przedstawiłem wyniki badań ekspresji genu (ccf10) kodującego feromon indukujący ekspresje powierzchniowego białka agregacyjnego (ASC10). Białko to uczestniczy w procesie koniugacji bakterii, ale równocześnie zwiększa adhezje bakterii do ludzkich nabłonków. Z tego względu traktowane jest ono, jako czynnik wirulencji. Celem badań było porównanie ekspresji genu, ccf10 w komórkach szczepów komensalnych enterokoków i szczepów izolowanych od pacjentów w immunosupresji. Do badań, podobnie jak w przypadku genu PBP5 użyta została metoda FLOW-FISH. Jako referencyjny został użyty gen kodujący dehydrogenazę glukozy. Stwierdziłem, że w odróżnieniu do genu referencyjnego, ekspresja genu ccf10 ulega zwiększeniu w komórkach bakterii tworzących biofilm. Co więcej, ekspresja tego genu wykazywała zależność od pochodzenia szczepu: izolaty z moczu a więc bakterie potencjalnie patogenne wykazywały wyższą ekspresje (FL1 2,87) w porównaniu do szczepów izolowanych z przewodu pokarmowego zdrowych ochotników (FL1 1,62). Zastosowana tutaj metoda FLOW-FISH pozwoliła z powodzeniem na uwidocznienie różnic w ekspresji genów a uzyskane wyniki potwierdzają opisaną uprzednio role białek koniugacyjnych w wirulencji. Badania zróżnicowania w wirulencji enterokoków o różnym pochodzeniu obejmowały również analizę ekspresji samego genu kodującego białka (Does CMV infection impact the virulence of Enterococcus faecalis?). Podobnie jak w przypadku odpowiadającego mu feromonu, również ekspresja genu ASA była zwiększona w biofilmie. W przeprowadzonych badaniach na uwagę zasługuje stwierdzenie współzależności pomiędzy infekcją wirusem cytomegalii (CMV) u pacjenta a wysokim poziomem ekspresji genu ASA u bakterii. Analiza zmienności bakterii pod wpływem feromonu aktywującego koniugację innego, ważnego plazmidu występującego u enterokoków (pad1) przeprowadzono na podstawie agregacji komórek ocenianej w cytometrze przepływowym. Zróżnicowanie agregacji komórek Enterococcus faecalis pad1 [-] pod wpływem feromonu cad1. Do tego celu komórki zabarwiono nieswoiście przy pomocy bezbarwnego substratu (CFDA), który w komórkach żywych bakterii był metabolizowany do fluoryzującego produktu. Otrzymany syntetyczne feromon był dodawany w serii rozcieńczeń do hodowli bakteryjnej. Stwierdzono, że swoista agregacja jest obserwowana jest zgodnie z oczekiwaniami, u szczepów AD1 (+).

6 Równocześnie wykazano zmiany pod wpływem feromonu intensywności metabolizmu i agregacji komórek pozbawionych plazmidu najprawdopodobniej w skutek innego, niż do tej pory opisane, mechanizmu. Prowadzone ta sama metodą badania bezpośredniego oddziaływania komórek dawców i biorców plazmidu pmg Cytometryczna analiza indukcji agregacji szczepów Enterococcus faecalis aph2'(+) przez szczepy aph2'(-) o rożnej częstości nabywania genu aph2 wykazały z kolei, że reakcja szczepów o obniżonej częstości nabywania plazmidów jest słabiej wyrażona. Tym samym możliwa jest, na podstawie przeprowadzonego oznaczenia, ocena prawdopodobieństwa nabywania przez badany szczep nowych genów. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych Poza omówionym powyżej cyklem 6 publikacji wybranych jako podstawa do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego (IF: łącznie 7, 55), mój dotychczasowy dorobek naukowy obejmuje 21 publikacji o łącznej wartości IF 11, 46. W 14 z pośród powyższych publikacji jestem pierwszym autorem. Wg bazy Google Scholar mój indeks Hirscha wynosi 5, liczba cytowań bez autocytowań :49 Po uzyskaniu stopnia doktora rozpocząłem badania obejmujące wirulencje i lekooporności bakterii z rodzaju Enterococcus. W pierwszych latach dotyczyły one częstości występowania genów oporności oraz możliwości rozprzestrzeniania sie tych genów pomiędzy bakteriami. Na podstawie analizy występowania genów kodujących enzymy odpowiedzialne za oporność na antybiotyki aminoglikozydowe (aphia, aphib, aphic, aphid, ant4, APh3) i przeprowadzonej analizie kladystycznej stwierdziłem brak bariery międzygatunkowych w rozprzestrzenianiu się badanych genów pomiędzy enterokokami i gronkowcami. W wyniku badań transferu in vitro dodatkowo wykazałem różnice pomiędzy szczepami w częstości nabywania genów. (Pozycje IID9. IID10, IID11 wykazu literatury) Z kolei badania częstości występowania genów warunkujących oporność enterokoków na tetracykliny (tet) wykazały różnicę pomiędzy szczepami izolowanymi z zakażeń i szczepami komensalnymi. Dodatkowo, na podstawie sekwencji badanych genów pozwoliła na wyróżnienie czterech grup homologicznych (SHG), występujących z częstością zależna od pochodzenia szczepu (pozycja IID5 wykazu literatury). Badania molekularne enterokoków pozwoliły mi również na zaproponowanie metody PCR-RFLP do różnicowania szczepów enterokoków. Stosunkowo prosta modyfikacja metody AFLP pozwoliła uzyskać narzędzie, które może być użyte w większości laboratoriów a jednocześnie dostarcza wyniki

7