(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C12P 7/ (06.01) C12N 9/36 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/28 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Komplementacja sekretomu Trichoderma reesei ograniczająca skażenie mikrobiologiczne w kontekście fermentacyjnego wytwarzania etanolu () Pierwszeństwo: FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: 06.. w Europejskim Biuletynie Patentowym nr / (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/12 (73) Uprawniony z patentu: IFP Energies nouvelles, Rueil Malmaison, FR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 NICOLAS LOPES FERREIRA, Croisilles, FR ANTOINE MARGEOT, Paris, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP. Z O.O. SKR. POCZT Warszawa 1 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 EP B1 V06PL00/MM Opis Dziedzina wynalazku [0001] Ten wynalazek wpisuje się w ramy procesu określanego jako sposób drugiej generacji wytwarzania etanolu z biomasy lignocelulozowej, obejmującego etapy obróbki wstępnej substratu celulozowego lub lignocelulozowego, hydrolizy enzymatycznej wstępnie traktowanego substratu, a następnie fermentacji alkoholowej uzyskanego hydrolizatu. Opracowanie uprzedniego stanu wiedzy [0002] Biomasa lignocelulozowa stanowi jedno ze źródeł odnawialnych najbardziej obfitych na ziemi i z pewnością jedno z najmniej kosztownych. Rozważane substraty są bardzo różne, ponieważ dotyczą zarówno substratów ligninowych (liściastych i iglastych), produktów ubocznych rolnictwa (słoma) lub tych gałęzi przemysłu, które generują odpady lignocelulozowe (przemysł rolniczo-spożywczy, papierniczy). [0003] Biomasa lignocelulozowa składa się z trzech głównych polimerów: celulozy (3 do 0%), hemicelulozy ( do %), która jest polisacharydem zasadniczo złożonym z pentoz i heksoz oraz ligniny (1 do 2%), która jest polimerem o złożonej budowie i o wysokim ciężarze cząsteczkowym, złożonym z alkoholi aromatycznych połączonych wiązaniami eterowymi. [0004] Te różne cząsteczki są odpowiedzialne za właściwości ściany komórki roślinnej i są zorganizowane w złożony sposób. [000] Celuloza i ewentualnie hemicelulozy są celami hydrolizy enzymatycznej, ale nie są bezpośrednio dostępne dla enzymów. Z tej przyczyny te substraty muszą być wstępnie traktowane przed etapem hydrolizy enzymatycznej. Celem wstępnego traktowania jest modyfikacja właściwości fizycznych i fizykochemicznych materiału lignocelulozowego w celu poprawienia dostępności do celulozy umieszczonej w matrycy z ligniny i hemicelulozy. Może też uwalniać cukry zawarte w hemicelulozach w postaci monomerów, zasadniczo pentozy, jak ksyloza i arabinoza, i heksozy jak galaktoza, mannoza i glukoza. [0006] Idealnie wstępna obróbka powinna być szybka i skuteczna, z wysokim stężeniem substratów, a straty materiału powinny być minimalne. Istnieją liczne dostępne technologie: można zacytować gotowanie z kwasem, gotowanie z zasadą, tzw. Steam explosion (Pourquie, J. i Vandecasteele, J.P. (1993) Conversion de la biomasse lignocellulosique par hydrolyse enzymatique et fermentation. Biotechnologie, 4. wydanie, Rene Scriban, coordinateur Lavoisier TEC & DOC, Paris, ), procedury organosolv, lub też technologie bivis łączące działania termiczne, mechaniczne i chemiczne (Ogier J.-C. i wsp. (1999) Production d'ethanol à partir de biomasse lignocellulosique Oil & Gas Science and Technology 4:67-94). Wydajność wstępnej obróbki mierzy się podatnością pozostałości celulozowej na hydrolizę i stopniem odzyskania hemiceluloz. Z ekonomicznego punktu widzenia, wydaje się korzystne by wstępna obróbka prowadziła do całkowitej hydrolizy hemiceluloz tak, aby odzyskać pentozy i ewentualnie oddzielnie utylizować frakcję celulozową. Wstępna obróbka kwasem w łagodnych warunkach i przez Steam explosion dobrze pasują. Pozwalają na znaczne odzyskanie cukrów z hemiceluloz i dobrą dostępność celulozy do hydrolizy. [0007] Uzyskana pozostałość celulozowa jest hydrolizowana na drodze enzymatycznej przez zastosowanie enzymów celulolitycznych i/lub hemicelulolitycznych. Mikroorganizmy, takie jak grzyby należące do rodzajów Trichoderma, Aspergillus, Penicillium lub Schizophyllum, lub bakterie beztlenowe należące, na przykład, do 1

3 EP B1 V06PL00/MM rodzaju Clostridium, produkują te enzymy, zawierające w szczególności celulazy i hemicelulazy, przystosowane do całkowitej hydrolizy celulozy i hemiceluloz. [0008] Hydrolizę enzymatyczną przeprowadza się w warunkach łagodnych (temperatura rzędu 4-0 C i ph 4,8) i jest skuteczna. Za to o ile chodzi o sam proces, koszt enzymów pozostaje bardzo wysoki. Z tego powodu przeprowadzono wiele prac by obniżyć ten koszt: i) po pierwsze zwiększenie produkcji enzymów, przez wybór nadprodukujących szczepów i przez poprawienie procedury fermentacji, ii) następnie zmniejszenie ilości enzymów w hydrolizie przez optymalizacje fazy wstępnej obróbki lub poprawienie aktywności specyficznej tych enzymów. W czasie ostatniej dekady, główne prace polegały na zrozumieniu mechanizmów działania celulaz i wyrażania enzymów, aby spowodować wydzielanie kompleksu enzymatycznego najbardziej odpowiedniego do hydrolizy substratów lignocelulozowych modyfikując szczepy za pomocą narzędzi biologii molekularnej. [0009] Grzyby nitkowate jako organizmy celulolityczne są bardzo interesujące dla przemysłu, ponieważ mają zdolność do produkcji enzymów zewnątrzkomórkowych w bardzo dużych ilościach. Najpowszechniej wykorzystywanym mikroorganizmem do produkcji celulaz jest grzyb Trichoderma reesei. Szczepy dzikie mają zdolność produkowania w obecności indukującego substratu, na przykładcelulozy, sekretomu (zbiór wydzielanych białek) przystosowanego do hydrolizy celulozy. Enzymy kompleksu enzymatycznego zawierają trzy główne typy aktywności: endoglukanazy, egzoglukanazy i β-glukozydazy. Inne białka mające właściwości niezbędne do hydrolizy materiałów lignocelulozowych są także produkowane przez Trichoderma reesei, na przykład, ksylanazy. Obecność indukującego substratu jest niezbędna do wyrażania enzymów celulolitycznych i/lub hemicelulolitycznych. Natura węglowego substratu ma silny wpływ na skład kompleksu enzymatycznego. W przypadku ksylozy, która połączona z węglowym substratem indukującym, takim jak celuloza lub laktoza, pozwala na znaczące polepszenie aktywności określonej tu jako aktywność ksylanazy. [00] Techniki genetyki klasycznej przez mutagenezę pozwoliły na wybranie nadprodukujących celulazy szczepów Trichoderma reesei, takich jak szczepy MCG77 (Gallo - patent US ), MCG 80 (Allen, A.L. i Andreotti, R.E., Biotechnol-Bioengi 1982, 12, ), RUT C (Montenecourt, B.S. i Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, ) i CL847 (Durand i wsp., 1984, Proc. Colloque SFM "Genetique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT red, pp 39-0). Ulepszenia umożliwiły uzyskanie szczepów nadprodukujących, mniej wrażliwych na represję kataboliczną na monomerycznych cukrach w szczególności, na przykład na glukozie, niż szczepy dzikie. [0011] Rozpowszechnienie technik genetycznych mających na celu ekspresję genów heterologicznych w tych szczepach grzybów, także otworzyło drogę do zastosowania tych mikroorganizmów jako gospodarzy do produkcji przemysłowej. Nowe techniki badania profili enzymatycznych umożliwiły stworzenie szczepów grzybów, które są bardzo wydajnymi gospodarzami do wytwarzania zrekombinowanych enzymów na skalę przemysłową [Nevalainen, H. i Teo, V.J.S. (03) Enzyme production in industrial fungi-molecular genetic strategies for integrated strain improvement. W Applied Mycology and Biotechnology (tom 3) Fungal Genomics (Arora, D.K. i Kchachatourians, G.G., red.), str , Elsevier Science]. Jednym z przykładów tego typu modyfikacji jest produkcja celulaz pochodzących ze szczepu T. reesei [Harkki, A. i wsp. (1991) Genetic engineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulase profiles. Enzyme Microb. Technol. 13, ; Karhunen, T. i wsp. (1993) High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241, 1-22]. [0012] Cukrami uzyskanymi przez hydrolizę biomasy lignocelulozowej są pentozy (głównie ksyloza i arabinoza), disacharydy (celobioza) i glukoza. Ta ostatnia jest łatwo przekształcana do etanolu przez 2

4 EP B1 V06PL00/MM drożdże S. cerevisiae stosowane przez wszystkie gałęzie przemysłu alkoholowego. Obecnie żaden inny mikroorganizm nie osiąga ich wyników na glukozie w warunkach niesterylnych, a mianowicie wydajności rzędu 0,47 g etanolu na gram glukozy, produktywności wyższej lub równej g/l godz., i końcowego stężenia etanolu bliskiego % objętościowo. S. cerevisiae wykazuje liczne dodatkowe zalety wynikające z wielu lat selekcji: oporność na etanol, łatwe stosowanie w przemyśle, itd. Z drugiej strony pentozy są rzadko fermentowane przez mikroorganizmy, a gdy są, wyniki są nieszczególne. W tych ostatnich latach wiele prac dotyczyło poszukiwań i/lub poprawy szczepów aktywnie fermentujących pentozy do etanolu. Badano cztery typy mikroorganizmów: drożdże naturalnie fermentujące pentozy, zrekombinowane szczepy S. cerevisiae, bakterie termofilne lub mezofilne wykorzystujące pentozy. [0013] Fermentacja alkoholowa w warunkach niesterylnych stwarza poważne ryzyko skażeń fermentora przez mikroorganizmy oportunistyczne. Źródła skażeń mogą być żywe lub nieżywe. Jednak zajmiemy się tu tylko żywymi źródłami skażeń. Wśród tych źródeł znajdują się głównie drożdże i bakterie. Te mikroorganizmy wykorzystują obecne składniki odżywcze, w tym źródło węgla, i są odpowiedzialne za powstawanie niepożądanych produktów dodatkowych, takich jak kwas mlekowy, kwas octowy lub nawet aceton i butanol. Te rodzaje mikroorganizmów spotyka się wszędzie, gdzie warunki pozwalają na ich wzrost, to znaczy w obecności minimum składników odżywczych. Należy tu wymienić, jako ich wymagania pokarmowe: źródło węgla (na ogół cukry), źródło aminokwasów (składniki białek), pewne witaminy i mikroelementy. [0014] Dodatkowo, w obrębie rozpatrywanych wyjściowych materiałów energetycznych, na przykład, słomy pszenicy, jest całkiem prawdopodobne znalezienie mikroorganizmów zdolnych do skażenia tego procesu. [001] Tak więc w obecnym niesterylnym sposobie drugiej generacji wytwarzania etanolu dwa etapy są podatne na ewentualne skażenie mikrobiologiczne: etap hydrolizy enzymatycznej i etap fermentacji. Obecnie znane rozwiązania zwalczania skażenia polegają na obniżeniu ph do wartości sprzyjającej rozwojowi drożdży ze szkodą dla bakterii kwasu mlekowego. Jednak drożdże są mniej aktywne w tych kwaśnych ph. Inną możliwością jest wprowadzanie inhibitorów skażeń bakteryjnych, jak na przykład fluoru, antybiotyków lub siarczynów, w czasie etapu fermentacji alkoholowej. Faktycznie to na tym etapie stężenie skażeń jest najwyższe. Stosowanie klasycznych środków przeciwbakteryjnych jest stosunkowo kosztowne i wymaga przeprowadzania dość częstego restartowania procesu fermentacji. [0016] Ograniczenie ryzyka skażeń stanowi potencjalny zysk czasu i pieniędzy dla procesów przemysłowych o tak dużej skali i nie należy zaniedbać żadnego rozwiązania, by zapobiec temu problemowi. [0017] Skażenie bakteryjne jest faktycznie głównym problemem w czasie wytwarzania etanolu przez fermentację. Bakterie są naturalnie obecne w urządzeniu produkcyjnym i wykorzystują składniki odżywcze obecne w podłożu, współzawodnicząc więc w efekcie z drożdżami stosowanymi w tej procedurze. Wzrost i żywotność komórek drożdży ulegają więc poważnemu wpływowi obecności tych bakterii i ostateczna wydajność alkoholu jest przez to także obniżona. [0018] Ogólnie bakterie kwasu mlekowego fermentują cukry obecne w brzeczkach fermentacyjnych i warunki beztlenowe sprzyjają ich wzrostowi. Rozwijają się na ogół w ph, ale mogą przeżywać w ph tak niskim jak 3,0. Te bakterie oportunistyczne mogą się rozwijać w szerokim zakresie temperatur i tolerują wysokie stężenia alkoholu w podłożu. Obecność bakterii w procesach drugiej generacji wytwarzania etanolu powinna być wykluczona. Każde ulepszenie procesu prowadzące do maksymalnego ograniczenia tego skażenia jest do rozważenia. 3

5 EP B1 V06PL00/MM Opis figur [0019] Figura 1 przedstawia schematycznie mapę plazmidu, który może być stosowany do heterologicznej ekspresji genu h/z przez T. reesei w warunkach indukcji celulaz. Streszczenie wynalazku [00] W niniejszymwynalazku opisano proces wytwarzania etanolu z biomasy lignocelulozowej, w którym uzupełnia się genom Trichoderma reesei lizozymu. Szczegółowy opis wynalazku [0021] W procesie drugiej generacji wytwarzania etanolu opisanym w tym wynalazku, aby zapobiec skażeniom mikrobiologicznym stosuje się do produkcji enzymów celulolitycznych i/lub hemicelulolitycznych szczep modyfikowanego genetycznie grzyba należący do rodzaju Trichoderma i nadwyrażający lizozym, za pomocą technik genetycznych dobrze znanych specjalistom w dziedzinie. [0022] Szczep grzyba (mikroorganizm celulolityczny) należy korzystnie do gatunku Trichoderma reesei. [0023] Stosowanie lizozymu, który jest białkiem mającym właściwości przeciwbakteryjme, pozwala na zapewnienie ochrony przed szerokim spektrum bakterii Gram-dodatnich, w szczególności przed bakteriami kwasu mlekowego. Te bakterie rozwijają się w procesach drugiej generacji wytwarzania etanolu już na etapie hydrolizy enzymatycznej i głównie w czasie fermentacji alkoholowej, ponieważ temperatura w czasie tego etapu jest rzędu do 3 C. [0024] Dodatkowo, fakt bezpośredniego uzupełnienia genomu Trichoderma reesei lizozymem pozwala na uniknięcie wprowadzania zewnętrznego czynnika bakteriobójczego do procesu wytwarzania etanolu, ponieważ szczep ten jest tym szczepem, który jest stosowany do hydrolizy enzymatycznej. [002] Bardziej korzystnie lizozymem stosowanym do uzupełnienia genomu Trichoderma reesei jest lizozym ludzki lub kurzy. [0026] Lizozym jest enzymem typu hydrolazy (kwaśnej i wydzielanej przez leukocyty), odkrytym przez Aleksandra Fleminga w Jest to globularne białko składające się z 129 aminokwasów, które znajduje się w pewnych wydzielinach (łzy, ślina..). Może także być ekstrahowany z białka jaja, co charakteryzuje jego stosowanie w enologii. Stosowany od szeregu lat w przemyśle farmaceutycznym i rolno-spożywczym, jest dodawany od niedawna w pewnych procesach enologii (na przykład dojrzewanie wina) w celu opanowania skażenia bakteriami kwasu mlekowego. Ten enzym działa degradując ich ściany (hydroliza wiązań kowalencyjnych między kwasem N-acetylomuraminowym i czwartym atomem węgla N- acetyloglukozoaminy). Z biochemicznego punktu widzenia, lizozym ma optymalną aktywność między i 4 C, co jest całkowicie zgodne z temperaturami stosowanymi do hydrolizy enzymatycznej, i może pozostawać aktywny do 62 C. O ile chodzi o optymalne ph, aktywność enzymatyczna tego białka nie jest lub w niewielkim stopniu jest zmieniana w zakresie ph zawartym między 3, i 7, ale może ono pozostawać aktywne pomiędzy 2 i. [0027] Lizozym jest także stosowany jako konserwant w wielu produktach spożywczych, które prawdopodobnie zawierają bakterie kwasu mlekowego, jak sery, tofu lub sake. Stosowanie lizozymu w procesach browarniczych niedawno zwróciło na siebie uwagę i zastosowania w etapach warzenia brzeczki 4

6 EP B1 V06PL00/MM są liczne. Lizozym jest skuteczny przeciw wszystkim bakteriom kwasu mlekowego. Dodatkowo, drożdże i bakterie Gram-ujemne nie są atakowane przez ten czynnik zwalczający mikroorganizmy. [0028] Lizozym ma także zaletę ograniczania stosowania SO 2, produktu obecnie bardzo często stosowanego do ograniczania skażeń mikrobiologicznych w procesach przemysłowych, ale kosztownego. Lizozym może też odgrywać rolę ochronną w przypadku trudnego końca fermentacji. Rzeczywiście niedobory azotu sprawiają, że koniec fermentacji alkoholowej jest trudny z ryzkiem rozwoju bakterii kwasu mlekowego, które degradują jeszcze niesfermentowane cukry. Dodatek lizozymu pozwala na zapobieganie lub traktowanie tego typu problemów, z wielką skutecznością. [0029] W przypadku sposobu wytwarzania etanolu na drodze biologicznej według wynalazku, główna zaleta polega na fakcie, że lizozym jest białkiem, które może być bezpośrednio wyrażane przez Trichoderma reesei. [00] Ekspresja heterologiczna ludzkiego lizozymu została opracowana w grzybie nitkowatym Tolypocladium geodes (Michel Baron "Optimisation au niveau moleculaire de souches transformees de Tolypocladium geodes pour la secretion de deux proteines humaines d'interêt therapeutique, (1991), rozprawa doktorska na uniwersytecie Paul Sabatier). [0031] Wobec komplementacji genomu T. reesei przez gen h/z wyrażający lizozym, przeprowadzono modelową konstrukcję plazmidu stosując klasyczne metody biologii molekularnej znane specjaliście w dziedzinie. Konstrukt genetyczny do wintegrowania do genomu T. reesei obejmuje sekwencję kodującą ludzkiego lizozymu wstawioną między elementami pozwalającymi na jego ekspresję i jego sekrecję w grzybie. W kontekście łącznej produkcji z celulazami, sekwencje nukleotydowe powinny pozwolić na ekspresję heterologiczną genu h/z. Promotor, sekwencja sygnalna i terminator otaczające ten gen powinny więc zawierać jeden lub więcej motywów znanych specjaliście w dziedzinie jako biorących udział w specyficznej indukcji tych enzymów. W szczególności stosowany promotor grzybowy może być wybrany, w sposób nie wykluczający, spośród następujących: gpd (A. nidulans), cbh1, eg/1, eg/2, xyn1. Grzybowa sekwencja sygnalna może być wybrana, na przykład, spośród cbh1, eg/1, eg/2, xyn1. Może być stosowana fuzja lizozymu z innym białkiem ułatwiającym eksport (na przykład Sh-Ble), jak opisano w rozprawie M. Baron. Terminator grzybowy może mieć dowolną naturę, na przykład cbh1 lub TrpC (A. nidulans). [0032] Konstrukt powinien w końcu umożliwić identyfikację szczepu, który wbudował ten gen lizozymu. W tym celu szereg genów, nadających oporność na antybiotyk (fleomycyna, higromycyna itd.) lub pozwalających na wykrycie na podstawie auksotrofii (gen amds dla acetamidu), jest znanych specjaliście w dziedzinie i mogą być one stosowane dla przemysłowych szczepów T. reesei. [0033] Przykład konstruktu plazmidowego pozwalającego na tę ekspresję jest opisany na Fig. 1. Na tej figurze są stosowane następujące napisy: "Prom" oznacza promotor, "Term" terminator, "bact" bakterię, "ss + HLZ" gen kodujący lizozym z funkcjonalną sekwencją adresowania działającą w T. reesei, "Sh ble" dla genu nadającego oporność na antybiotyk fleomycynę. [0034] Tak uzyskany konstrukt pozwala na selekcję transformanta dzięki włączeniu następnie do genomu szczepu grzyba już stosowanego do produkcji celulaz, na przykład, szczepu nadprodukującego CL847 (Durand i wsp., 1984), według procedur już opisanych i dobrze znanych specjaliście w dziedzinie, na przykład opisanych przez Penttila i wsp. (1987). [003] Uzyskane transformanty są selekcjonowane na silną aktywność lizozymu, według metody opisanej uprzednio przez M. Baron (1991, rozprawa doktorska, Uniwersytet Paul Sabatier, Tuluza).

7 EP B1 V06PL00/MM [0036] Wybrany szczep wydziela oprócz enzymów celulolitycznych część lizozymu między 1 i % wydzielin białkowych szczepu, co w kontekście typowej hydrolizy enzymatycznej, na przykład przeprowadzanej z mg/g substratu i % suchej masy, pozwala na stężenie lizozymu w reakcji hydrolizy zawarte w zakresie między i 0 mg/l, które są proporcjami powszechnie stosowanymi w przemyśle dla zapobiegania skażeniom przez bakterie kwasu mlekowego. [0037] Enzymy wytwarza się następnie według klasycznego procesu, który może mieć dowolny charakter. Enzymy rozdziela się i stosuje do reakcji hydrolizy, jak opisano uprzednio. Żadne inne środki ostrożności nie są wymagane, aby uniknąć skażeń bakteryjnych dla reszty procesu, w przeciwieństwie do tego, co należy zrobić ze szczepem klasycznym. [0038] Działanie czynnika bakteriobójczego jest tym bardziej skuteczne, ponieważ stężenie bakterii kwasu mlekowego w podłożu jest niskie. W sposobie według wynalazku, czynnik bakteriobójczy lizozym jest wytwarzany przez mikroorganizm stosowany do wydzielania enzymów użytych na etapie hydrolizy enzymatycznej. Obecnie na tym etapie procedury, ze względu w znacznej mierze na warunki temperaturowe, namnażanie bakterii kwasu mlekowego pozostaje mało prawdopodobne lub ograniczone, w porównaniu z tym, które ma miejsce podczas następnego etapu fermentacji alkoholowej. [0039] Materiały celulozowe lub lignocelulozowe stosowane w sposobie według wynalazku są wybrane spośród słomy, drewna, upraw leśnych, pozostałości roślin alkohologennych, cukierniczych i zbożowych, pozostałości z przemysłu papierniczego i produktów transformacji materiałów celulozowych i lignocelulozowych. [00] Materiał do hydrolizy jest umieszczany w zawiesinie w fazie wodnej w ilości 6 do 2% suchej masy, korzystnie do %, ph jest ustawiane między 4 i, (korzystnie pomiędzy 4, i,2), a temperatura między i 60 C (korzystnie między 4 i 0 C). Reakcja hydrolizy trwa na ogół od 1 do 48 godzin w zależności od skuteczności przeprowadzonej obróbki wstępnej, składu koktajlu enzymatycznego i ilości dodanych enzymów. Po reakcji następuje miareczkowanie uwolnionych cukrów. Uzyskany roztwór cukru jest następnie oddzielany od frakcji niezhydrolizowanej za pomocą sączenia lub wirowania, następnie jest stosowany do fermentacji etanolowej. Etap fermentacji etanolowej przeprowadza się według ogólnej wiedzy specjalisty w dziedzinie, w obecności drożdży, jak na przykład Saccharomyces cerevisiae lub Zymomonas mobilis, przy czym optymalna temperatura fermentacji jest na ogół zawarta między -3 C. [0041] Według tego wynalazku zastosowanie do produkcji enzymów celulolitycznych i/lub hemicelulolitycznych szczepu Trichoderma reesei modyfikowanego genetycznie i nadwyrażającego co najmniej jedno zewnątrzkomórkowe białko może być przeprowadzone w procesie, w którym etap hydrolizy enzymatycznej jest odrębny od etapu fermentacji. [0042] Według innego wykonania, sposób według wynalazku jest sposobem SSF (saccharification et fermentation simultanees = równoczesne scukrzanie i fermentacja) polegającym na przeprowadzeniu hydrolizy i fermentacji alkoholowej w jednym etapie. W tym przypadku, temperatura robocza jest stosunkowo niska (około 34 C) i w efekcie bardziej podatna na skażenie bakteriami. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania etanolu z materiałów celulozowych lub lignocelulozowych obejmujący etapy wstępnej obróbki substratu celulozowego lub lignocelulozowego, hydrolizy enzymatycznej wstępnie traktowanego substratu, a następnie fermentacji alkoholowej uzyskanego hydrolizatu, w którym do produkcji 6

8 EP B1 V06PL00/MM enzymów celulolitycznych i/lub hemicelulolitycznych stosuje się modyfikowany genetycznie szczep grzyba należący do rodzaju Trichoderma i nadwyrażający lizozym. 2. Sposób według zastrz. 1, w którym szczep grzyba należy do gatunku Trichoderma reesei. 3. Sposób według jednego z uprzednich zastrzeżeń, w którym materiały celulozowe lub lignocelulozowe są wybrane spośród słomy, drewna, upraw leśnych, pozostałości roślin alkohologennych, cukiernicznych i zbożowych, pozostałości z przemysłu papierniczego i produktów transformacji materiałów celulozowych i lignocelulozowych. 4. Sposób według jednego z uprzednich zastrzeżeń, w którym etap hydrolizy enzymatycznej przeprowadza się w temperaturze zawartej między i 60 C i ph w zakresie od 4 -,. Sposób według jednego z uprzednich zastrzeżeń, w którym po etapie hydrolizy enzymatycznej następuje etap fermentacji etanolowej. 6. Sposób według jednego z uprzednich zastrzeżeń 1 do 4, w którym etap hydrolizy enzymatycznej i fermentacji etanolowej przeprowadza się równocześnie. 1 7

9 EP B1 V06PL00/MM Figura 1 Prom bakt

10 EP B1 V06PL00/MM Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 9