(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 14/20 ( ) G01N 33/569 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/23 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Polipeptydy i sposoby swoistego wykrywania przeciwciał u pacjentów z zakażeniem krętkami Borrelia (30) Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/25 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/11 (73) Uprawniony z patentu: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG, Lübeck, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 LARS KOMOROWSKI, Ratzeburg, DE CHRISTIAN PROBST, Ratzeburg, DE ANTHONINA JANSSEN, Schiphorst, DE WINFRIED STOECKER, Gross Grönau, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Teresa Sztandke PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydów OspC ("Outer surface Protein C") pochodzących z bakterii rodzaju Borrelia, w szczególności białka określonego w zastrzeżeniu 1, które zawiera pierwszy polipeptyd OspC, przy czym pierwszy polipeptyd OspC jest połączony z drugim polipeptydem OspC przez mostek dwusiarczkowy. Wynalazek dotyczy również sposobu wykrywania przeciwciał przeciwko OspC określonego w zastrzeżeniu 10 i sposobu wykrywania zakażenia krętkami Borrelia określonego w zastrzeżeniu 11, w którym stosowane jest białko według wynalazku, jak również zestawu diagnostycznego określonego w zastrzeżeniu 13 i szczepionki przeciwko krętkom Borrelia określonej w zastrzeżeniu 15. Stan techniki: [0002] Bakterie z rodzaju Borrelia są opisane jako czynniki chorobotwórcze kilku schorzeń ludzkich, w szczególności jako czynniki chorobotwórcze boreliozy z Lyme i gorączki nawrotowej. Obecnie zakażenie wykrywane jest zwykle za pomocą oznaczania przeciwciał swoistych względem bakterii obecnych w ludzkich lub zwierzęcych płynach ustrojowych. W tym kontekście, obecność swoistych przeciwciał przeciw antygenom, które występują tylko w krętkach Borrelia, wskazuje na zakażenie krętkami Borrelia. Wczesne fazy zakażenia, w szczególności świeże zakażenia do czterech tygodni po pierwotnym kontakcie, charakteryzują się obecnością przeciwciał klasy IgM, w szczególności przeciwko antygenom OspC, p41 (flagellina) i P39 (BmpA), podczas gdy fazom późniejszym, w szczególności zakażeń, które minęły, zostały wyleczone lub są manifestowane przewlekle, towarzyszy obecność przeciwciał klasy IgG, w szczególności przeciwko antygenom VlsE, P83/P100, P58, OspA, p41 (flagellina), P39, P18 i innym (Wilske i Fingerle, 2005). [0003] Wczesna diagnoza choroby jest szczególnie ważna, ponieważ leczenie antybiotykami jest skuteczniejsze i łatwiejsze w stadiach początkowych niż w stadiach późnych, w ten sposób, np. we wczesnej fazie możliwe jest jeszcze doustne leczenie antybiotykami. [0004] Przeciwciała przeciwko OspC klasy IgM są zasadniczo najważniejszym markerem wczesnej fazy zachorowania. W przypadku natywnego OspC chodzi o acylowane kwasem tłuszczowym białko błonowe z rodziny lipoprotein 6, które jest zakotwiczone w błonie komórkowej (Norris i wsp., 1992;.Hagman i wsp., 1998). W czasie ekspresji, równolegle do cięcia sekwencji sygnałowej przez peptydazy sygnałowe II, reszta acylowa jest przyłączana do jedynej konserwowanej cysteiny występującej w sekwencji aminokwasowej OspC (Wu i Tokunaga, 1986). Służy ona do zakotwiczenia w błonie komórkowej zawierającej lipidy. [0005] Konserwowany C-końcowy peptyd składający się z dziesięciu reszt aminokwasowych, którego końcowa grupa karboksylowa musi być łatwo dostępna, jest na ogół uważany za najważniejszy epitop w obrębie OspC dla reakcji z ludzkimi przeciwciałami klasy IgM (Mathiesen i wsp.,1998a;. Mathiesen i wsp., 1998b), co także wskazano w opisie patentowym PCT WO Ponadto opisano epitopy w słabo konserwowanym regionie centralnym OspC (Earnhart i wsp. 2005). [0006] W celu wykrycia przeciwciał, oczyszczone antygeny z krętków Borrelia są regularnie stosowane w testach immunochemicznych, takich jak ELISA, blotting liniowy lub Western blot. Zwykle w metodach jeden lub kilka antygenów związanych z fazą stałą kontaktuje się z płynem ustrojowym, który ma być 1

3 analizowany i związane przeciwciała wykrywa się za pomocą cząsteczki reporterowej. Tego typu zestawy są rozprowadzane np. przez EUROIMMUN AG jako EUROLINE-WB i Anti-Borrelia-plus-VlsE-ELISA. Podobne metody opisano w literaturze (Hansen i wsp., 1988;. Cutler i Wright, 1989;. Fister i wsp., 1989). [0007] Metody, które są oparte na preparatach nie-rekombinowanych mogą być odtwarzane tylko przy wysokich nakładach i są w związku z tym kosztowne, ponieważ zasadniczo w hodowli in vitro krętków Borrelia stosowane są złożone pożywki, które zawierają składniki naturalne, których składowe nie są zdefiniowane chemicznie, takie jak bogate w białka frakcje surowicy ssaczej i złożone mieszaniny białkowe, np. poddane obróbce proteolitycznej ekstrakty mięśni, ekstrakty drożdżowe lub żelatyna. Dostępny w handlu zestaw oparty na tej zasadzie można pozyskać np. z Sigma Aldrich (Complete BSK- H). Podobne kompozycje zostały opisane w literaturze pod oznaczeniami MKP i BSK II (Ruzic-Sabljic i Strle, 2004). [0008] Niestety, chemicznie niezdefiniowane składniki tych pożywek podlegają znacznym różnicom w składzie w zależności od partii, niosą ryzyko zanieczyszczenia wirusami lub mykoplazmami i są kosztowne w wytwarzaniu. W związku z powyższym, krętki Borrelia hodowane in vitro zwykle wykazują znaczne różnice w tempie wzrostu i wzorze ekspresji genów, w zależności od poszczególnych zastosowanych pożywek hodowlanych lub w zależności od poszczególnych składników poszczególnych zastosowanych pożywek hodowlanych. Szczególnie wpływa to na geny, które są eksprymowane w warunkach in vivo, w zależności od konkretnego organizmu gospodarza (Pollack i wsp., 1993; Yang i wsp., 2001). Odnosi się to w szczególności do OspC. Ponadto decydujący wpływ na rodzaj i ilość eksprymowanego białka mają także temperatura hodowli, jak również stężenie tlenu i dwutlenku węgla (Seshu i wsp., 2004;.Hyde i wsp., 2007). W rezultacie, w szczególności wyniki z różnych laboratoriów, w których hoduje się krętki Borrelia, niezbyt nadają się do porównania między sobą. [0009] Metody, które są oparte na poszczególnych oczyszczonych antygenach z krętków Borrelia hodowanych in vitro, są ponadto podatne na nieswoiste reakcje wywołane obecnością dodatkowych zanieczyszczeń, których poziom nie został odpowiednio obniżony. W szczególności w metodach, które tylko generują sygnał, jak na przykład ELISA lub blotting liniowy, regularnie uzyskuje się wyniki fałszywie dodatnie. Natomiast metody Western blot, które omijają ten problem przez lokalny rozdział sygnału, mają tę wadę, że generują znaczny dodatkowy koszt, ze względu na niezbędną elektroforezę i transfer na membranę. [0010] W innych metodach, zastosowanie znajdują antygeny, które są wytwarzane technikami rekombinacji, np. przez heterologiczną ekspresję antygenów lub fragmentów antygenowych w E. coli, jak przytoczono np. w europejskim opisie patentowym EP Wariantami dostępnymi w handlu są np. EUROLINE-WB oraz Anti-Borrelia-plus-VlsE-ELISA (IgG) i recomline Borrelia IgM (Mikrogen). Podobne metody zostały opisane w literaturze (Hauser i wsp., 1998;. Lawrenz i wsp., 1999;. Wilske i Fingerle, 2005). Ogólnie, antygeny rekombinowane mają tę zaletę, że można je oczyszczać w sposób bardziej zdefiniowany i przy niższych nakładach niż antygeny natywne, np. przez fuzję z polipeptydami do oczyszczania, np. ogonem polihistydynowym (= znacznik His). [0011] Heterologiczna ekspresja w E. coli OspC wraz z jego wewnętrzną sekwencją sygnałową i następująca po tym acylacja jest możliwa, ale prowadzi do niskiej wydajności ekspresji (Fuchs i wsp., 1992). Z tego powodu, powszechnie stosowane są konstrukty delecyjne OspC ze zwiększoną wydajnością ekspresji, w których brakuje co najmniej sekwencji sygnałowej. W związku z tym, w stanie techniki, delecji poddaje się co najmniej pierwszych 19 aminokwasów OspC, wraz z cysteiną, która 2

4 występuje w sekwencji aminokwasowej OspC, (Fuchs i wsp., 1992; Wilske i wsp., 1993; Wilske i wsp., 1995; Eicken i wsp., 2001; Kumaran i wsp., 2001), a w niektórych przypadkach uzupełnia N-końcową fuzją z heterologicznymi polipeptydami, np. ze znacznikiem His. [0012] Takie N-terminalnie skrócone warianty stosowano również do wyjaśnienia struktury przestrzennej OspC (Kumaran i wsp., 2001; Eicken i wsp., 2001). W tym celu, w rekombinowanych wariantach OspC pierwsze 31 (Eicken wsp., 2001) lub 37 (Kumaran i wsp., 2001) reszty aminokwasowe OspC poddano delecji w szczególności w celu otrzymania odpowiedniej ilości i czystości OspC. Dwie przykładowe struktury przestrzenne wskazują, że rekombinowany OspC wykazuje skłonność do dimeryzacji. Ta dimeryzacja przebiega dzięki oddziaływaniom jonowym i mostkowym wiązaniom wodorowym, ale nie przez połączenie kowalencyjne. [0013] Znane są również próby wytworzenia acylowanych wariantów OspC rekombinacyjnie przez wstawienie przed nią heterologicznej sekwencji sygnałowej, jak opisano np. w europejskim opisie patentowym EP Przez dołączenie kwasu tłuszczowego, takie warianty OspC posiadają wyższą immunogenność in vivo niż dotychczas opisywane warianty OspC z N-terminalną delecją lub zmodyfikowane. [0014] Rauer i wsp, 1996, Journal of spirochetal and tick-borne diseases 3, , opisuje badanie natywnych rekombinowanych OspC ze szczepów GrHo i PKo. Podczas ekstrakcji komórkowej w warunkach nieredukujących na cysteinie może utworzyć się mostek dwusiarczkowy. W Rauer i wsp., 1998, Journal of clinical microbiology 36, ujawniono test ELISA do oznaczania ludzkich IgM, skierowanych przeciwko antygenom z krętków Borrelia, w którym stosuje się rekombinowany wewnętrzny fragment flagelliny w kombinacji z rekombinowanym OspC ze szczepu GeHo. [0015] W WO 97/49812 A1 opisano sposób oczyszczania rekombinowanego nie-lipidowanego białka Osp. [0016] Rekombinowane warianty OspC, dotychczas stosowane w diagnostyce przejawiają na ogół tę wadę, że różnią się od natywnego oczyszczonego OspC z krętków Borrelia hodowanych in vitro, ponieważ nie są lub są w odmienny sposób modyfikowane posttranslacyjnie, a obecność epitopów konformacyjnych lub dostępność epitopów w ogóle nie jest porównywalna lub nie jest zapewniona. Przejawem tych wad jest regularnie opisywana w literaturze obniżona swoista reaktywność rekombinowanych wariantów OspC w porównaniu z dotychczas stosowanymi preparatami nie-rekombinowanymi. Znajduje to odzwierciedlenie w wysokich wskaźnikach wyników fałszywie dodatnich w takich metodach diagnostycznych. [0017] Rozwój rekombinowanych wariantów OspC, które przez łatwiejsze i bardziej zdefiniowane otrzymywanie w porównaniu z antygenami natywnymi, mogą być stosowane w metodach diagnostycznych, a jednocześnie nie prowadzą do opisanych wad dotychczasowych rekombinowanych wariantów OspC, jest zatem konieczny celem ułatwienia wytwarzania takich środków do diagnostyki in vitro lub wdrożenia takich metod diagnostycznych, lub standaryzacji wyników z różnych laboratoriów. Opis wynalazku: [0018] Nieoczekiwanie stwierdzono obecnie, że opisane problemy można rozwiązać za pomocą wynalazku, w szczególności za pomocą przedmiotu zastrzeżeń. 3

5 [0019] Przedmiotem wynalazku jest białko zgodne z zastrzeżeniem 1, które zawiera pierwszy polipeptyd OspC i drugi polipeptyd OspC, przy czym pierwszy polipeptyd OspC jest połączony kowalencyjne z drugim polipeptydem OspC. Pierwszy polipeptyd OspC jest połączony za pomocą mostka dwusiarczkowego z drugim polipeptydem OspC, przy czym mostek dwusiarczkowy powstaje przez związanie cysteiny, która jest oddalona o nie więcej niż 100 pozycji aminokwasowych od N-końca peptydu OspC. [0020] Polipeptyd OspC w kontekście wynalazku, w szczególności pierwszy i/lub drugi polipeptyd OspC, może wykazywać identyczność aminokwasową co najmniej 70% z SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 lub SEQ ID NO: 9. Jest on swoiście rozpoznawany (w tym regionie homologicznym) przez przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia. Korzystnie identyczność aminokwasowa wynosi co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub co najmniej 99% względem jednej lub większej liczby sekwencji według SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 lub SEQ ID NO: 9. Sekwencje te odpowiadają natywnymi sekwencjom OspC z trzech rodzajów szczepów gatunków genomowych krętków Borrelia Borrelia afzelii (VS461), Borrelia garinii (20047) i Borrelia burgdorferi (B31). Identyczność aminokwasowa tych szczepów wynosi 70% lub 76% (patrz Fig. 1). Identyczność aminokwasową korzystnie określono za pomocą programu CLUSTAL przy standardowych ustawieniach. W kontekście wynalazku, stosowana może być w szczególności sekwencja OspC z innego szczepu krętków Borrelia, np. PKo lub jej wariant, przy czym decydujące jest swoiste wiązanie przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia. [0021] W kontekście wynalazku, swoiste rozpoznawanie przez przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia oznacza, że w odpowiednich warunkach, które są znane specjalistom w tej dziedzinie i przykładowo opisane w przykładach, przeciwciało przeciwko OspC z krętków Borrelia wiąże się do polipeptydu lub białka, ale nie do innego, niespokrewnionego białka. Jako przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia może być stosowana, na przykład, surowica od pacjentów z potwierdzonym zakażeniem krętkami Borrelia we wczesnej fazie, jak również przeciwciała, które zostały wytworzone np. przez immunizację myszy lub królików oczyszczonym natywnym OspC (np. EUROIMMUN), w szczególności przeciwciała poliklonalne. [0022] Krętki Borrelia obejmują wszystkie bakterie z rodzaju Borrelia, przykładowo wymienione są B. burgdorferi, B. garinii i B. afzelii. [0023] Polipeptyd OspC w kontekście wynalazku, w szczególności pierwszy i/lub drugi polipeptyd OspC, może zawierać co najmniej jeden epitop, który jest swoiście rozpoznawany przez przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia, przy czym epitop zawiera co najmniej częściową sekwencję 10 kolejnych aminokwasów z SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 lub SEQ ID NO: 9, w szczególności w 10 C-końcowych aminokwasów z tych sekwencji. Korzystnie, częściowa sekwencja zawiera epitop opisany jako immunodominujący w Mathiesen i wsp., 1998a; Mathiesen i wsp., 1998b. W szczególności polipeptyd lub polipeptydy OspC zawiera(ją) jedną z sekwencji aminokwasowych SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 lub SEQ ID NO: 8. Korzystne jest, gdy polipeptyd lub polipeptydy OspC na C-końcu są zakończone sekwencją natywnego OspC, przy czym nie zawiera(ją) w tym miejscu żadnych dodatkowych aminokwasów, które mogłyby utrudniać rozpoznawanie C-końcowego epitopu. [0024] Alternatywnie lub dodatkowo w polipeptydzie OspC może być obecny jeden lub więcej epitopów, np. takich jak opisane przez Earnhart i wsp., [0025] Korzystnie, epitop lub epitopy są osadzone w kolejnych sekwencjach OspC odpowiadających sekwencji typu dzikiego OspC z krętków Borrelia. Korzystnie, częściowa sekwencja kolejnych 4

6 aminokwasów z SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 lub SEQ ID NO: 9 ma długość co najmniej 15, co najmniej 20, co najmniej 25, co najmniej 30, co najmniej 50, co najmniej 100, co najmniej 150 lub co najmniej 190 aminokwasów. Korzystnie chodzi przy tym o C-końcowe aminokwasy z SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 lub SEQ ID NO: 9, z homologów z innych szczepów krętków Borrelia lub homologów o co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub co najmniej 99% identyczności sekwencji z SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 lub SEQ ID NO: 9. [0026] Polipeptydy OspC według wynalazku nie zawierają żadnych sekwencji sygnałowych dla acylacji. Polipeptydy eksprymowane w stanie techniki (EP ), które, podobnie jak dziki typ polipeptydu, miały być acylowane na najdalej położonej N-końcowej cysteinie, eksprymowano z heterologiczną sekwencją sygnałową. W odróżnieniu od tego, polipeptyd według wynalazku nie zawiera ani homologicznej sekwencji sygnałowej, ani heterologicznej sekwencji sygnałowej. Sekwencje sygnałowe, które prowadzą do acylacji zazwyczaj obejmują sekwencję sygnałową Brauna, która jest rozpoznawana przez peptydazę sygnałową II. Takie sekwencje sygnałowe mogą obejmować np. sekwencję L-I-A-C (jak OspA lub OspB) lub L-X-Y-C (przy czym X i Y są małymi obojętnymi aminokwasami) (Fuchs i wsp., 1992). Korzystnie polipeptyd według wynalazku nie jest również eksprymowany z sekwencją do acylacji, która to następnie jest odszczepiana. Polipeptyd OspC według wynalazku w związku z tym również nie jest acylowany. W jednym przykładzie wykonania cysteina, na której przebiegałaby acylacja w OspC typu dzikiego, jest cysteiną, na której tworzony jest mostek dwusiarczkowy z kolejnym polipeptydem OspC. [0027] Alternatywnie lub dodatkowo, mostek dwusiarczkowy może być również utworzony na innej cysteinie. Korzystnie, mostek dwusiarczkowy powstaje przez wiązanie z cysteiną, która jest oddalona o nie więcej niż około 100, korzystnie nie więcej niż około 50 lub nie więcej niż około 30 pozycji aminokwasowych od N-końca polipeptydu OspC. W szczególności, mostek dwusiarczkowy może być utworzony na cysteinie, która stanowi N-koniec polipeptydu lub jest oddalona o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 lub 30 aminokwasów od N-końca. [0028] W celu ułatwienia oczyszczania białka według wynalazku, w jednym wykonaniu, polipeptyd OspC/polipeptydy OspC posiadają na N-końcu, w szczególności N-terminalnie od cysteiny, na której tworzony jest mostek dwusiarczkowy, znacznik His, który może posiadać np. sekwencję odpowiadającą pierwszym 12 aminokwasom z SEQ ID NO: 1. Zamiast 8 można także stosować np. 6 lub 10 histydyn. Wbudowane mogą zostać tutaj także inne sekwencje aminokwasowe znane ze stanu techniki, ułatwiające oczyszczanie lub wykrywanie białka, np. znacznik Flag. Sekwencje takie nie powinny utrudniać rozpoznania przez przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia. Zgodnie z tym warunkiem, przyłączenie lub wbudowanie cząsteczki reporterowej jest również możliwe w innym miejscu cząsteczki. Cząsteczka reporterowa może być wybrana np. z grupy obejmującej znacznik His, znacznik Flag, znakowanie fluorescencyjne, biotynę i streptawidynę. [0029] W jednym z wykonań, pierwszy polipeptyd OspC na N-końcu zawiera znacznik His, który sąsiaduje z cysteiną, która w białku według wynalazku jest połączona z drugim polipeptydem OspC za pomocą mostka dwusiarczkowego, a w następstwie tego, w łańcuchu polipeptydowym pierwszego polipeptydu OspC, a w konsekwencji w pozostałej sekwencji polipeptydu OspC ze szczepu krętków Borrelia, np. B. burgdorferii, B. afzelii lub B. garinii, przy czym ta sekwencja tworzy C-koniec polipeptydu. W szczególności, polipeptyd OspC może składać się z tych sekwencji. Drugi (i ewentualnie dalsze) polipeptyd OspC korzystnie zawiera te same składowe sekwencji (sekwencji znacznika His-Cys-OspC) lub się z nich składa. 5

7 [0030] W korzystnym przykładzie wykonania, pierwszy i/lub drugi polipeptyd OspC zawiera sekwencję według SEQ ID NO: 2, 5 lub 8. [0031] W kontekście niniejszego wynalazku ein na ogół nie jest stosowany jako liczebnik, ale za jego pomocą można opisać nieokreśloną ilość. O ile nie podano inaczej, może on określać dwa lub więcej. W szczególności, w kontekście wynalazku jako polipeptyd OspC rozumie się pierwszy i/lub drugi polipeptyd OspC białka według wynalazku. To nie wyklucza obecności kolejnych polipeptydów OspC, które korzystnie mają taką samą strukturę, jak pierwsze polipeptydy OspC. [0032] Korzystnie, białka według wynalazku są dimerami dwóch polipeptydów OspC. Multimeryzacja z dalszymi polipeptydami OspC lub innymi cząsteczkami (np. poprzez dodatkowe mostki dwusiarczkowe) jest w zasadzie również możliwa, dopóki nie hamuje lub nie ogranicza rozpoznawania przez przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia. W kontekście wynalazku wykazano, że za pomocą mostka dwusiarczkowego może powstać homodimer dwóch takich samych polipeptydów OspC lub heterodimer różnych polipeptydów OspC. W związku z tym, stosując białko według wynalazku, możliwe jest np. przeprowadzenie wykrywania przeciwciał przeciwko kilku szczepom krętków Borrelia, albo wytworzenie szczepionki przeciwko kilku szczepom krętków Borrelia. [0033] W odniesieniu do niniejszego wynalazku, określenie białko jest na ogół stosowane do multimerów polipeptydów OspC, a polipeptyd do pojedynczych łańcuchów polipeptydowych OspC, ale oba terminy mogą się także odnosić, co fachowiec w każdym przypadku wywnioskuje z kontekstu, do białek, polipeptydów lub peptydów zgodnie z ogólnym stosowaniem słownictwa naukowego, przy czym nie ma rozróżnienia pomiędzy różnymi wielkościami. [0034] W kontekście wynalazku, wykazano, że wiązanie mostek dwusiarczkowy bezpośrednio między polipeptydami OspC znacznie poprawia rozpoznawanie przez przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia. Towarzyszy temu to, że rozpoznawanie białka przez przeciwciała przeciwko OspC z krętków Borrelia jest zmniejszone przez kontaktowanie z co najmniej jednym odczynnikiem, który niszczy mostek dwusiarczkowy. W szczególności, taki odczynnik jest wybrany z grupy obejmującej odczynniki zawierające grupę tiolową lub kombinację odczynnika zawierającego grupę tiolową i halogenek alkilu. Takie odczynniki obejmują np. środki redukujące, takie jak ditiotreitol lub merkaptoetanol, ewentualnie w kombinacji ze środkiem alkilującym, takim jak jodoacetamid. W szczególności, najpierw można stosować środek redukujący, a następnie halogenek alkilu. [0035] Białko według wynalazku może być wytwarzane na przykład w komórkach bakteryjnych (np. E. coli, np. E. coli RosettaBlue(DE3)pLacI (Stratagene)), komórkach owadzich (np. komórkach SF6), komórkach drożdży (np. S. cerevisiae) lub komórkach kręgowców (np. komórkach CHO). Wynalazek obejmuje sposób wytwarzania białka według wynalazku, przy czym jest ono eksprymowane rekombinacyjnie i oczyszczane. Oczyszczanie jest możliwe np. za pomocą chromatografii powinowactwa, przy czym można zastosować, na przykład, przeciwciała przeciw OspC z krętków Borrelia lub jeżeli stosowany jest znacznik His można stosować chromatografię powinowactwa do jonów niklu. Korzystnie, podczas ekspresji i/lub oczyszczania stosowane są warunki nieredukujące. Korzystnie, podczas oczyszczenia stosuje się ph 7-9, ph 7,5-8,5, a w szczególności ph 8. W chromatografii powinowactwa np. mieszaninę do oczyszczania można nanosić i płukać buforem TNI10, a białko może być eluowane buforem TNI150. W stanie techniki są znane inne sposoby wytwarzania i oczyszczania, które nie przeszkadzają w tworzeniu się mostka dwusiarczkowego. 6

8 [0036] W jednym z aspektów, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wykrywania przeciwciał przeciwko białku według wynalazku, w którym próbka biologiczna jest kontaktowana z białkiem według wynalazku i wykrywane jest wiązanie do białka przeciwciał, które mogą ewentualnie być obecne w próbce. [0037] W szczególności ujawnia się sposób diagnozowania zakażenia krętkami Borrelia, w którym próbkę biologiczną od pacjenta, kontaktuje się z białkiem według wynalazku i wykrywa wiązanie do białka przeciwciał, które mogą ewentualnie być obecne w próbce, przy czym wykrycie wiązania przeciwciał wskazuje na zakażenie krętkami Borrelia. [0038] Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka według wynalazku do wykrywania przeciwciał przeciw OspC krętków Borrelia i do diagnozowania zakażenia krętkami Borrelia. Wykryte przeciwciała są korzystnie przeciwciałami typu IgM, poprzez co wykrywa się zakażenie krętkami Borrelia we wczesnej fazie. [0039] Wiązanie przeciwciał można wykryć np. testem immunofluorescencyjnym, ELISA, testem luminescencyjnym, metodą Western blot, blottingiem liniowym lub metodą dot blot. Jako próbka biologiczna może być stosowany np. płyn ustrojowy pacjenta, w szczególności krew, osocze, surowica, ślina, mocz lub płyn mózgowo-rdzeniowy. Korzystnie, w przypadku pacjenta chodzi o pacjenta, który jest człowiekiem lub zwierzęciem, który ma być badany, na przykład, w kierunku zakażenia krętkami Borrelia. [0040] Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do diagnostyki zakażeń krętkami Borrelia, który zawiera białko według wynalazku. Taki zestaw może ponadto zawierać przeciwciało przeciwko OspC z krętków Borrelia i/lub bufory i/lub odczynniki odpowiednie do wykrywania, takie jak na przykład przeciwciało, które rozpoznaje ludzkie IgM, ewentualnie wyznakowane odczynnikiem odpowiednim do wykrywania (np. barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak FITC lub PE, enzymem, takim jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa lub biotyną). Może to być np. zestaw do immunofluorescencji, ELISA, do luminescencji, do metody Western blot, blottingu liniowego lub metody dot blot. [0041] Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka według wynalazku do wytwarzania szczepionki przeciwko zakażeniu krętkami Borrelia, jak również szczepionka przeciwko zakażeniu krętkami Borrelia, która zawiera białko według wynalazku. Taka szczepionka może zawierać odpowiednie substancje pomocnicze, bufory i/lub adiuwanty. Może to być szczepionka skojarzona, która, na przykład, może być skierowana przeciwko dwóm, trzem lub większej ilości szczepów krętków Borrelia. Można to osiągnąć przez zastosowanie heteromerycznych białek OspC, ale także, np. przez zmieszanie różnych homodimerów. Takie szczepionki mogą być formułowane np. do podawania podskórnego, domięśniowego, dożylnego lub doustnego. Celem poprawy tworzenia przeciwciał rozsądne może być podawanie wielokrotne, np. dwukrotne, trzykrotne lub czterokrotne (na przykład w dniu 1, 14, 28, 42). [0042] Niniejszy wynalazek po raz pierwszy umożliwia oznaczenie przeciwciał swoistych względem OspC za pomocą rekombinowanych wariantów OspC, które dostarczają wyników równoważnych diagnostycznie do tych, jakie uzyskuje się przy stosowaniu nie-rekombinowanych wariantów OspC. Jednocześnie, zastosowanie nowych rekombinowanych wariantów OspC z mostkami dwusiarczkowymi umożliwia znaczne obniżenie nakładów na produkcję antygenów, w porównaniu z natywnymi wariantami OspC, które dotychczas były uważane za najbardziej właściwe diagnostycznie. [0043] Stwierdzono, że warianty OspC zgodnie z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 (pochodzące z dojrzałego OspC według SEQ ID NO: 3 z B. afzelii VS461 = OspC VS461, nr dostępu GenBank D49379), SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 (pochodzące z OspC według SEQ ID NO: 6 z B. garinii = OspC 20047, nr dostępu GenBank L42900), SEQ ID NO 7 i SEQ ID NO 8 (pochodzące z OspC według SEQ ID NO: 9 7

9 z B. burgdorferi B31 = OspC B31, nr dostępu GenBank U01894) mogą być eksprymowane w dużych ilościach w E. coli i przygotowywane z wysoką czystością. Przy tym nie stwierdzono różnic w nakładach na inżynierię genetyczną, poziomie ekspresji, nakładach na wytworzenie lub czystości między wariantami według SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 (pochodzące z OspC VS461 ), SEQ ID NO 4 i SEQ ID NO 5 (pochodzące z OspC ) i SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8 (pochodzące z OspC B31 ), które różnią się w każdym przypadku tylko z jedną cysteiną. [0044] Co więcej przykładowo wykazano tu że diagnostyczna dokładność metody oznaczania przeciwciał klasy IgM z zastosowaniem wariantu pochodzącego z OspC VS461 według SEQ ID NO: 2 jest nieoczekiwanie równoważna ustalonej metodzie z zastosowaniem nie-rekombinowanego OspC ze szczepu VS461. Ponadto wykazano, że dokładność diagnostyczna tych dwóch metod jest większa niż metod, wykorzystujących wariant według SEQ ID NO: 1 pochodzący z OspC VS461 lub rekombinowane warianty OspC poddawane delecji zgodnie z literaturą naukową. [0045] Ponadto przykładowo wykazano, że wariant pochodzący z OspC VS461 według SEQ ID NO: 2 po oczyszczaniu biochemicznym podlega dimeryzacji poprzez mostek dwusiarczkowy i nieoczekiwanie wykazuje wyższą reaktywność swoistą niż jego monomery, jego monomer acetylowany na cysteinie i analogiczny monomer według SEQ ID NO: 1. [0046] Co więcej, wykazano przykładowo, że przez zmieszanie wariantów według SEQ ID NO: 2 (pochodzącego z OspC VS461 ) i SEQ ID NO: 5 (pochodzącego z OspC ), a następnie ich redukcję i końcowe utlenienie można wytworzyć heterodimery z mostkiem dwusiarczkowym, których użyteczność jest w zasadzie równoważna homodimerom z mostkiem dwusiarczkowym, ale które mają tę zaletę, że są w stanie wychwycić kilka różnych gatunkowo-swoistych przeciwciał, tj. przeciwciał, które są skierowane wyłącznie przeciw OspC ze szczepów B. afzelii lub wyłącznie przeciw OspC ze szczepów B. garinii. Środki i metody oddzielania heterodimerów od homodimerów, np. poprzez ogniskowanie izoelektryczne, są dostępne dla fachowca. Taki rozdział nie jest jednak konieczny, gdyż stosować można również mieszaniny homodimerów i heterodimerów. [0047] Ponadto przykładowo wykazano, że zaskakująco myszy wykazują wyższe miano przeciwciał przeciwko krętkom Borrelia po immunizacji wariantem OspC według z SEQ ID NO: 2 (pochodzącym z OspC VS461 ), które dimeryzują poprzez mostki dwusiarczkowe, niż po immunizacji taką samą ilością monomerycznego wariantu OspC według SEQ ID NO: 1. Można z tego wnioskować wyższą skuteczność szczepionek opartych na polipeptydach według wynalazku. Wyniki można odnosić do innych wariantów, do innych zwierząt i do ludzi. [0048] Poniższe przykłady przedstawiają przedmiot wynalazku w sposób przykładowy, jednak nie powinny ograniczać wynalazku. Legenda [0049] Figura 1 przedstawia uliniowienie dojrzałego OspC z B. afzelii VS461 = OspC VS461 z B. garinii, = OspC oraz z B. burgdorferi B31 = OspC B31, określone za pomocą CLUSTAL ze standardowymi ustawieniami. Tabela przedstawia stopień identyczności aminokwasów. 8

10 Figura 2 przykładowo przedstawia Western blot z niezredukowanym wariantem His-m-OspC VS461 i His-m-Cys-OspC VS461 po wybarwieniu Ponceau S (ścieżki 1-3) i po inkubacji z surowicą pacjenta z boreliozą w fazie początkowej (rozcieńczenie 1:200), i wykrywanie związanych przeciwciał IgM (ścieżka 4 & 5). Ścieżka 1: marker wielkości Mark12 (Invitrogen), ścieżka 2 i 4: 15 µg His-m- OspC VS461, ścieżka 3 i 5: 25 µg His-m-Cys-OspC VS461. Przykłady Przykład 1: Klonowanie wektora do ekspresji OspC w E. coli [0050] OspC jest kodowane w krętkach Borrelia na plazmidzie B (nomenklatura na podstawie całkowitego genomu B. burgdorferi, ramka odczytu BB_B19). Całkowite DNA z B. afzelii szczepu VS461, B. garinii szczepu oraz B. burgdorferi szczepu B31 stosowano jako matrycę do amplifikacji PCR regionów genów według SEQ ID NO: 10 do 15 kodujących sześć wariantów OspC. Celem amplifikacji poszczególnych wariantów stosowano kombinacje starterów według SEQ ID NO 16 i SEQ ID NO 17 (Hism-OspC VS461 ), SEQ ID NO 18 i SEQ ID NO 17 (His-Cys-m-OspC VS461 ), SEQ ID NO 19 i SEQ ID NO 20 (His-m-OspC ), SEQ ID NO 21 i SEQ ID NO 20 (His-Cys-m-OspC ), SEQ ID NO 22 i SEQ ID NO 17 (His-m-OspC B31 ) oraz SEQ ID NO 23 i SEQ ID NO 17 (His-Cys-m-OspC 31 ). Za pomocą PCR do amplikonów wprowadzono niezbędne miejsca cięcia enzymów restrykcyjnych, każdorazowo na końcu 5' lub 3' nici kodującej. [0051] PCR przeprowadzono w skali 50 µl z zastosowaniem "High Fidelity PCR Enzyme Mix" (Fermentas) zgodnie z zaleceniami producenta. Przeprowadzono 30 cykli reakcji złożonych z etapów 1 do 3: etap 1 30 sekund 94 C etap 2 45 sekund 56 C etap 3 30 sekund 72 C [0052] Następnie fragmenty PCR oczyszczono z zastosowaniem układu do oczyszczania NucleoSpin Extract II (MACHEREY-NAGEL GmbH) zgodnie z zaleceniami producenta i każdorazowo zawieszono w 50 µl 5 mm Tris-HCl ph 8,5. Następnie fragmenty cięto na końcach endonukleazami restrykcyjnymi. Endonukleazy restrykcyjne pozyskano z firmy Fermentas i stosowano zgodnie z zaleceniami producenta. [0053] Amplikony traktowano endonukleazami restrykcyjnymi w następujący sposób: His-m-OspC VS461 : NcoI i XhoI, His-Cys-m-OspC VS461 : Esp3I i XhoI, His-m-OspC : NcoI i XhoI, His-Cys-m-OspC : Esp3I i XhoI, His-m-OspC B31 : NcoI i XhoI, His-Cys-m-OspC B31 : PagI i XhoI. 9

11 [0054] Następnie fragmenty PCR oczyszczono z zastosowaniem układu do oczyszczania NucleoSpin Extract II, zgodnie z zaleceniami producenta i każdorazowo zawieszono w 50µl 5 mm Tris-HCl ph 8,5. [0055] Cięte enzymatycznie i oczyszczone fragmenty PCR wintegrowano za pomocą ligacji do plazmidu według SEQ ID NO: 24 ciętego Ncol / Xhol. Do ligacji zastosowano zestaw Rapid DNA Ligation firmy Fermentas zgodnie z zaleceniami producenta. Materiał ligacyjny transformowano w E.coli RosettaBlue(DE3)pLacI (Stratagene). [0056] Pozytywne klony selekcjonowano na podstawie oporności na kanamycynę/chloramfenikol [50/34 µg/ml]. Z tych klonów wyizolowano zawarte w nich plazmidy i sprawdzano za pomocą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania DNA. Poprawne plazmidy wybrano do przeprowadzenia ekspresji, zaszczepiono do 20 ml podłoża LB zawierającego antybiotyki i inkubowano w temperaturze 37 C do osiągnięcia OD600 (d=1 cm) wynoszącego 0,6. Ekspresję białka indukowano przez dodatek IPTG (stężenie końcowe 1 mm), po czym inkubację prowadzono przez kolejne 3 godziny w temperaturze 37 C. Po upływie tego czasu, komórki osadzono przez wirowanie przy 2,200 x g przez 10 minut, ponownie zawieszono w 20 ml PBS, ponownie wirowano i ostatecznie ponownie zawieszono w 1 ml PBS. [0057] Rozpad komórek nastąpił przez dodanie jednej trzeciej objętości buforu do próbek 4 x NuPAGE- LDS (Invitrogen), zawierającego 141 mm Tris-Cl ph 8,5, 2% (w/v) dodecylosiarczanu litu, 10% (w/v) glicerolu, 0,51 mm EDTA, 0,22 mm SERVA Blue G250, po czym inkubowano przez 10 minut w 70 C. Następnie chromosomalne DNA fragmentowano za pomocą traktowania ultradźwiękami (Branson Sonifier, poziom 7, MicroTip). [0058] Po rozdziale metodą SDS-PAGE lizat komórkowy przeniesiono na membranę nitrocelulozową. Następnie niewysycone miejsca membrany blokowano stosując 15 minutową inkubację z "buforem uniwersalnym" (EUROIMMUN) z 3% (w/v) mlekiem w proszku. Następnie inkubowano przez 1 godzinę z przeciwciałem monoklonalnym z myszy (Merck Biosciences GmbH), skierowanym przeciw znacznikowi His i rozcieńczonym 1:2000 w buforze "uniwersalnym" z 3% (w/v) mlekiem w proszku. Następnie trzykrotnie każdorazowo 5 minut płukano "buforem uniwersalnym". W drugim etapie inkubacji, w przypadku pozytywnego wyniku reakcji przeciwciała związane z białkami reagują z roztworem koniugatu, który jest rozcieńczony 1:2000 w buforze "uniwersalnym", który zawiera jako koniugat przeciwciało IgG anty-mysz znakowane alkaliczną fosfatazą (Sigma). Następnie płucze się jak po inkubacji ze znacznikiem anty-his. W trzecim etapie inkubacji, związane przeciwciała wykrywa się roztworem substratu" NBT/BCIP (4 chlorek błękitu nitrotetrazoliowego / fosforan chlorobromoindolilu EUROIMMUN). Wyniki: [0059] Metodą Western blot po redukującej SDS-PAGE, można wykryć ekspresję rekombinowanych konstruktów przez obecność białka reaktywnego wobec znacznika His, którego wielkości wykazują dobrą zgodność z przewidywaną na podstawie sekwencji aminokwasowej masą kda. Komórki, które zawierają wektor plazmidowy w niezmienionej postaci, nie zawierają odpowiedniego białka. 10

12 Przykład 2: Oczyszczanie rekombinowanych wariantów OspC z zastosowaniem chromatografii powinowactwa [0060] W przypadku kolumny powinowactwa chodzi o kolumnę do wirowania NiNTA (Qiagen), którą stosowano zgodnie z zaleceniami producenta. [0061] Komórki zebrane zgodnie z Przykładem 1 wiruje się ponownie, jak opisano, ponownie zawiesza w 1 ml buforu "TNI10" (5 mm Tris-HCl ph 8,0; 300 mm NaCl; 10 mm imidazol) i rozbija, trzykrotnie traktując ultradźwiękami przez jedną minutę (Branson Sonifier, poziom 7, MicroTip). 0,5 ml supernatantu nanosi się na kolumnę do wirowania NiNTA zrównoważoną buforem "TNI10". [0062] Niewiążące się lub słabo wiążące się białka usuwa się z kolumny poprzez kilkukrotnie przemywanie 0,5 ml buforu TNI10". Elucję prowadzi się za pomocą 0,2 ml buforu "TNI150 (5 mm Tris- HCl ph 8,0; 300 mm NaCl; 150 mm imidazol). Frakcję eluowaną analizuje się metodą Western blot jak w Przykładzie 1. Wyniki: [0063] Eluaty zasadniczo zawierają białka, które po barwieniu membrany z Western blot roztworem barwiącym Ponceau-S w każdym przypadku odpowiadają prążkom odpowiadającym wielkości około kda. Po Western blottingu i wykryciu znacznika His, można zaobserwować prążek odpowiadający takiej wielkości. Wynik ten wskazuje, że eksprymowane białko po chromatografii występuje w postaci zasadniczo wolnej od składowych E. coli. Przykład 3: Blotting liniowy do oznaczania przeciwciał anty-ospc za pomocą rekombinowanych wariantów OspC [0064] Na membrany nitrocelulozowe nawarstwiono w linii oczyszczone rekombinowane OspC według Przykładu 2, rozcieńczone w 10% (w/v) glicerolu (stężenie: µg/ml). Następnie membrany suszono przez noc, blokowano przez 1 godzinę w buforze "uniwersalnym" (EUROIMMUN), zamocowano na stałym podłożu, pocięto na paski o szerokości około 2 mm za pomocą skalpela pod kątem 90 do linii OspC, a następnie przechowywano w temperaturze 4 C w workach aluminiowych z woreczkami ze środkiem suszącym aż do użycia. Inkubacja pasków przebiegała jak opisano w instrukcji roboczej dla pasków EUROLINE-WB (EUROIMMUN), które inkubowano jako porównawcze. Inkubacja pasków recomline Borrelia (Mikrogen) zgodnie z zaleceniami producenta, służyła jako kolejne porównanie. [0065] W celu określenia czułości i swoistości, 25 próbek surowicy od pacjentów z potwierdzoną wczesną fazą zakażenia krętkami Borrelia, jak również 50 próbek surowicy od ciężarnych kobiet (które często zawierają przeciwciała nieswoiste) bez oznak zakażenia krętkami Borrelia i 25 par próbek surowicy od osób zdrowych, które pobrano w odstępie 14 dni, analizowano pod kątem obecności swoistych względem OspC immunoglobulin klasy M (IgM). Reakcje pozytywne u osób zdrowych sprawdzano przez analizę serokonwersji IgG (porównanie dzień 0/dzień 14) w różnych układach testowych do wykrywania przeciwciał klasy IgG przeciw krętkom Borrelia, np. EUROLINE-WB IgG i Anti-Borrelia-ELISA IgG (EUROIMMUN). W żadnym z przypadków reakcji pozytywnej próbka następcza nie dawała oznak serokonwersji. 11

13 Tabela 1: n EUROLINE-WB IgM His-Cys-m-OspC V5461 SEQ ID NO:2 His-m-OSpC VS461 SEQ ID NO:1 recomline Borrelia IgM Borrelia afzelii IgM anty-ospc Faza wczesna [n] Czułość[%] Zdrowe kobiety ciężarne [n] Zdrowi dawcy krwi [n] Swoistość [%] ,7 77,3 Dokładność diagnostyczna [%] ,5 90,5 83,2 81,1 Wyniki: [0066] Wyniki przykładowo przedstawiono w Tabeli 1 dla OspC z B. afzelii [0067] Duża część surowic pacjentów we wczesnej fazie zakażenia krętkami Borrelia zawiera przeciwciała IgM przeciw OspC. W badaniu, Western blot z natywnym OspC pochodzącym z B. afzelii i blotting liniowy z His-Cys-m-OspC VS461 wykazują praktycznie równoważną czułość i swoistość oraz jednocześnie najwyższe dokładności diagnostyczne. Natomiast blotting liniowy z wariantem His-m- OspC VS461 i rekombinowanym OspC z B. afzelii na recomblot Borrelia IgM, wyróżniają się przede wszystkim nieswoistymi reakcjami u osób zdrowych. Przykład 4: Analiza rekombinowanych wariantów OspC [0068] Zgodnie z Przykładem 2, różne oczyszczone warianty OspC rozdziela się za pomocą SDS-PAGE. W związku z tym rozdział przebiega zarówno w warunkach nieredukujących, w warunkach redukujących w obecności ditiotreitolu (DTT) i w warunkach alkilujących w obecności jodoacetamidu po redukcji DTT. Następnie Western blot prowadzi się zgodnie z Przykładem 1. Równolegle do przeciwciał monoklonalnych przeciw znacznikowi His opisanych w Przykładzie 1, pozytywne surowice anty-igm OspC inkubuje się według Przykładu 3 w rozcieńczeniu 1:200. W przypadku surowic ludzkich, w drugim etapie inkubacji stosuje się rozcieńczony w stosunku 1:10 w buforze "uniwersalnym koniugat antyludzkiego IgM i alkalicznej fosfatazy (EUROIMMUN). 12

14 Wyniki: [0069] Rozdzielenie w warunkach redukujących i warunkach alkilujących zarówno po barwieniu Ponceau S, jak i po wykryciu znacznika His zgodnie z Przykładem 1, w każdym przypadku prowadzi do uzyskania prążków odpowiadających wielkości około kda. Odnosi się to również do wariantów His-m- OspC VS461 (SEQ ID NO: 1), His-m-OspC (SEQ ID NO: 4) i His-m-OspC B31 (SEQ ID NO: 7) w warunkach nieredukujących. Natomiast w przypadku wariantów His-Cys-m-OspC VS461 (SEQ ID NO: 2), His-Cys-m-OspC (SEQ ID NO: 5) i His-Cys-m-OspC B31 (SEQ ID NO: 8) każdorazowo są obecne dwa prążki przy i kda, które są wybarwione w przybliżeniu z tą samą intensywnością. Wyniki te wskazują, że warianty His-Cys-m-OspC VS461, His-Cys-m-OspC i His-Cys-m-OspC B31 każdorazowo występują jako dimery, w których w każdym przypadku dwa monomery są połączone ze sobą za pośrednictwem mostków dwusiarczkowych (patrz Fig. 2). [0070] Po inkubacji z surowicą ludzką, rozmieszczenie prążków poszczególnych wariantów jest identyczne. Charakterystyczne jest jednak to, że prążki przy kda, są w każdym przypadku wybarwione znacznie bardziej intensywnie niż prążki przy kda. Różne poziomy intensywności zabarwienia po barwieniu bezpośrednim z zastosowaniem Ponceau-S i po barwieniu immunologicznym po inkubacji z surowicą ludzką wskazują, że dimery w każdym przypadku mają wyższe reaktywności swoiste niż monomery (patrz Fig. 2). Przykład 5: Wytwarzanie heterodimerów [0071] Porcje dwóch wariantów oczyszczonego dimeru OspC według Przykładu 2, np. His-m-Cys- OsPC VS461 i His-m-Cys-OspC 20047, zmieszano ze sobą w równych częściach. Porcję mieszaniny przechowywano do analizy. Pozostałą część zredukowano przez dodanie DTT i zajście redukcji sprawdzono w redukującej SDS-PAGE i Western blot zgodnie z Przykładem 4. Następnie mieszaninę pozbawia się DTT za pomocą wyczerpującej dializy wobec 20 mm Tris-HCl, ph 8,5 i przepuszczanie strumienia sprężonego powietrza przez 24 godziny przez końcówkę od pipety w celu uzyskania środowiska utleniającego. Na koniec mieszaninę analizowano w nieredukującym ogniskowaniu izoelektrycznym w ph pomiędzy 6 i 9 z wykorzystaniem systemu ZoomRunner (Invitrogen) zgodnie z zaleceniami producenta, następującą po tym redukującą SDS-PAGE i Western blot. Obydwa pojedyncze dimery OspC i mieszaninę analizowano przed dodaniem DTT w celu porównania. Wyniki: [0072] His-m-Cys-OspC VS461 wykazuje plamkę odpowiadającą około ph 7,5 i 24 kda, a His-m-OspC odpowiadającą ok. ph 6,5 i 24 kda. Mieszanina His-m-OspC VS461 i His-m-OspC przed redukcją wykazuje dwie plamki odpowiadające ok. ph 7,5/24 kda i ph 6,5/24 kda. W przeciwieństwie do tego, zredukowana, a następnie utleniona powietrzem mieszanina wykazuje trzy plamki odpowiadające około. ph 7,5/24 kda, ph 6,8/24 kda i ph 6,5/24 kda. Wyniki wskazują, że heterodimery są obecne co najmniej częściowo. 13

15 Przykład 6: Immunogenność dimerów OspC z mostkiem dwusiarczkowym [0073] Białka His-m-OspC VS461 i His-Cys-m-OspC VS461 oczyszczone zgodnie z Przykładem 2 wstrzyknięto podskórnie bez adiuwanta wszystkim 10 samicom myszy C3H/He w wieku od czterech do sześciu tygodni jednokrotnie, a następnie w odstępach 14, 28 i 42 dni, w porcjach, każdorazowo 100 µg na dawkę. Kolejnym 10 myszom wstrzyknięto każdorazowo 0,9% (w / v) roztwór soli kuchennej jako kontrolę. Krew pobrano od wszystkich zwierząt w dniu pierwszego wstrzyknięcia, a następnie po 24, 38, 52 i 66 dniach. Przeciwciała swoiste względem OspC oznaczono w rozcieńczeniu 1:1000 w każdej z surowic za pomocą testu ELISA anty-borrelia IgM (EUROIMMUN), w którym koniugat do wykrywania związanych przeciwciał ludzkich wymieniono na koniugat, rozcieńczony 1:2000 w buforze do rozcieńczania koniugatu (EUROIMMUN), do wykrywania związanych mysich przeciwciał klasy IgG (Dianova). Średnią wartość (MW) i odchylenie standardowe (σ) wyznaczono dla 10 zwierząt każdorazowo traktowanych w ten sam sposób. [0074] W celu sprawdzenia swoistości odpowiedzi immunologicznej, 30 próbek surowicy z dnia ostatniego pobierania krwi inkubowano z paskami EUROLINE-WB (EUROIMMUN) w rozcieńczeniu 1:500 i związane mysie przeciwciała wykrywano zgodnie z Eksperymentem 1. Wyniki: [0075] Wyniki przedstawiono jako wartości ekstynkcji przy 450 nm i zestawiono w Tabeli 2. [0076] Okazuje się, że znacznie szybciej i wyższe wartości pomiarowe uzyskano, gdy zwierzęta immunizowano wariantem His-m-Cys-OspC VS461. Ponadto okazuje się, że na koniec programu immunizacji, wszystkie surowice od zwierząt immunizowanych wariantem His-m-Cys-OspC VS461 osiągają wysokie wartości pomiarowe bliskie wartości średniej. Natomiast bardzo niskie lub niskie wartości pomiarowe w przypadku niektórych zwierząt, które były immunizowane wariantem His-m-OspC VS461 14

16 wskazują, że immunizacja w przypadku tych zwierząt nie doprowadziła do wytworzenia istotnego miana przeciwciał. [0077] Inkubacja na paskach EUROLINE-WB pokazuje, że wszystkie surowice, które generują podwyższone wartości ekstynkcji (E 450 nm 0,3) w teście ELISA, generują prążek w miejscu migracji OspC. Intensywność prążka w przybliżeniu koreluje przy tym z wartością ekstynkcji. [0078] Obydwa wyniki wzięte razem sugerują, że myszy, które były immunizowane wariantem His-m- Cys-OspC VS461 wytwarzają przeciwciała szybciej niż po immunizacji wariantem His-m-OspC VS461, oraz że wyższe stężenie przeciwciał uzyskuje się na koniec immunizacji. Spis literatury [0079] 1. Cutler SJ, Wright DJ: Comparison of immunofluorescence and enzyme linked immunosorbent assays for diagnosing Lyme disease. J Clin Pathol 42: (1989). 2. Earnhart CG, Buckles EL, Dumler JS, Marconi RT: Demonstration of OspC type diversity in invasive human lyme disease isolates and identification of previously uncharacterized epitopes that define the specificity of the OspC murine antibody response. Infect Immun 73: (2005). 3. Eicken C, Sharma V, Klabunde T, Owens RT, Pikas DS, Hook M, Sacchettini JC: Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein C from Borrelia burgdorferi. J Biol Chem 276: (2001). 4. Fister RD, Weymouth LA, McLaughlin JC, Ryan RW, Tilton RC: Comparative evaluation of three products for the detection of Borrelia burgdorferi antibody in human serum. J Clin Microbiol 27: (1989). 5. Fuchs R, Jauris S, Lottspeich F, Preac-Mursic V, Wilske B, Soutschek E: Molecular analysis and expression of a Borrelia burgdorferi gene encoding a 22 kda protein (pc) in Escherichia coli. Mol Microbiol 6: (1992). 6. Hagman KE, Lahdenne P, Popova TG, Porcella SF, Akins DR, Radolf JD, Norgard MV: Decorinbinding protein of Borrelia burgdorferi is encoded within a two-gene operon and is protective in the murine model of Lyme borreliosis. Infect Immun 66: (1998). 7. Hansen K, Hindersson P, Pedersen NS: Measurement of antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in Lyme disease. J Clin Microbiol 26: (1988). 8. Hauser U, Lehnert G, Wilske B: Diagnostic value of proteins of three Borrelia species (Borrelia burgdorferi sensu lato) and implications for development and use of recombinant antigens for serodiagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Clin Diagn Lab Immunol 5: (1998). 9. Hyde JA, Trzeciakowski JP, Skare JT: Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. J Bacteriol 189: (2007). 10. Kumaran D, Eswaramoorthy S, Luft BJ, Koide S, Dunn JJ, Lawson CL, Swaminathan S: Crystal structure of outer surface protein C (OspC) from the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. EMBO J 20: (2001). 15

17 11. Lawrenz MB, Hardham JM, Owens RT, Nowakowski J, Steere AC, Wormser GP, Norris SJ: Human antibody responses to VlsE antigenic variation protein of Borrelia burgdorferi. J Clin Microbiol 37: (1999). 12. Mathiesen MJ, Christiansen M, Hansen K, Holm A, Asbrink E, Theisen M: Peptide-based OspC enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 36: (1998a). 13. Mathiesen MJ, Holm A, Christiansen M, Blom J, Hansen K, Ostergaard S, Theisen M: The dominant epitope of Borrelia garinii outer surface protein C recognized by sera from patients with neuroborreliosis has a surface-exposed conserved structural motif. Infect Immun 66: (1998b). 14. Norris SJ, Carter CJ, Howell JK, Barbour AG: Low-passageassociated proteins of Borrelia burgdorferi B31: characterization and molecular cloning of OspD, a surface-exposed, plasmidencoded lipoprotein. Infect Immun 60: (1992). 15. Pollack RJ, Telford SR, III, Spielman A: Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. J Clin Microbiol 31: (1993). 16. Ruzic-Sabljic E, Strle F: Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. garinii, and B. burgdorferi sensu stricto in MKP and BSK-II medium. Int J Med Microbiol 294: (2004). 17. Seshu J, Boylan JA, Gherardini FC, Skare JT: Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infect Immun 72: (2004). 18. Wilske B, Fingerle V: Lyme-Borreliose Diagnostik 2005). 19. Wilske B, Jauris-Heipke S, Lobentanzer R, Pradel I, Preac-Mursic V, Rossler D, Soutschek E, Johnson RC: Phenotypic analysis of outer surface protein C (OspC) of Borrelia burgdorferi sensu lato by monoclonal antibodies: relationship to genospecies and OspA serotype. J Clin Microbiol 33: (1995). 20. Wilske B, Preac-Mursic V, Jauris S, Hofmann A, Pradel I, Soutschek E, Schwab E, Will G, Wanner G: Immunological and molecular polymorphisms of OspC, an immunodominant major outer surface protein of Borrelia burgdorferi. Infect Immun 61: (1993). 21. Wu HC, Tokunaga M: Biogenesis of lipoproteins in bacteria. Curr Top Microbiol Immunol 125: (1986). 22. Yang X, Popova TG, Goldberg MS, Norgard MV: Influence of cultivation media on genetic regulatory patterns in Borrelia burgdorferi. Infect Immun 69: (2001). 23. WO EP LISTA SEKWENCJI [0080] <110> EUROIMMUN AG Komorowski, Lars Janssen, Antonina Probst, Christian 16

18 <120> Polipeptydy i metody swoistego wykrywania przeciwciał u pacjentów z zakażeniem krętkami Borrelia <130>? <160> 24 <170> PatentIn wersja 3.3 <210> 1 <211> 203 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Wygenerowana z zastosowaniem inżynierii genetycznej. <400> 1 <210> 2 <211> 203 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Wygenerowana z zastosowaniem inżynierii genetycznej. <400> 2 17

19 <210> 3 <211> 191 <212> PRT <213> Borrelia afzelii VS461 <400> 3 <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna 18

20 <220> EP B1 <223> Wygenerowana z zastosowaniem inżynierii genetycznej. <400> 4 <210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Wygenerowana z zastosowaniem inżynierii genetycznej. <400> 5 19