Webmobis platforma informatyczna do analizy białek

Transkrypt

1 Politechnika Poznańska, Instytut Informatyki Webmobis platforma informatyczna do analizy białek Grzegorz Gębura Rafał Masztalerz Robert Nowak Marek Wronowski Praca inżynierska wykonana pod kierunkiem dr inż. Piotra Łukasiaka Poznań, 2006

2

3 Spis treści Spis treści i 1 Wprowadzenie Bioinformatyka Cel i zakres pracy Zagadnienia biologiczne Istota bioinformatyki w świetle dotychczasowych nauk przyrodniczych Analiza białek DNA RNA Rola białek w organizmach Budowa i struktura białek Struktura pierwszorzędowa Struktura drugorzędowa Struktura trzeciorzędowa Struktura czwartorzędowa Podsumowanie Metody stosowane do analizy struktur białkowych Analiza struktur pierwszorzędowych Analiza struktur drugo-, trzecio- i czwartorzędowych CASP Narzędzia Narzędzia biologiczne BLAST Działanie programu Algorytm Parametry Poszukiwanie MSP LGScore Rodzaje LGScore Uruchomienie i wynik działania programu i

4 ii Spis treści Jmol MinRMS DSSP MaxSub Technologie Java Eclipse Tomcat Tapestry SYSDEO Spindle JDO JPOX JUnit JMock PostgreSQL Budowa systemu Funkcjonalność Współpraca z metaserwerami Obsługa użytkowników Wprowadzenie sekwencji białkowej Dodawanie własnych plików PDB Projekt i budowa komponentów analizy struktur białkowych Pairwise Alignment Table Secondary Structures Table PDB Result Table Status przetwarzania Dodawanie plików PDB Wizualizacja Jmola Serwer HTTP Strona wizualna Ruchome menu System podpowiedzi Obsługa błędów i wyjątków Opracowanie sposobu przekazywania parametrów pomiędzy stronami w technologii Tapestry Zewnętrzne narzędzia Skrypt instalacyjny Jmol Skrypt uruchamiający MaxSub Moduł plików tymczasowych

5 iii 5 Podsumowanie 73 Słownik 75 Indeks 79 Bibliografia 81

6

7 Rozdział 1 Wprowadzenie 1.1 Bioinformatyka Jednym z największych osiągnięć XX wieku był rozwój elektroniki i informatyki. Dzięki niebywałemu postępowi, jaki dokonał się na obszarze tych dwóch dziedzin, możliwe stało się skonstruowanie niezwykle złożonych systemów, pozwalających na przetwarzanie ogromnych ilości danych. Dzięki temu znalazły one zastosowanie w praktycznie każdej dziedzinie życia, od administracji, przez przemysł, naukę, a kończąc na dostarczaniu rozrywki. Wśród wielu z nich szczególnego znaczenia nabrała w ostatnich latach biologia. Na styku tych dwóch dziedzin biologii i informatyki pojawiła się nowa interdyscyplinarna dziedzina nauki bioinformatyka (ang. bioinformatics). Wniosła on własne problemy badawcze i metody ich rozwiązania. Jednym z najbardziej dynamicznie rozwijających się działów bioinformatyki jest analiza sekwencji białkowych. W ramach tej analizy wyróżnić możemy: porównywanie sekwencji białek, przewidywanie struktur drugo, trzecio i czwartorzędowych, wyszukiwanie domen (podjednostek) i motywów. Istnieje już spora grupa serwerów (np. EsyPred, Fugue, Wurst) oraz narzędzi informatycznych (m.in. PSIBLAST, LgScore, DSSP, MinRMS, MaxSub) pozwalających wykonywać podane wyżej operacje na białkach, w znacznym stopniu wspomagając pracę biologów molekularnych. Z drugiej jednak strony duża liczba tych narzędzi, brak przystępnego interfejsu (np. wyświetlanie wyników w konsoli), duża liczba parametrów, które należy określić przed wywołaniem programów oraz brak wspólnego formatu danych nie sprzyja szybkiemu i sprawnemu ich wykorzystaniu. 1

8 2 Wprowadzenie 1.2 Cel i zakres pracy Celem projektu było stworzenie platformy internetowej integrującej narzędzia wspomagające pracę biologów. System miał umożliwiać pozyskanie informacji z serwerów wyspecjalizowanych w analizie struktur i funkcjonalności białek oraz dalsze ich analizowanie z wykorzystaniem dołączonych do platformy narzędzi. Wszystkie dane znajdujące się na serwerze, miały być przechowywane wyłącznie w bazie danych. Pliki tworzone miały być dopiero w chwili żądania ich przez użytkownika i tylko na określony czas. W celu usprawnienia pracy naukowców do projektu miała zostać włączona możliwość założenia własnego konta, na którym zapisywano by ustawienia oraz badane aktualnie struktury razem z wynikami ich przetwarzania. Poprzez konto użytkownika dostarczane miały być informacje o wynikach analiz z innych serwerów za pomocą wiadomości .

9 Rozdział 2 Zagadnienia biologiczne 2.1 Istota bioinformatyki w świetle dotychczasowych nauk przyrodniczych Bioinformatyka jest to dziedzina zajmująca się stosowaniem narzędzi matematycznych i informatycznych do rozwiązywania problemów biologicznych. Podstawowe zagadnienia bioinformatyki to: katalogowanie informacji biologicznych (bazy danych, wyszukiwanie sekwencji, annotacji, danych numerycznych w bazach danych) analiza sekwencji DNA i RNA (składanie sekwencji, annotacja, wyszukiwanie sekwencji kodujących, regulatorowych i repetytywnych, motywów, markerów) analiza sekwencji genomów, porównywanie genomów ustalanie ewolucyjnych relacji pomiędzy zbiorami sekwencji / organizmów genotypowanie (używane między innymi do wyszukiwania genów odpowiedzialnych za choroby genetyczne, w ustalaniu ojcostwa, kryminalistyce) analiza ekspresji genów (głównie ang. microarrays analysis) analiza sekwencji białek (porównywanie sekwencji, wyszukiwanie domen i motywów, przewidywanie własności drugo i trzeciorzędowej struktury białka, lokalizacji w obrębie komórki) katalogowanie funkcji genów/białek, analiza dróg metabolicznych (np. metabolizm lipidów) oraz dróg sygnałowych (np. od receptora na powierzchni komórki poprzez kaskadę kinaz do czynników transkrypcyjnych) 3

10 4 Zagadnienia biologiczne modelowanie układów biologicznych (np. kinetyka szeregu reakcji enzymatycznych w komórce) wirtualne dokowanie (ang. virtual docking) np. używając trójwymiarowej struktury aktywnego centrum enzymu ( zamek albo kieszonka, ang. pocket) uruchamia sie wyszukiwanie w bazach danych tysięcy małych cząsteczek, z których kilka, kilkanaście ( kluczy ) będzie miało kształt mieszczący się w centrum aktywnym. Zagadnienie to stanowi pierwszy krok w kierunku odkrywania nowych leków i preparatów leczniczych. morfometria analiza obrazu Na przestrzeni lat bioinformatyka przekształciła się w samodzielną dziedzinę z własnymi problemami biologiczno obliczeniowymi[26] Analiza białek Rola bioinformatyki, przy dzisiejszym rozwoju informatyki oraz nauk matematycznych, nie ogranicza się jedynie do zarządzania i operowania materiałem informacyjnym pochodzącym z analizy DNA i RNA. Wykorzystując różne narzędzia informatyczne i algorytmy, bioinformatyka stała się jedną z najważniejszych i najszybciej rozwijających się dziedzin nauki. Powszechnie stosowanymi metodologiami umożliwiającymi dekodowanie informacji o sekwencji aminokwasów w białkach, zawartej w łańcuchu DNA, a nastepnie przewidywanie struktury i funkcji białka, są metody numeryczne. Ważnym krokiem analiz numerycznych, niezbędnym dla przejścia od informacji genetycznej do poziomu funkcji biologicznej, jest przewidywanie struktury przestrzennej dla łańcucha białkowego o danej sekwencji aminokwasowej. Realizowane jest to z wykorzystaniem baz danych dotyczących białek, których struktura trójwymiarowa (3D) jest już poznana w oparciu o eksperymenty krystalograficzne 1. Prowadzenie analiz porównawczych danych strukturalnych, ma na celu znalezienie reguły ogólnej, która pozwoli zbudować model powstawania struktury przestrzennej białka tylko w oparciu o poznaną sekwencję aminokwasową. Biorąc pod uwagę liczbę sposobów ułożenia przestrzennego łańcucha aminokwasów, zadanie to jest bardzo złożone. Z tego powodu poszukuje się modeli, mogących odtworzyć proces zachodzący w naturze, przyjmując, że w uwarunkowaniach środowiskowych ukryta jest procedura tworzenia struktur prawidłowych. Cząsteczka białka jest strukturą wysoce dynamiczną i wrażliwą na wpływ środowiska. Dlatego na świecie rośnie zapotrzebowanie na specjalistyczne 1 naświetlanie kryształu białka promieniami rentgenowskimi

11 2.1. Istota bioinformatyki w świetle dotychczasowych nauk przyrodniczych 5 programy, które potrafiłyby przeprowadzić symulację dynamiki molekularnej w możliwie krótkich okresach obliczeniowych. Dotyczy to zwłaszcza tych zmian strukturalnych, które są warunkiem koniecznym do tworzenia kompleksów białek. Możliwość tworzenia kompleksów jest podstawowym warunkiem dla wyrażenia aktywności biologicznej danego białka. Symulacja dynamiki molekularnej, weryfikującej możliwość powstawania kompleksu białkowego oraz określenie jego trwałości, zaliczane są do zagadnień związanych z przewidywaniem funkcji biologicznej białek. Dla układów biologicznych symulacja dynamiki molekularnej jest zagadnieniem należącym do tzw. wielkoskalowych równoległych obliczeń komputerowych, realizowanych przez najnowsze superkomputery. Możliwe jest ponadto symulowanie reakcji enzymatycznych, w czasie których cząsteczka substratu (substrat: patrz słownik) pod wpływem określonego enzymu (enzym: patrz słownik) przekształcana jest w inną, stanowiącą produkt reakcji. Realizują to nowoczesne wysokowyspecjalizowane programy, budowane w oparciu o zaawansowane modele chemii oraz chemii kwantowej[22] DNA DNA nazywane kwasem deoksyrybonukleinowym, to długi liniowy polimer (patrz słownik), który przenosi informację przechodzącą z jednego pokolenia na drugie. Składa się on z ogromnej ilości połączonych ze sobą nukleotydów (nukleotyd: patrz słownik). Każdy z nich jest złożony z: cukru, kwasu fosforowego i zasady. Cukry połączone fosforanami tworzą wspólny rdzeń cząsteczki, podczas gdy zasady mogą się różnić i należą do następujących typów: zasady purynowe adenina A guanina G zasady pirymidynowe cytozyna C tymina T Informacja genetyczna jest przechowywana w sekwencji zasad leżących wzdłuż łańcucha kwasu nukleinowego, które tworzą specyficzne pary połączone wiązaniami wodorowymi. Parowanie się zasad powoduje powstawanie podwójnej helisy, helikalnej struktury składającej się z dwóch nici kwasu nukleinowego, a także jest podstawą mechanizmu kopiowania informacji genetycznej z istniejącego łańcucha kwasu nukleinowego na nowo tworzony łańcuch[11]. W 1953 r. Watson i Crick opracowali trójwymiarową strukturę DNA (patrz rys. 2.1 oraz 2.2). Okres powtarzalności wzdłuż osi helisy wynosi 0,34 nm, co

12 6 Zagadnienia biologiczne Rysunek 2.1: Model dwuniciowej helisy DNA zaproponowany przez Watsona i Cricka widok z boku Rysunek 2.2: Model dwuniciowej helisy DNA zaproponowany przez Watsona i Cricka widok z góry, wzdłuż osi helisy odpowiada 10 nukleotydom w każdym łańcuchu (patrz rys. 2.1). Na podstawie obrazów dyfrakcji promieni X uzyskanych przez Franklin i Wilkinsa stwierdzili, że DNA jest zbudowany z dwóch wzajemnie oplatających się nici, razem tworzących helikalną strukturę, w której zasady skierowane są do wnętrza helisy, a rdzeń cukrowo fosforanowy (patrz rys. 2.3) znajduje się na zewnątrz. Na rysunku pierwszy łańcuch polinukleotydowy został zaznaczony na niebiesko, natomiast drugi na różowo. Zasady purynowe i pirymidynowe zostały przedstawione kolorami o mniejszej intensywności, niż rdzeń cukrowo-fosforanowy. Dwie nici (łańcuchy) DNA w dwuniciowej helisie (patrz rys. 2.4) są ułożone antyrównolegle względem siebie (jeśli jedna nić jest

13 2.1. Istota bioinformatyki w świetle dotychczasowych nauk przyrodniczych 7 Rysunek 2.3: Rdzeń cukrowo-fosforanowy DNA zorientowana w kierunku 5 3 (3 i 5 są oznaczeniami końców nici DNA), to druga przyjmuje orientację 3 5 ). Zasady znajdujące się w przeciwległych łańcuchach tworzą ze sobą wiązania wodorowe: A z T G z C Łączenie się zasad w pary jest określane jako tworzenie się komplementarnych par zasad. Większa, dwupierścieniowa zasada purynowa tworzy parę z mniejszą, jednopierścieniową zasadą pirymidynową. Pary zasad doskonale pasują do odległości pomiędzy łańcuchami cukrowo-fosforanowymi i decydują o utrzymaniu poprawnego odstępu między nimi. Odległość ta byłaby zbyt mała dla pary utworzonej z dwóch dużych zasad purynowych i zbyt duża dla pary dwóch pirymidyn, które znajdowałyby się zbyt daleko od siebie, by utworzyć wiązania wodorowe. Pomiędzy komplementarnymi zasadami tworzy się maksymalna (spośród możliwych) liczba wiązań wodorowych. W każdej parze G:C są trzy wiązania wodorowe, zasady w parze A:T są związane dwoma wiązaniami wodorowymi. Tak, więc pary zasad A:T i G:C stanowią układy najbardziej stabilne zarówno pod względem sferycznym (przestrzennym), jak i tworzenia się maksymalnej liczby wiązań wodorowych[9]. DNA jest replikowane przez enzymy nazywane polimerazami DNA (polimeraza: patrz słownik), które bardzo precyzyjnie kopiują sekwencje matryc nukleotydowych z częstotliwością błędów niższą niż 1 na 100 milionów nukleotydów[11]. Rozwój bioinformatyki, w odniesieniu do DNA, nastąpił w momencie intensywnego rozwoju oprogramowania komputerowego służącego do analizy sekwencji nukleotydów. Na początku, w oparciu o teorię informacji, rozwijano metody poszukiwania podobieństw i różnic sekwencji w obrębie genomu tego samego oraz różnych gatunków. Doprowadziło to do określenia kryteriów dla rozróżniania fragmentów kodujących (niosących informacje o funkcjach

14 8 Zagadnienia biologiczne Rysunek 2.4: Schemat dwuniciowej helisy DNA i budowie białek) i niekodujących (nie wykorzystywanych do syntezy białek). Analiza porównawcza pomiędzy gatunkami pozwoliła na śledzenie procesów ewolucyjnych, określenie kryterium dla przynależności gatunkowej oraz identyfikację specyfiki osobniczej. Automatyzacja i dynamiczny rozwój technik analizy sekwencji DNA, stworzyły warunki techniczne dla realizacji światowego projektu o nazwie Human Genom Project (HGP). Projekt polega na analizie sekwencji nukleotydów w całym ludzkim genomie, a w efekcie na rozszyfrowaniu programu tworzenia i funkcjonowania organizmu człowieka. Jest to ogromne wyzwanie, jeśli weźmie się pod uwagę rozmiary ludzkiego genomu. Podwójna nić DNA człowieka zawiera ok. 3 miliardy par nukleotydów. Gdyby cały DNA człowieka wymodelować za pomocą zamka błyskawicznego, przyjmując, że 1 ząbek odpowiadałby jednemu nukleotydowi, a 300 ząbków przypadałoby na 1 m długości zamka, to zamek taki powinien mieć długość ok km (odległość z Warszawy do Nowego Yorku i z powrotem). W chwili rozpoczęcia realizacji projektu (w 1986 roku), oznaczenie sekwencji DNA o takich rozmiarach przekraczało możliwości niejednego laboratorium, a koszty zakupu sprzętu niezbędnego do realizacji tego projektu, budżet jednego kraju. Przedsięwzięcie to zostało więc podjęte wspólnie przez Stany Zjednoczone Ameryki Północnej, Japonię oraz Unię Europejską. W okresie późniejszym dołączyły inne kraje. W trakcie

15 2.1. Istota bioinformatyki w świetle dotychczasowych nauk przyrodniczych 9 Rysunek 2.5: Rdzeń cukrowo-fosforanowy RNA realizacji projektu techniki sekwencjonowania kwasów nukleinowych rozwinęły się tak znacznie, że zakładany początkowo termin zakończenia projektu został już istotnie przybliżony. Pierwotny plan zakładał oprócz analizy genomu człowieka (Homo sapiens Mpz (Mpz oznacza jednostkę Mega Par Zasad) także analizę genomów innych najlepiej poznanych organizmów jak: bakteria Ecoli (4,7 Mpz), muszka owocowa D. melanogaster (165,0 Mpz), drożdże S. cerevisiae (13,5 Mpz), nicień C. elegans (100,0 Mpz), mysz laboratoryjna M. musculus (3 000 Mpz). Lista gatunków włączonych w badania genomu powiększyła się o wiele innych organizmów (w tym także o rośliny np. rzodkiewnik Arabidopsis- thaliana)[22] RNA RNA (kwas rybonukleinowy) jest długim polimerem (polimer: patrz słownik) składającym się z nukleotydów (nukleotyd: słownik, strona 77) połączonych wiązaniami 3, 5 fosfodiestrowymi. Cząsteczki RNA pełnią bardzo ważną rolę, ponieważ stanowią matrycę dla syntezy białek. Porównując budowę DNA (patrz podrozdział 2.1.2) i RNA można zauważyć następujące różnice: W skład RNA wchodzą zasady: adenina (A), guanina (G), uracyl (U) i cytozyna (C). Tak więc tymina z DNA jest w RNA zastąpiona przez uracyl inną zasadę pirymidynową. Uracyl może jednak, podobnie jak tymina, tworzyć komplementarną parę z adeniną; Cukrem występującym w RNA jest ryboza, natomiast DNA zawiera deoksyrybozę Rysunek 2.5 przedstawia rdzeń cukrowo-fosforanowy RNA, który podobnie jak w DNA, utworzony jest z wiązań fosfodiestrowych 3 do 5. Rybonukleozydy (rybonukleozyd: patrz słownik) występujące w RNA to: adenozyna, guanozyna, cytydyna oraz urydyna. Rybonukleotydami

16 10 Zagadnienia biologiczne (rybonukleotyd: patrz słownik) są adenozyno-5 -trifosforan (ATP), guanozyno-5 -trifosforan (GTP), cytydyno-5 -trifosforan (CTP) i urydyno-5 -trifosforan (UTP). 5 -Trifosforany nukleozydów są substratami do syntezy RNA. Ogniwami gotowych łańcuchów RNA są monofosforany odpowiednich nukleozydów. Podobnie jak w przypadku DNA, sekwencję nukleotydów RNA zapisuje się jako sekwencję zasad w kierunku 5 3. Na przykład GUCAAGCCGGAC jest sekwencją krótkiej cząsteczki RNA[9]. Większość cząsteczek RNA jest jednoniciowa, ale cząsteczka RNA może zawierać regiony, które tworzą komplementarne pary zasad po zmianie biegu łańcucha RNA o 180 stopni (tworzą się tak zwane struktury typu spinki do włosów ). Cząsteczka RNA może więc zawierać pewne odcinki o budowie dwuniciowej helisy. Sparowane odcinki RNA stanowią drugorzędową strukturę tych cząsteczek. Wyróżniamy następujące formy RNA[30]: Jądrowy RNA (nrna) stanowi połączenie wielu rodzajów kwasów rybonukleinowych. Niektóre z nich, np. rrna i trna, są w jądrze komórkowym syntetyzowane i przebywają w nim tylko okresowo. Występujący stale w jądrze komórkowym RNA można podzielić na dwa rodzaje: Kwas rybonukleinowy heterogenny pre RNA jest bardzo szybko syntetyzowany i katabolizowany. Jego okres półtrwania wynosi od kilku minut do kilku godzin. Został nazwany kwasem rybonukleinowym heterogennym (hnrna) o dużej masie cząsteczkowej, obecnie jest okreslany jako prekursorowy RNA lub pre RNA. Pewna jego część ulega przeistoczeniu w mrna. Kwas metabolicznie stabilny snrna stanowi drugi rodzaj RNA jądrowego. Posiada stosunkowo małe cząsteczki. Zawiera, oprócz typowych zasad azotowych, ich postacie umetylowane. Kwas ten został elektroforetycznie (elektroforeza: patrz słownik) rozdzielony na 12 frakcji, którym przypisuje się funkcje regulatorowe. Transferowy RNA (trna) stanowi procent ogólnej ilości kwasów rybonukleinowych w komórce. Jest on zbudowany z nukleotydów. Jego cechą charakterystyczną wśród innych rodzajów RNA jest to, że ma najmniejszą masą cząsteczkową, zawartą w granicach od 25 do 30 kda. trna cechuje wysoka specyficzność w stosunku do aminokwasów. Każdy z aminokwasów syntetyzowanego białka może być transportowany przez jeden, a niektóre przez kilka różnych trna. Cząsteczki trna

17 2.1. Istota bioinformatyki w świetle dotychczasowych nauk przyrodniczych 11 Rysunek 2.6: Budowa kwasu trna, bez uwzględnienia skręcenia nici we fragmentach dwuniciowych ramion w komórkach występują w stanie wolnym bądź też są związane z określonym aminokwasem. Cząsteczka trna ma budowę palczastą (patrz rys. 2.6). Jest ona zwinięta spiralnie, a w pewnych miejscach tworzą się pętle. Ramiona tych pętli są dwuniciowe, skręcone w spiralę. Na tych odcinkach pary zasad mogą łączyć się wiązaniami wodorowymi. Niektóre fragmenty pętli mają jednakowe sekwencje nukleotydowe we wszystkich trna. Istnieją odcinki wykazujące znaczne różnice, które decydują o specyficzności tych kwasów. W cząsteczce trna wyróżniono 5 ramion: aminokwasowe antykodonowe dihydrourydynowe pseudourydynowe (ramię TΨC) ramię dodatkowe Ramię dodatkowe jest cechą charakterystyczną każdego trna i stanowi podstawę klasyfikacji cząsteczek trna. Matrycowy (informacyjny) RNA (mrna) powstaje w jądrze komórkowym w procesie transkrypcji z DNA. Jest syntetyzowany z trifosforanów nukleozydów. Jego zasady są komplementarne w stosunku do jednej z nici chromosomowego DNA, na której jest wytwarzany. Matrycowy RNA przenosi informację genetyczną z DNA do cytoplazmy.

18 12 Zagadnienia biologiczne Masa cząsteczkowa mrna oraz sekwencja nukleotydów zależą do rodzaju białka, które jest w nim zakodowane. Trójki nukleotydów, czyli kodony (kodon: patrz słownik), rozmieszczone w jego łańcuchu wyznaczają kolejność aminokwasów syntetyzowanego białka. Budowa mrna pro- i eukariotów wykazuje wyraźne różnice, decydujące o ich różnych właściwościach. Cząsteczka bakteryjnego mrna może dysponować kodem dla całego zespołu białek. Ten mrna jest zatem policistronowy. Oprócz kodonów zwykłych, łańcuch mrna zawiera tzw. kodony startu i stopu, które są znakami przestankowymi, umożliwiającymi syntezę wielu białek. Długość łańcucha mrna u prokariotów jest zależna od wielkości cząsteczek zakodowanych w nim białek. W procesie transkrypcji u eukariotów powstaje najpierw pre mrna, jako składnik frakcji heterogennego jądrowego hnrna. Dalszym etapem jest proces modyfikacji, w którym następuje dobieranie i łączenie z sobą fragmentów łańcucha RNA, aby powstał ostatecznie łańcuch zawierający informację o ściśle określonym białku. Rybosomalny RNA (rrna) stanowi około 80 procent ilości kwasów rybonukleinowych komórki. Jest on podstawowym składnikiem rybosomów, gdzie sięga 65 procent zawartości. Resztę stanowią białka. Rybosomalny RNA, podobnie jak inne rodzaje RNA, powstaje w procesie transkrypcji z DNA. Zawiera on typowe zasady azotowe z niewielką domieszką ich metylowych pochodnych. Jest pojedynczym łańcuchem, bardzo mocno poskręcanym, tworzącym pętle, z fragmentami dwuniciowymi, gdzie występują wiązania wodorowe między komplementarnymi zasadami. Wszystkie przedstawione powyżej rodzaje RNA, odgrywają ważną rolę w procesie syntezy białek. Dużym udziałem drugorzędowych struktur, charakteryzują się cząsteczki rybosomowych RNA (rrna) i transportujących RNA (transferowych RNA trna) oraz informacyjnych RNA (mrna). Wszystkie formy komórkowego RNA są syntetyzowane przez polimerazy RNA (polimeraza: patrz słownik), które czerpią instrukcje z matryc DNA. Po tym procesie przepisywania informacji, czyli transkrypcji, następuje jej tłumaczenie na język białek, czyli translacja, zgodnie z instrukcjami zawartymi w matrycach mrna. Przepływ informacji genetycznej, inaczej ekspresja genów, w normalnych komórkach przebiega w następujący sposób: DNA T ranskrypcja RNA T ranslacja Biako

19 2.2. Rola białek w organizmach 13 Ten przepływ informacji zależy od kodu genetycznego, który określa związek pomiędzy sekwencją zasad w DNA (lub mrna) a sekwencją aminokwasów w białku. Kod jest niemal jednakowy we wszystkich organizmach: sekwencja trzech zasad, nazywana kodonem, określa dany aminokwas. Kodony w mrna są kolejno odczytywane przez cząsteczki trna, które służą jako adaptery w trakcie syntezy białek. Proces syntezy białka odbywa się na rybosomach, które są złożonymi kompleksami różnych rrna i ponad 50 rodzajów białek[11]. Komplementarne pary zasad w zwiniętej pojedynczej nici mogą ulec rozerwaniu w podwyższonej temperaturze, podobnie jak w przypadku podwójnej helisy DNA. RNA może tworzyć nawet długą podwójną helisę, jednak w komórkach sytuacje takie zdarzają się rzadko, ponieważ zazwyczaj nie ma w nich tak długich nici komplementarnych. W odróżnieniu od replikacji DNA, efektem syntezy RNA jest tylko jedna nić. W odpowiednich warunkach pojedyncze nici RNA i DNA o komplementarnych sekwencjach mogą utworzyć podwójną helisę RNA DNA. Wtedy uracyle RNA łączą się z adeninami DNA, zaś adeniny RNA z tyminami DNA. Dzięki powstawaniu takich hybrydowych połączeń możliwe są najrozmaitsze laboratoryjne manipulacje kwasami nukleinowymi; na przykład stopień komplementarności sekwencji wyizolowanych RNA i DNA mierzy się sprawdzając ich zdolność do tworzenia podwójnej helisy RNA DNA[14]. 2.2 Rola białek w organizmach Budowa i struktura białek Białka (ang. proteins) są jednymi z tych związków chemicznych, które odgrywają najważniejszą rolę w procesach biochemicznych, determinujących zjawiska życiowe. Stanowią one około 85% wszystkich związków organicznych występujących w organizmach żywych, a ich właściwości i role są bardzo zróżnicowane. Białka mogą pełnić następujące funkcje: zapasowe, obronne, regulujące (np. insulina), katalizujące (enzymy, np. pepsyna, trypsyna, amylaza), transportowe, magazynowe (np. hemoglobina), strukturalne (aktyna, miozyna) oraz wiele innych. Podstawowym elementem, z którego zbudowane jest każde białko, są aminokwasy. Aminokwasy to związki organiczne zbudowane z grupy aminowej,

20 14 Zagadnienia biologiczne grupy karboksylowej, atomu wodoru i łańcucha bocznego, specyficznego dla każdego aminokwasu (patrz rys. 2.7). W białkach występuje jedynie 20 rodzajów Rysunek 2.7: Ogólny wzór strukturalny aminokwasów. aminokwasów, jednak różnorodność tworzonych przez nie struktur białkowych jest praktycznie nieograniczona. Listę tych aminokwasów oraz ich oznaczenia przedstawia tabela 2.1. Tablica 2.1: Aminokwasy występujące w białkach. Nazwa aminokwasu Skrót Oznaczenie literowe alanina ALA A aspargina ASN N arginina ARG R cysteina CYS C fenyloalanina PHE F glicyna GLY G glutamina GLN Q histydyna HIS H izoleucyna ILE I kwas asparginowy ASP D kwas glutaminowy GLU E leucyna LEU L lizyna LYS K metionina MET M prolina PRO P seryna SER S treonina THR T tryptofan TRP W tyrozyna TYR Y walina VAL V

21 2.2. Rola białek w organizmach 15 Ważną własnością aminokwasów z punktu widzenia białek jest ich zdolność do łączenia się, poprzez reakcje pomiędzy grupą karboksylową jednego aminokwasu, a grupą aminową drugiego. W ten sposób pomiędzy dwoma resztami aminokwasowymi powstaje wiązanie, nazywane fachowo wiązaniem peptydowym. Schemat takiej reakcji przedstawia rysunek 2.8. Rysunek 2.8: Tworzenie wiązania (poli)peptydowego. Cząsteczki aminokwasów mogą łączyć się w ten sposób tworząc niezwykle długie łańcuchy, zwane peptydami (o masie cząsteczkowej do u patrz słownik) i białkami (o masie cząsteczkowej powyżej u).Widzimy zatem, że białka są związkami wielocząsteczkowymi (makromolekularnymi), a pojedynczy łańcuch takiego białka może zawierać setki, a nawet tysiące aminokwasów. Taki łańcuch białkowy nie stanowi jednak prostej nitki. W wyniku oddziaływań pomiędzy cząsteczkami takiego łańcucha, fragmenty łańcucha przybierają lokalnie różne skomplikowane struktury (helisa α, struktura β, zwrot β). Dodatkowo, duże białka mogą zawierać kilka takich łańcuchów, co jeszcze bardziej komplikuje ich budowę, ponieważ dochodzą jeszcze oddziaływania między niezależnymi łańcuchami. Biologowie molekularni zajmujący się badaniami nad białkami wyróżnili cztery poziomy, na których rozważa się budowę białek: pierwszy poziom struktura pierwszorzędowa, drugi poziom struktura drugorzędowa, trzeci poziom struktura trzeciorzędowaregulujące, czwarty poziom struktura czwartorzędowa.

22 16 Zagadnienia biologiczne Struktura pierwszorzędowa Struktura pierwszorzędowa określa z jakich reszt aminokwasowych zbudowane jest białko oraz w jakiej kolejności są one ze sobą powiązane w ramach całego łańcucha. Skład i kolejność reszt ma istotny wpływ na własności takiego białka. Zmiana choćby jednej reszty aminokwasowej (tzw. mutacja) może doprowadzić do poważnych dolegliwości i chorób. Strukturę pierwszorzędową białka można w łatwy sposób przedstawić, zapisując ją jako ciąg liter (skrótów nazw), z których każda jednoznacznie identyfikuje aminokwas tworzący daną resztę aminokwasową. Kolejność reszt w łańcuchu wyznacza położenie w sekwencji (patrz rys. 2.9). Rysunek 2.9: Sposób prezentacji struktury pierwszorzędowej białka Struktura drugorzędowa W 1951 roku Robert Covey i Linus Pauling doszli do wniosku, że łańcuch polipeptydowy nie stanowi prostej nici, a zawija się tworząc regularnie powtarzające się struktury, nazwane przez nich helisą α (czyt. helisa alfa) i harmonijką β (czyt. harmonijka beta). Dopiero sześć lat po dokananiu tego odkrycia, udało się zaobserwować je doświadczalnie. Był to punkt zwrotny w biologii molekularnej, ponieważ okazało się, że jeżeli znane są dokładne parametry łańcucha polipeptydowego, wówczas można przewidzieć jego konformację(sposób przestrzennego ułożenia atomów w cząsteczce białka). Z czasem udało się zidentyfikować kolejne struktury, takie jak: zwroty β (czyt. zwrot beta) i pętlę Ω (czyt. pętla omega), które pomimo tego, że nie występują okresowo, to są powszechne i razem z helisami α i harmonijkami β tworzą strukturę drugorzędową białka. Podstawowym i powtarzającym się cyklicznie elementem w każdym łańcuchu białkowym jest płaskie wiązanie peptydowe CO NH. Obrót wokół niego jest jednak ograniczony, ponieważ ma ono charakter wiązania podwójnego i jest konstrukcją dość sztywną. Swobodny obrót ma jednak miejsce pomiędzy:

23 2.2. Rola białek w organizmach 17 C α (patrz rys. 2.7) i karbonylowym atomem węgla (C α - CO), C α i atomem azotu (N C α ). Właśnie poprzez obrót wokół tych wiązań łańcuch polipeptydowy lub jego fragmenty mogą tworzyć takie uporządkowane konformacje, jak helisy α, harmonijki β, zwroty β, czy pętle Ω. Helisa α jest prawoskrętną strukturą cylindryczną, powstałą na skutek tworzenia się wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych pomiędzy grupami NH i CO głównego łańcucha. Grupa CO każdego aminokwasu tworzy takie wiązanie z grupą NH aminokwasu, który w sekwencji liniowej oddalony jest o cztery reszty aminokwasowe (patrz rys. 2.10). Łańcuchy boczne aminokwasów występują na zewnątrz cylindra, a ciasno skręcony łańcuch główny tworzy część wewnętrzną. Na jeden obrót helisy α przypada 3,6 reszt aminokwasowych, a każda reszta aminokwasowa przesunięta jest w stosunku do sąsiedniej o 0,15 nm (1nm = 10 9 m) wzdłuż osi helisy i obrócona o kąt 100 wokół osi. Skok helisy α, czyli odległość między początkami dwóch kolejnych zwojów wynosi 0,54 nm (patrz rys. 2.11). Rysunek 2.10: Schemat wiązań wodorowych w helisie α. Helisa α jest jedną z najlepiej poznanych struktur, a jej zawartość w białkach może być bardzo różna i wahać się od 0% do niemal 100%. Przykładem może być ferrytyna, białko magazynujące żelazo, w którym 75% reszt tworzy helisy α. Udział struktury helikalnej w białkach określa się na podstawie wyników badań metodami chiralooptycznymi. Okazuje się, że pojedyncze helisy nie przekraczają długości 4,5 nm, tym samym są strukturami dość krótkimi. Jednak możliwość splatania się dwóch lub większej ilości helis wokół siebie (tzw. helisy wyższego rzędu) sprawia, że mogą one osiągnąć długości dochodzące do ponad 100 nm (0,1 µm, czyli 0,1 * 10 6 m)(patrz rys. 2.12). Przykładem może być miozyna i tropozyna mięśni, keratyna włosów czy fibryna skrzepów krwi. Obok helisy α istnieją również inne rodzaje helis, zarówno prawo, jak i lewoskrętne. O ich cechach charakterystycznych i rodzaju decydują

24 18 Zagadnienia biologiczne Rysunek 2.11: Struktura helisy α. (A) Model wstęgowy z zaznaczonymi atomami węgla α i łańcuchami bocznymi (kolor zielony). (B) Widok z boku w modelu kulkowym przedstawiający wiązania wodorowe (linie przerywane) między grupami NH i CO. (C) Widok z góry pokazuje zwinięty szkielet znajdujący się w środku helisy α i wystające na zewnątrz łańcuchy boczne (kolor zielony). (D) Model czaszowy rysunku C przedstawiający ściśle upakowany wewnętrzny rdzeń helisy α. Rysunek 2.12: Helikalnie zwinięte helisy α. Dwie helisy są splecione wokół siebie tworząc helisę wyższego rzędu tzw. superhelisę. łańcuchy boczne aminokwasów występujących w łańcuchu polipeptydowym. Do aminokwasów, które sprzyjają tworzeniu helis należą: Ala, Val, Phe, Met, Gln i His, a do aminokwasów destabilizujących taką strukturę należą: Pro, Gly, Asn, Tyr, czy Thr. Drugą strukturą zaproponowaną przez Pauling a i Corey a była struktura harmonijki β (patrz rys. 2.13, 2.14), nazywana również strukturą pofałdowanej kartki, pofałdowanego łańcucha lub po prostu strukturą β. Budowa takiej struktury, podobnie jak w przypadku helisy α, opiera się na wiązaniach wodorowych pomiędzy grupami NH i CO. W przeciwieństwie do helisy, gdzie takie wiązania tworzą się pomiędzy odpowiednimi, blisko leżącymi atomami tego samego łańcucha, o tyle w harmonijce β wiązanie wodorowe może zostać utworzone zarówno pomiędzy bliskimi, jak i odległymi częściami tego samego łańcucha lub różnych łańcuchów. Tym samym harmonijka β jest strukturą prawie

25 2.2. Rola białek w organizmach 19 całkowicie rozciągniętą, w odróżnieniu od cylindrycznej helisy. Rysunek 2.13: Białko bogate w struktury typu harmonijka β. Rysunek 2.14: Struktura nici β. Łańcuchy boczne (kolor zielony) znajdują się powyżej lub poniżej płaszczyzny nici. Sąsiadujące ze sobą łańcuchy harmonijki mogą być ułożone w tym samym kierunku (tzw. równoległa harmonijka β) lub w przeciwnych kierunkach (tzw. antyrównoległa harmonijka β). Obie struktury oraz sposób połączenia grup NH i CO przedstawia rys i Rysunek 2.15: Antyrównoległa harmonijka β. Sąsiednie nici β są ułożone w przeciwnych kierunkach. Strukturę stabilizują wiązania wodorowe między grupami NH i CO, łączące każdy aminokwas z sąsiadującym aminokwasem na nici antyrównoległej.

26 20 Zagadnienia biologiczne Rysunek 2.16: Równoległa harmonijka β. Sąsiednie nici β są ułożone w tym samym kierunku. Wiązania wodorowe łączą każdy aminokwas na jednej nici z dwoma różnymi aminokwasami na nici sąsiedniej. Harmonijka β jest ważnym elementem strukturalnym białek. Przykładem mogą być białka wiążące kwasy tłuszczowe, których budowa opiera się prawie całkowicie na harmonijce β. Innymi strukturami, dzięki którym łańcuch polipeptydowy może zmieniać swój kierunek są: struktura wstęga zwrot wstęga, nazywana również zwrotem β, β zgięciem lub zgięciem spinki do włosów oraz struktura pętli. W miejscu, w którym występuje zwrot β, obserwuje się zmianę kierunku łańcucha o 180 stopni. W strukturach tego typu wiązanie wodorowe tworzy się najczęściej między grupą CO reszty aminokwasowej na pozycji i, a grupą NH reszty aminokwasowej na pozycji i + 3. Struktury tego typu nie mają regularnej, okresowej struktury jak helisy α i harmonijki β, są natomiast dość sztywne i dobrze zdefiniowane. Najczęściej zwroty β i pętle znajdują się na powierzchni białek, a to ma wpływ na ich reakcje z innymi białkami i innymi cząsteczkami Struktura trzeciorzędowa Struktura trzeciorzędowa obrazuje wzajemne ułożenie w przestrzeni poszczególnych fragmentów łańcucha peptydowego, a tym samym określa trójwymiarowy kształt całej cząsteczki białka. Na kształt ten wpływ mają takie czynniki jak: oddziaływanie na siebie zjonizowanych grup funkcyjnych ( COO ( ) i NH (+) 3 ), wytworzone wiązania disulfidowe są to silne wiązania S S (siarka) pomiędzy odległymi od siebie resztami cystern (Cys, C), oddziaływania dipol dipol,

27 2.2. Rola białek w organizmach 21 siły dyspersyjne hydrofobowych łańcuchów bocznych. Struktura trzeciorzędowa białek jest strukturą niejednorodną, ponieważ obok uporządkowanych struktur, takich jak helisy α, harmonijki β czy zwroty β, występują również struktury nieuporządkowane. W strukturze białka możemy ponadto wyróżnić ściśle upakowane części, które są wyraźnie oddzielone od reszty cząsteczki. Każdą z tych części, których w pojedynczej cząsteczce może być nawet kilka, nazywamy domeną. Konformacja cząsteczki białka kształtuje się pod wpływem wielu czynników, jednak w określonym środowisku decydującą rolę odgrywa sekwencja łańcucha białkowego. Różnica między energią najbardziej uprzywilejowanej konformacji, a energią innych struktur uporządkowanych (nawet strukturą rozplecioną) jest niewielka, rzędu 10 kcal. W efekcie konformacja białek jest bardzo labilna i zdarza się, że łańcuchy polipeptydowe o bardzo różnej sekwencji przybierają zbliżoną konformację. Podobieństwo sekwencyjne ludzkiej hemoglobiny, owadziej erytrokruoryny i leghemoglobiny, białka występującego w brodawkach na korzeniach roślin motylkowych, jest mniejsze niż 20%, a mimo to wszystkie te białka pełnią taką samą funkcję są przenośnikami tlenu. Wszystkie one zawierają hem jako grupę prostetyczną i mają prawie identyczną budowę przestrzenną. Ta obserwacja skłoniła do przeprowadzenia badań porównawczych znanych globin tworzących z hemem białka złożone. Okazało się, że spośród 226 porównywanych globin tylko dwie reszty aminokwasowe, histydyny proksymalnej (najbliższej) wiążącej tlen i fenyloalaniny bezpośrednio oddziałującej z hemem, powtarzały się i zajmowały te same pozycje w polipeptydowych łańcuchach. Rezultaty te świadczą o nieograniczonych wprost adaptacyjnych możliwościach białek. Z drugiej strony wiadomo, jak dramatyczne skutki może powodować zmiana reszty chociażby jednego aminokwasu, czego przykładem są choroby typu anemii sierpowatej i mukowiskocydozy. (patrz rys. 2.17) Każde białko może zostać przekształcone ze struktury pofałdowanej w strukturę rozplecioną. W tym stanie białko nie pozostaje jednak długo i ponownie ulega pofałdowaniu do formy najkorzystniejszej energetycznie, przy czym nie koniecznie musi to być postać wyjściowa. Cały proces trwa kilka sekund lub minut, ponieważ fałdowanie ma miejsce w wielu miejscach jednocześnie. Widać zatem, że tworzenie się takich struktur jak helisy czy harmonijki jest istotnym elementem w konstrukcji uporządkowanej struktury białka.

28 22 Zagadnienia biologiczne Rysunek 2.17: Struktura przestrzenna (trzeciorzędowa) mioglobiny Struktura czwartorzędowa Struktura czwartorzędowa odnosi się do sytuacji kiedy białko zbudowane jest z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego. Każdy z tych łańcuchów nazywany jest podjednostką (domeną), tym samym struktura czwartorzędowa odnosi się do wzajemnego ułożenia przestrzennego podjednostek i oddziaływań jakie między nimi występują. Przykładem białka u którego możemy wyróżnić strukturę czwartorzędową jest ludzka hemoglobina. Składa się ona z dwóch podjednostek typu α i dwóch podjednostek typu β (patrz rys. 2.18). Rysunek 2.18: Struktura czwartorzędowa ludzkiej hemoglobiny. Zbudowana jest z dwóch identycznych podjednostek (domen) α (kolor czerwony) i dwóch identycznych podjednostek β (kolor żółty) Podsumowanie Analizując budowę białek wyróżnia się cztery poziomy ich organizacji. Struktura pierwszorzędowa określa sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Struktura drugorzędowa opisuje wzajemne, przestrzenne

29 2.2. Rola białek w organizmach 23 ułożenie reszt aminokwasów sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej. Struktura trzeciorzędowa odnosi się do powiązań przestrzennych i wzajemnego ułożenia reszt aminokwasowych, znacznie oddalonych od siebie w sekwencji liniowej, natomiast struktura czwartorzędowa dotyczy sytuacji kiedy białko zbudowane jest z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego. Przedstawienie wszystkich struktur zawiera tabela Metody stosowane do analizy struktur białkowych Analiza struktur pierwszorzędowych Analiza struktury pierwszorzędowej składa się z dwóch etapów: analizy składu aminokwasowego, analizy sekwencyjnej. Analiza składu aminokwasowego dostarcza nam informacji, z jakich aminokwasów i w jakich stosunkach zbudowane jest białko. Skład aminokwasowy określa się po jego hydrolizie, która najczęściej odbywa się w sześciomolowym kwasie solnym w temperaturze ok. 110 C przez 24 godziny. W następnym kroku określa się jaka jest zawartość poszczególnych aminokwasów w hydrolizacie (analiza jakościowa i ilościowa). Obecnie cała analiza jest automatycznie wykonywana przez analizatory aminokwasowe, które działają w oparciu o HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography). HPLC to metoda analityczna a także preparatywna, służąca do oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych. Analiza sekwencyjna służy do określenia kolejności reszt aminokwasowych w łańcuchu peptydowym. Polega ona na odcinaniu i identyfikacji każdego aminokwasu z łańcucha białkowego. Najczęściej wykorzystywana jest tutaj degradacja Edmana, która polega na reakcji analizowanego peptydu z fenyloizocyjanianem, w wyniku czego N końcowy aminokwas zostaje odszczepiony i ostatecznie, na skutek hydrolizy i cyklizacji, powstaje 3 fenylo 2 tiohydantoina odpowiedniego aminokwasu (PTH). PTH następnie jest analizowane za pomocą metod chromatograficznych 2 : HPLC, GC (ang. gas chromatography) bądź spektrometrii mas 3. Im łańcuch białkowy jest dłuższy tym bardziej opisana metoda staje się uciążliwa w stosowaniu. Z tej przyczyny długie łańcuchy dzieli się na mniejsze fragmenty w różnych miejscach, określa się 2 technika analityczna lub preparatywna. Wykorzystywana do rozdzielania i badania składu mieszanin związków chemicznych. [27] 3 uniwersalna technika analityczna, zaliczana do metod spektroskopowych, której podstawą jest pomiar stosunku masy molowej do ładunku elektrycznego jonów otrzymywanych z atomów lub związków chemicznych. [27]

30 24 Zagadnienia biologiczne Tablica 2.2: Podsumowanie: struktura pierwszo-, drugo-, trzecioi czwartorzędowa białka.

31 2.2. Rola białek w organizmach 25 sekwencję aminokwasów w każdym fragmencie, a następnie na zasadzie układania puzzli odtwarza się całą sekwencję łańcucha polipeptydowego Analiza struktur drugo-, trzecio- i czwartorzędowych Jedną z najbardziej popularnych metod badania przestrzennej budowy białek jest rentgenografia. Metoda ta polega na rejestracji i analizie widm dyfrakcyjnych promieni rentgenowskich, które powstają na skutek interakcji promieniowania rentgenowskiego z chmurami elektronowymi cząsteczek tworzących analizowany kryształ. Warunkiem zastosowania tej metody jest zatem otrzymanie białka w postaci krystalicznej. Udało się to uzyskać jak dotąd zaledwie dla kilkuset białek, ale dzięki temu ich struktura została dokładnie poznana. Inną metodą, która pozwala określić udział struktur drugorzędowych w cząsteczce białka jest spektrometria w nadfiolecie. Polega ona na wykorzystaniu promieniowania UV z zakresu nm. Najczęściej korzysta się tutaj z tzw. dychroizmu kołowego CD (ang. circular dichroism), dzięki któremu stosunkowo łatwo oszacować udział helis α w cząsteczce białka. Struktury β mają niestety znacznie mniejszy wpływ na widmo CD, stąd trudniej określić ich udział metodami chiralooptycznymi. Kolejną metodą wykorzystywaną w określaniu konformacji białka jest spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. Nuclear Magnetic Resonance), zarówno protonowa, jak i 13 C, 31 P, 15 N. Dostarcza ona cennych informacji o tym jak ułożone są protony w przestrzeni, a tym samym jaka jest odległość między nimi. To ostatecznie pozwala odtworzyć model przestrzenny białka. Technika NMR ma tą wadę, że wykorzystuje roztwory, a to ogranicza pole działania do białek rozpuszczalnych w wodzie. Podane wyżej metody pozwalają dokładnie określić strukturę przestrzenną białka. Wymagają jednak wielu godzin pracy wysoko wykwalifikowanej obsługi technicznej, co przy dużej liczbie sekwencji aminokwasowych białek jest trudne do zrealizowania. Z tego względu podejmuje się próby przewidywania struktur przestrzennych i własności białek przy wykorzystaniu metod informatycznych. Metody te bazują na tym, że właściwości fizyczne i chemiczne 20 aminokwasów budujących białka są gruntownie poznane, a tym samym można spróbować określić cechy nieznanych białek na podstawie tych właściwości. Do przewidywania struktur drugorzędowych wykorzystuje się m.in. sieci neuronowe. Sieć neuronowa ma możliwość uczenia się w oparciu o przykłady, zamiast ślepego wykonywania instrukcji krok po kroku. Każda taka sieć posiada warstwę wejściową i wyjściową. Pomiędzy tymi warstwami może znajdować

32 26 Zagadnienia biologiczne się więcej warstw pośrednich, w których następuje właściwy proces uczenia. Osiąga się to poprzez dostarczenie takiej sieci zestawu danych treningowych. W przypadku białek, zestawem danych treningowych są sekwencje aminokwasowe dla których znane są dokładne drugorzędowe struktury przestrzenne. Przykłady algorytmów bazujących na sieciach neuronowych to: nnpredict wykorzystuje dwuwarstwową sieć neuronową, na wejście której podawana jest sekwencja w formacie FASTA. Stopień zgodności z danymi empirycznymi dla najlepszych wyników wynosi około 65% [1]; PHDsec bazuje na sieciach neuronowych i przypisuje każdą resztę aminokwasową do określonego typu struktury drugorzędowej. Średni stopień zgodności z danymi eksperymentalnymi wynosi 72%, najlepsze wyniki sięgają 90%; PSIPRED algorytm rozwinięty na Uniwersytecie w Warwick (Wielka Brytania), korzysta z dwóch wspomagających się sieci neuronowych. Średni stopień zgodności wyników z danymi eksperymentalnymi wynosi 76.5%. Inne metody przewidywania struktur drugorzędowych to: metoda Garnier-Gibsona-Robson (GOR) przy analizie struktury drugorzędowej bierze pod uwagę własności każdego aminokwasu oraz aminokwasów z nim sąsiadujących, nie skupia się na jednym elemencie łańcucha polipeptydowego określając czy należy on do helisy α, czy harmonijki β, a rozważa cały segment aminokwasów budujących białko. Średni stopień zgodności wyników z danymi eksperymentalnymi wynosi 63% metoda homologów Levina bazuje na założeniu, że krótkie, podobne łańcuchy peptydowe powinny mieć identyczną strukturę drugorzędową. Pod uwagę brane są tutaj fragmenty białek zawierające 7 reszt aminokwasowych, które porównywane są ze wszystkimi białkami zgromadzonymi w bazie danych, przy wykorzystaniu macierzy podobieństwa. metoda podwójnego przewidywania (G. Deléage, B. Roux) składa się z dwóch faz. W pierwszej fazie następuje przewidywanie struktury drugorzędowej w oparciu o parametry opisane przez Chou i Fasmana, a w drugiej opierając się na sekwencji aminokwasów w łańcuchu białkowym. Oba wyniki są następnie analizowane i konstruowana jest ostateczna postać struktury drugorzędowej białka. metoda CNRS, znana jako SOMPA wykorzystuje szereg innych algorytmów, takich jak: metoda GOR, metoda homologów Levina, metoda PHD i metoda podwójnego przewidywania do skonstruowania tzw. przewidywania integrującego.

33 2.2. Rola białek w organizmach 27 W przypadku struktur trzecio i czwartorzędowych wykorzystuje się inne metody: budowanie modelu homologii lub metoda nawlekania. Takie metody poszukują struktur o podobnych elementach zwinięcia łańcucha z pominięciem kryterium podobieństwa na poziomie sekwencji. W metodzie tej pobierana jest sekwencja badana, dla której nie jest znana struktura, a następnie nakłada się ją na współrzędne strukturalne białka docelowego o strukturze poznanej w wyniku analizy krystograficznej lub NMR. Sekwencja jest nawlekana z przemieszczeniem co jedną pozycję przez znaną strukturę wzorcową, która z góry narzuca pewne ograniczenia fizyczne i przestrzenne. (... ) Dla każdego ułożenia sekwencji w strukturze docelowej obliczane są oddziaływania między parami reszt oraz oddziaływania hydrofobowe. Te obliczenia termodynamiczne służą do określenia najbardziej optymalnego uzgodnienia pod względem energetycznym i stabilności konformacyjnej dla badanej sekwencji w odniesieniu do struktury wzorcowej.[1] Metody te są bardzo skuteczne ale wymagają rozbudowanych programów i komputerów o dużej mocy obliczeniowej. Inne metody przewidywania struktur trzecio i czwartorzędowych to: algorytm DALI poszukuje podobnych szablonów kontaktu między dwoma białkami, przeprowadza optymalizację wyników i zwraca najlepsze wyniki dla sporządzonego zestawienia dopasowanych struktur (Holm i Sander, 1993). metoda TOPITS (Rost, 1995) rozszerzenie metody PHD. W metodzie TOPITS struktura trzeciorzędowa zawarta w PDB zostaje przetłumaczona na jednowymiarowe łańcuchy struktur drugorzędowych. Następnie za pomocą PHD określa się dla danej sekwencji strukturę drugorzędową. Aby uzyskać przewidywaną strukturę dopasowuje się badany łańcuch oraz łańcuchy docelowe wykorzystując do tego programowanie dynamiczne CASP Z pomysłu organizacji Protein Structure Prediction Center 4 narodził się projekt CASP Critical Assessment of Techniques for Protein Structure 4 Protein Structure Prediction Center, jest częścią Centrum Genomów na Uniwersytecie Kaliforni. PSPC jest wspierana przez Państwowy Instytut Zdrowia w Ameryce oraz Amerykańską Państwową Bibliotekę Medyczną.

34 28 Zagadnienia biologiczne Rysunek 2.19: Logo CASP. Prediction, (Krytyczna Ocena Technik Przewidywania Struktury Białka). Miał on pomóc w poznaniu stopnia rozwoju prac w dziedzinie przewidywania struktury białek, ocenieniu poczynionych postępów i wskazaniu najbardziej opłacalnych kierunków rozwoju w tej dziedzinie [6]. O randze konkursu może świadczyć fakt, że w ostatnich latach w Stanach Zjednoczonych wysokie miejsce w konkursie CASP stało się prawie wymogiem przy staraniu się o granty naukowe w dziedzinie biochemii. Przebieg konkursu jest następujący: organizatorzy ogłaszają listę kilkudziesięciu sekwencji białek. Ich struktury przestrzenne zostały już wcześniej poznane w wyniku prac doświadczalnych, które przeprowadziły zespoły badawcze. Struktury te nie zostają upubliczniane aż do zakończenia konkursu. Uczestnicy mają za zadanie znalezienie za pomocą symulacji komputerowej struktur przestrzennych jak najbardziej zbliżonych do oryginalnych (przykład na rysunku 2.20). Na koniec konkursu odbywa się spotkanie, na którym zostają podsumowane wszystkie uzyskane wyniki. Pierwsze takie spotkanie odbyło się w centrum konferencyjnym Asilomar w San Francisco, w grudniu Poświęcono mu specjalne wydanie raportu PROTEINS: Structure, Function, and Genetics (Tom 23, numer 3, 1995). Pod adresem desc.text.html dostępne jest również streszczenie tego spotkania. Informacje o strukturach do rozpoznania pozyskiwane są przez organizatorów za pomocą krystalografii 5 lub metody magnetycznego rezonansu jądrowego. We wszystkich rozpoznaniach cele są uzyskiwane w czterech kategoriach: modelowanie homologiczne (comparative modeling) stosowane gdy występuje jasne powiązanie pomiędzy badaną sekwencją 5 naświetlanie kryształu białka promieniami rentgenowskimi

35 2.2. Rola białek w organizmach 29 Tablica 2.3: Popularność CASP CASP1 CASP2 CASP3 CASP4 CASP5 CASP6 grupy uczestników zgłoszone cele a jedną lub więcej znaną strukturą (podobne sekwencje podobne białka) identyfikacja foldu wraz z przeciąganiem sekwencji przez struktury (fold recognition or threading ) sprawdzanie sekwencji pod względem podobieństwa z bazą danych foldów składanie od początku (ab initio folding) otrzymywanie struktur przybliżonych poprzez czytanie z sekwencji, zwijanie na siatkach, składanie z krótkich fragmentów dokowanie 6 (docking) przewidywanie trybu wiązania się ligandów 7 i protein Włożono sporo wysiłku aby eksperyment zyskał jak największe grono uczestników. Tabela 2.3 prezentuje ilość uczestników i wykonanych przez nich zgłoszeń celów na przestrzeni lat. Warto wspomnieć również o niedawnym udanym udziale polskich naukowców w eksperymencie CASP6 [19]. Byli to profesor Andrzej Koliński z Wydziału Chemii UW, dr Krzysztof Ginalski z Interdyscyplinarnego Centrum Modelowania Matematycznego i Komputerowego UW i BioInfoBank Institute (został po raz drugi nieoficjalnym liderem CASP) oraz dr Janusz Bujnicki z Międzynarodowego Instytutu Biologii Molekularnej i Komórkowej. Znaleźli się oni wśród zwycięzców ostatniej edycji konkursu. Jedno z najlepszych ich dopasowań widać na rysunku Do tej pory odbyło się sześć eksperymentów. Rezultaty prac na przestrzeni lat zostały zebrane w internecie: CASP1 (1994): ftp://iris4.carb.nist.gov/pub/model_database CASP2 (1995): CASP3 (1998): CASP4 (2000): 6 pojawiło się w 1996 roku 7 cząsteczki rozpoznawane przez receptor i przyłączające się do niego

36 30 Zagadnienia biologiczne Rysunek 2.20: Po lewej najdokładniejszy model struktury jednego z białek (wystawiony do konkursu CASP6, opracowany przez dr Krzysztofa Ginalskiego) oraz jego prawdziwy odpowiednik. CASP5 (2002): CASP6 (2004): Ciekawe adresy związane z CASP: strona organizatora konkursu dyskusje na temat CASP id=495&news_id=1669&layout=4&page=text artykuł opisujący sukces polskiego zespołu periodyk podsumowujący CASP (dostęp płatny)

37 Rozdział 3 Narzędzia 3.1 Narzędzia biologiczne Analizując pojedynczą sekwencję trudno jest wnioskować o pełnej strukturze i funkcjonalności cząsteczki przez nią opisywanej dopóki nie zostaną odkryte mechanizmy skręcania białka. Powinna być ona badana przez porównanie do innych, poznanych już dokładnie sekwencji. Dopiero na tej podstawie można tworzyć hipotezy dotyczące powiązań i funkcji białek. Być może dzięki dokładniejszym badaniom ludzkiego genomu, naukowcy będą potrafili znaleźć lekarstwa na choroby takie jak AIDS czy rak. Algorytmy, które powstały na przestrzeni ostatnich lat mają za zadanie jak najdokładniej zbadać strukturę białka. Przy tworzeniu platformy WebMobis wykorzystano gotowe implementacje najbardziej skutecznych i popularnych algorytmów BLAST Najważniejszym z narzędzi, które dołączono do projektu WebMobis, był BLAST ( ang. Basic Local Alignment Search Tool ). BLAST dostarcza narzędzi do szybkiego i sprawnego przeszukiwania baz danych nukleotydów i białek. Potrafi odnaleźć obszary podobieństwa, czyli fragmenty sekwencji o podobnej kolejności aminokwasów (patrz rysunek 3.1 na stronie 34) zawarte w niepowiązanych ze sobą białkach. Istnieją następujące odmiany BLAST [3]: BLASTP porównywanie sekwencji białka z bazą sekwencji białek BLASTN porównywanie sekwencji nukleotydów z bazą sekwencji nukleotydów 31

38 32 Narzędzia BLASTX porównywanie ( przetłumaczonej 1 ) sekwencji nukleotydów z bazą sekwencji białek TBLASTN porównywanie ( przetłumaczonej ) sekwencji białka z bazą sekwencji nukleotydów TBLASTX porównywanie (przetłumaczonej) sekwencji nukleotydów z bazą (przetłumaczonych) sekwencji nukleotydów MEGABLAST odmiana optymalizowana do porównań długich, niewiele się różniących sekwencji nukleotydów (szybsza niż BLASTN). W projekcie użyto odmiany BLASTP Działanie programu Działanie programu opiera się na porównaniu podanej przez użytkownika sekwencji z sekwencjami w istniejącej bazie danych [7]. Porównywane są zawsze pary sekwencji, a następnie każdemu takiemu dopasowaniu zostaje przyporządkowana liczba punktów S proporcjonalna do podobieństwa dostarczonego celu do wzorcowej sekwencji. Wartość S obliczania jest poprzez zsumowanie punktów dla każdej dopasowanej pozycji 2 i luk. Za każdą dopasowaną pozycję do S dodawany jest jeden punkt. Do obliczenia punktów ujemnych za wystąpienie luk, w BLAST użyto afinicznego kosztu luk, który obciąża wynik wartością a za każde wystąpienie luki i wartością b dla każdej reszty aminokwasowej w luce. Luka złożona z k reszt otrzyma punktację (a + b k), a luka o długości 1 uzyska (a + b) punktów. Wartości a i b różnią się w zależności od odmiany BLAST. Dla użytego w projekcie BLASTP wynoszą one odpowiedno -11 i -1. Podobieństwo jest mierzone i pokazywane poprzez uszeregowanie dwóch sekwencji. Wyniki uszeregowania mogą być globalne lub lokalne (jest to zależne od algorytmu). Uszeregowanie globalne jest optymalnym uszeregowaniem, które zawiera wszystkie znaki z każdej sekwencji. Uszeregowanie lokalne zawiera tylko najbardziej podobne do siebie obszary obu sekwencji [7]. Rozróżnienie pomiędzy rzeczywistymi i błędnymi dopasowaniami wykonywane jest przy oszacowaniu prawdopodobieństwa możliwego wystąpienia dopasowania. Oczywiście samo podobieństwo nie jest wystarczające do wyrokowania o podobnej funkcji obszarów. 1 konwersja potrzebna aby móc porównywać białka z bazą danych nukleotydów 2 dopasowana pozycja to para tych samych aminokwasów na tych samych pozycjach względnych w porównywanych sekwencjach

39 3.1. Narzędzia biologiczne Algorytm Algorytm wyszukiwania odpowiednich uszeregowań można w uproszczeniu przedstawić w następujących krokach [17]: 1. podzielenie badanej sekwencji na nakładające się słowa 2. dla każdego ze słów określenie słów pokrewnych (neighborhood words), które jeśli zostaną znalezione w innej sekwencji, mają szansę stać się częścią MSP (Maximal Segment Pair) pary o najwyższej punktacji S spośród wszystkich par w porównywanych sekwencjach. 3. przeszukanie bazy w celu znalezienia słów pokrewnych 4. wydłużenie uszeregowania zaczynając od słowa pokrewnego 5. programowanie dynamiczne wokół MSP Parametry W pierwszych etapach szczególnie ważne są dwa parametry: długość słowa i minimum punktowe, które musi uzyskać słowo sparowane z innym, aby uszeregowanie zostało zainicjowane. Dla białek minimalna długość słowa wynosi 3, ale wymagane są dwa słowa w bliskiej odległości od siebie. Długość słowa i punktacja powinny być tak dobrane, aby zmaksymalizować prędkość (zminimalizować czas zajętości procesora) i dokładność przeszukiwania (znaleźć jak najwięcej homologii w bazie). Od tych parametrów zależy również częstość występowania dwóch błędów: pojawiania się w wynikach sekwencji, które nie są prawdziwymi homologiami (ang. false positives) i brak prawdziwych homologii w wyniku pominięcia ich przy przeszukiwaniu (ang. false negatives). Działaniem programu można sterować poprzez zmianę wartości progowych dwóch parametrów: długości słowa i punktacji minimalnej [17]. Gdy długość słowa zwiększa się dla danej punktacji minimalnej, prawdopodobieństwo znalezienia słowa pokrewnego w bazie maleje. Również zużycie czasu procesora zmniejsza się, ale obniża się też skuteczność przeszukiwania. Wzrasta też liczba słów pokrewnych. Gdy zmniejsza się minimalna punktacja dla danego słowa, liczba słów pokrewnych zwiększa się staje się proporcjonalna do e T (gdzie T to minimalna punktacja jaką musi otrzymać dane słowo sparowane z innym, aby dopasowanie zostało zainicjowane), wydłuża się też czas zajętości procesora, który jest proporcjonalny do liczby słów. Za cenę zwiększenia czułości następuje utrata specyficzności.

40 34 Narzędzia Rysunek 3.1: Przebieg porównywania sekwencji. Na czerwono i niebiesko zaznaczono serie zgodnych wartości. Podkreśleniem oznaczono HSP Rysunek 3.2: Logo programu LGScore Poszukiwanie MSP W BLAST została zaimplementowana metoda poszukiwania podobieństw MSP (Maximal Segment Pairs). Przebieg porównywania pary sekwencji został przedstawiony na rysunku 3.1. Stosuje się tam następującą punktację: +1 za każdą zgodność -1 za każdą niezgodność Najniższą wartością jest zero. Na podstawie przydzielonych punktów tworzone są HSP (ang. High Scoring Pairs),które można traktować jako potencjalne MSP. HSP to nie tylko serie identycznych aminokwasów w obu strukturach. Stosuje się też tzw. wydłużanie, które pozwala na wcielenie do HSP również niepasujących aminokwasów. Wydłużenie jest prowadzone do momentu osiągnięcia punktacji nie mniejszej od maksymalnej o ustaloną (parametrem x-dropoff ) wartość. Jest to najbardziej czasochłonny etap pracy BLAST. W kolejnym etapie na znalezionych HSP wykonywany jest algorytm Smith Watermana [13], a istotność szeregowania mierzona jest za pomocą statystyki Karlina i Altschula [12] i na tej podstawie sekwencje dołączane są do wyników programu.

41 3.1. Narzędzia biologiczne LGScore Program LGScore (logo na rysunku 3.2), użyty w projekcie, jest implementacją algorytmów porównujących dwa modele cząsteczek i określających ich podobieństwo. Jeden z modeli powinien być uzyskany przez użytkownika, drugi natomiast rzeczywistą strukturą. Obie cząsteczki powinny mieć tę samą numerację reszt aminokwasowych. Algorytm do obliczeń wymaga jedynie obecności wpółrzędnych położeń węgli C α Rodzaje LGScore LGScore istnieje w dwóch odmianach. Pierwsza z nich jest metodą zależną od uszeregowania. Próbuje ona odnaleźć jak najdłuższe przybliżone dopasowanie 3 (podobnie jak próbuje to robić MaxSub, patrz punkt 3.1.6) i oblicza dla niego punktację statystyczną (definicja 2). LGScore2 nie zależy od uszeregowania, pozwala więc między innymi na porównania nie obciążone błędami spowodowanymi przez pewne przesunięcia między częściami modeli Uruchomienie i wynik działania programu Do uruchomienia programu potrzebne są dwa modele białek w formacie PDB (Protein Data Bank) (patrz słownik). Pierwszy z nich to plik struktury użytkownika, drugi oryginalna struktura. Użytkownik wpisując LGscore uzyskany.pdb rzeczywisty.pdb otrzyma wynik podobny do następującego: SCORE: e-04 Oznacza on, że w pierwszym białku został odnaleziony fragment pokrywający 88% rzeczywistego modelu. Długość tego pokrycia wyniosła 28, a współczynnik rmsd (definicja 1) 0.9. Kolejnym elementem jest punktacja S (definicja 2) równa w tym przypadku 485, 2. Została również obliczona P-wartość 4 według ustaleń zawartych w [16] o poziomie 1.64e 4. Definicja 1 RMSD Root Mean Square Deviation - wyznacza standardowe odchylenie we współrzędnych kartezjańskich obliczone między zbiorem atomów 3 dopasowanie przybliżone to dopasowanie które pozawala na pewne niezgodności pomiędzy porównywanymi sekwencjami 4 najmniejszy poziom istotności, przy którym zaobserwowana wartość statystyki testowej prowadzi do odrzucenia hipotezy zerowej

42 36 Narzędzia pewnej struktury dynamicznej a odpowiadającym zbiorem struktury odniesienia (innej cząsteczki lub innej konfiguracji) [29]. Wzór służący do obliczenia współczynnika wygląda następująco [10]: RMSD (N; x, y) = [ Ni=1 w i x i y i 2 N N i=1 w i ] 1 2 (3.1) gdzie: N liczba pozycji atomów dla struktury x i odpowiadających im atomów ze struktury y w(i) współczynniki wag atomów ze struktury y Levitt i Gerstein [16] wprowadzili wartość pomiarową służącą do obliczania wagi podobieństwa pomiędzy dwoma strukturami będącymi w superpozycji. Definicja 2 (Levitt and Gerstein) Statystyczna waga podobieństwa pomiędzy parą białek S str Sstr = M ( (d ij /d 0 ) 2 N ) gap 2 (3.2) gdzie M jest równe 20, d ij jest odległością między resztami aminokwasowymi i a j, d 0 jest równane do 5Å (0.1 nm), a N gap jest liczbą przerw w uszeregowaniu. Aby obliczyć rzeczywiste znaczenie wyniku równania w definicji 2, użyto zbioru uszeregowań strukturalnych niepowiązanych ze sobą białek i wyznaczono rozkład wartości atrybutu S str w zależności od długości uszeregowania l. Z tego rozkładu obliczono P wartość zależną od S str i l [16]. Wartość S jest obliczana w ten sam sposób co LGScore, ale zamiast używać P-wartości zastosowano podział pomiaru S str przez długość modelu. Początkowo statystyki były ponownie liczone, aby lepiej radzić sobie z krótkimi fragmentami białek. Wyniki uzyskane z LGScore i LGScore2 są równoważne. Aby otrzymać jak najlepszy rezultat zaleca się przetestowanie plików obiema metodami i wykorzystanie dokładniejszego wyniku. Zdarzyć się może bowiem, że wynik uzyskany za pomocą LGScore2 będzie gorszy jeśli wstawiono lub usunięto duże fragmenty struktury. LGScore jest wykorzystywany również w konkursie CASP (punkt 2.2.3). Więcej o LGScore znaleźć można na stronie autorów, ~arne/lgscore/ oraz w dokumencie [5].

43 3.1. Narzędzia biologiczne Jmol Jmol jest narzędziem do wizualizacji molekularnej, który miał wspomagać pracę naukowców, tworząc wysokiej jakości obrazy białek, a także pozwolić osobom zainteresowanym tą dziedziną nauki na poznanie i zrozumienie podstawowej budowy związków chemicznych. Jmol [2] powstał w celu zastąpienia narzędzia Xmol (patrz słownik). Następujące przyczyny spowodowały powstanie Jmola: jakość obrazów tworzonych przez Xmol była dość niskiej jakości; źródła programu były niedostępne dla użytkowników, a projekt nie był rozwijany i z biegiem czasu wersje były przestarzałe. Powyższe argumenty sprawiły, że stworzono narzędzie z otwartymi źródłami, które działałoby sprawniej i szybciej, generując przy tym lepszej jakości obrazy. Okazało się jednak, że w miarę powstawania Jmol stał się narzędziem, które znacznie przewyższało funkcjonalnością Xmola i zdecydowanie wyparło go z rynku. Wydano kolejne wersje z wieloma dodatkowymi opcjami, sugerowanymi nawet przez samych użytkowników. Pod koniec 2002 roku zintegrowano Jmola z Chemical Development Kit (jest to biblioteka javowa wspomagająca chemię i bioinformatykę), w celu stworzenia pluginu mającego zastąpić plugin Chime. W miarę upływu czasu powstał nowy engine, który miał zapewnić, że aplet Jmola będzie działał bez wymagania dodatkowego wsparcia sprzętowego. Engine ponadto wspierał wizualizację dużego rozmiaru molekuł. Ostatecznie w grudniu 2004 wydano w pełni funkcjonalną wersję Jmola. Jmol jest apletem napisanym w Javie, który działa na plikach w formacie PDB (Protein Data Bank). Aplet umieszcza się na stronie internetowej z wykorzystaniem skryptu JavaScript, który bardziej szczegółowo opisany jest na stronie Wykorzystując funkcje ze skryptu, aplet otwiera i wizualizuje zawartość pliku PDB. Na rysunku 3.3 widoczny jest przykład wizualizacji aminokwasu MinRMS Istniejące algorytmy dopasowujące struktury białkowe generują sprzeczne wyniki, które trudno zinterpretować. Potrzebny był algorytm, który mógłby dostarczyć kontekst interpretacji dopasowań i wykorzystywałby prostą metodę do scharakteryzowania podobieństw struktur białkowych. MinRMS [25] jest programem, który znajduje minimalne RMSD (definicja 1 na stronie 35) pomiędzy dwoma białkami jako funkcję ilości dopasowań resztek par z heurystycznie ograniczoną przestrzenią szukania.

44 38 Narzędzia Rysunek 3.3: Przykład wizualizacji Jmol Algorytm uszeregowania wykorzystuje koordynaty węgli C α do reprezentacji każdej reszty kwasowej aminokwasu i ma złożoność obliczeniową O ( m 3 n 2), gdzie m i n oznaczają długości sekwencji białek. Z przyczyn praktycznych wyszukiwanie jest obszerne. Metoda jest wystarczająco szybka dla porównania umiarkowanych rozmiarów białek (mniejszych niż 800 reszt) na konkurencyjnych komputerach. MinRMS generuje rodzinę uszeregowań jako funkcję ilości dopasowanych par reszt. Dla dwóch białek o długości sekwencji m i n (n m), będzie m najlepszych uszeregowań RMSD. Aby ułatwić przeszukiwanie tych wielu dopasowań powstało narzędzie do wizualizacji, AlignPlot. Ten graficzny interfejs użytkownika pozwala w łatwy sposób przeszukać przestrzeń dopasowań. MinRMS jest programem nie posiadającym graficznego interfejsu użytkownika. Działa na dwóch plikach zapisanych w formacie PDB (Protein Data Bank). Uruchamiany jest z linii poleceń komendą: minrms filename1 filename2 Gdzie:

45 3.1. Narzędzia biologiczne 39 filename1, filename2 - pliki w formacie PDB zawierające strukturę białka Program można również uruchomić na kilka innych sposobów. Między innymi z wykorzystaniem pliku konfiguracyjnego lub z filtrami. Bardziej szczegółowe informacje znajdują się na stronie ContributedSoftware/minrms/minrms.html. MinRMS zwraca tablicę, w której zawarte są informacje o każdym uszeregowaniu struktury: liczba dopasowanych reszt RMSD (definicja 1) dla uszeregowania najdłuższą odległość pomiędzy jakąkolwiek parą dopasowanych uszeregowań wagę podobieństwa pary białek (definicja 2) macierz tranformacji dla uszeregowań struktur DSSP Program DSSP (ang. Database of Secondary Structure in Proteins) [23] służy do określania elementów struktur drugorzędowych w znanych strukturach białkowych. Innymi słowy definiuje strukturę drugorzędową oraz cechy geometryczne białek. Należy jednak zwrócić uwagę, że DSSP nie przewiduje struktury białka. Program został zaprojektowany przez Wolfgang Kabscha i Chrisa Sandera. DSSP jest bazą danych struktur drugorzędowych dla wszystkich białek zawartych w PDB (Protein Data Bank). Program działa na plikach w formacie PDB (Protein Data Bank). Można go uruchomić poleceniem: dsspcmbi filename Gdzie: filename - plik w formacie PDB zawierający strukturę białka Bardziej szczegółowe informacje o programie DSSP dotyczące uruchamiania można znaleźć na stronie Na rysunku 3.4 zamieszony jest przykładowy, uproszczony wynik działania programu DSSP. Każda linia zawiera następującą informację: RESIDUE dwie kolumny z numerami reszt. Pierwsza z nich jest sekwencyjnym numerem reszt DSSP, rozpoczynając od pierwszej reszty w zbiorze danych, włączając łańcuch przerw. Druga kolumna daje numery reszt sekwencji, kody wstawienia i identyfikatory łańcucha.

46 40 Narzędzia HEADER HYDROLASE (SERINE PROTEINASE) 17-MAY-76 1EST TOTAL NUMBER OF RESIDUES, NUMBER OF CHAINS, NUMBER OF SS-BRIDGES(TOTAL,INTRACHAIN,INTERCHAIN) ACCESSIBLE SURFACE OF PROTEIN (ANGSTROM**2) TOTAL NUMBER OF HYDROGEN BONDS OF TYPE O(I)-->H-N(J); PER 100 RESIDUES TOTAL NUMBER OF HYDROGEN BONDS IN PARALLEL BRIDGES; PER 100 RESIDUES TOTAL NUMBER OF HYDROGEN BONDS IN ANTIPARALLEL BRIDGES; PER 100 RESIDUES TOTAL NUMBER OF HYDROGEN BONDS OF TYPE O(I)-->H-N(I+2) TOTAL NUMBER OF HYDROGEN BONDS OF TYPE O(I)-->H-N(I+3) TOTAL NUMBER OF HYDROGEN BONDS OF TYPE O(I)-->H-N(I+4)... # RESIDUE AA STRUCTURE BP1 BP2 ACC N-H-->O O-->H-N N-H--> O O-->H-N 2 17 V B 3 +A 182 0A 8 180, ,-1.9 1, ,-0.1 TCO KAPPA ALPHA PHI PSI X-CA Y-CA Z-CA ; ; ; ; ; ; ; sequential resnumber, including chain breaks as extra residues.-- original PDB resname, not nec. sequential, may contain letters.-- amino acid sequence in one letter code.-- secondary structure summary based on columns xxxxxxxxxxxxxxxxx recommend columns for secstruc details.-- 3-turns/helix.-- 4-turns/helix.-- 5-turns/helix.-- geometrical bend.-- chirality.-- beta bridge label.-- beta bridge label.-- beta bridge partner resnum.-- beta bridge partner resnum.-- beta sheet label.-- solvent accessibility # RESIDUE AA STRUCTURE BP1 BP2 ACC I E R E > S- K 0 39C Q T 3 S (example from 1EST) N T 3 S W E < -KL 36 98C 6 Rysunek 3.4: Przykładowe wyjście programu DSSP

47 3.1. Narzędzia biologiczne 41 AA jednoliterowy kod aminokwasu S (pierwsza kolumna w bloku strukturalnym) streszczenie struktury drugorzędowej. Są to kolumny od 19 do 38, stanowiące główny wynik działania analizy DSSP na koordynatach atomów. BP1 BP2 numer reszty aminokwasowej pierwszego i drugiego mostka sąsiedztwa ACC numer molekuł połączonych wiązaniem wodorowym w kontakcie z resztą *10 N-H O wiązania wodorowe. Dla przykładu -3, -1.4 oznaczają, że jeśli ta reszta jest na pozycji i to N H z i jest powiązane h-wiązaniem z C=O z i-3 z elektrostatycznym energią H-wiązania równą -1.4 kcal/mol. Są dwie kolumny na każdy typ H-wiązania. TCO cosinus kąta pomiędzy resztą C=O z i a resztą C=O z i-1. Dla α -helis TCO ma wartość bliską + 1, dla promieni beta TCO jest bliskie -1. KAPPA wirtualny kąt wiązania zdefiniowany przez drzewo atomów C α reszt i -2, i, i +2. Używane do zdefiniowania odchylenia. ALPHA wirtualny kąt skrętu definiowany przez atomy C α reszt i -1, i, i +1. PHI PSI kąty skrętu podstaw peptydowych. X-CA Y-CA -Z-CA koordynaty atomów C α MaxSub Szacowanie dokładności przewidzianych modeli jest krytycznym dla metod obliczających struktury. Na przestrzeni kilku lat przeprowadzono kilka badań (CASP1, CASP2, CASP3 - punkt 2.2.3) w celu znalezienia metody, która w szybki sposób znajdowałaby rozwiązanie, a ponadto wynik tego rozwiązania byłby bardzo zbliżony do oszacowanego przez naukowca - eksperta. Algorytm MaxSub powstał w wyniku kolejnych eksperymentów w ramach CASP3. Jego celem jest zidentyfikowanie największego podzbioru atomów C α w modelu, który później produkuje pojedynczy i znormalizowany wynik reprezentujący jakość modelu. Dalsze badania porównujące działanie MaxSub z pracą ekspertów pokazały, że wyniki są bardzo podobne. Przyprowadzono sześć prób dla różnych białek i po obliczeniu uśrednionych wyników nie było właściwie żadnej znaczącej różnicy pomiędzy pracą naukowców a nowo powstałą metodą MaxSub. MaxSub jest programem, który wykorzystuje ten algorytm do oszacowania jakości struktury modelu białka. Uruchomienie wygląda następująco:

48 42 Narzędzia maxsub filename1 filename2 threshold Gdzie: filename1 - plik w formacie PDB (Protein Data Bank) zawierający przewidziany model filename2 - plik w formacie PDB zawierający strukturę białka threshold - próg odległości pomiędzy resztami aminokwasowymi modelu i struktury, domyślne to Technologie Java Java to obiektowy język programowania stworzony w firmie Sun Microsystems przez grupę roboczą pod kierownictwem Jamesa Goslinga. Technologia Javy pojawiła się w roku 1996 jako środowisko programistyczne JDK 1.0 (ang. Java Development Kit) i od tego czasu ewoluowała w trzech kierunkach: J2SE (ang. Java 2 Standard Edition) najbardziej rozpowszechniona wersja, stosowana w komputerach osobistych, J2EE (ang. Java 2 Enterprise Edition) wersja języka używana do tworzenia rozbudowanych aplikacji biznesowych, wykorzystywana w tzw. serwerach aplikacji, J2ME (ang. Java 2 Micro Edition) okrojona wersja języka Java przeznaczona dla telefonów komórkowych i innych urządzeń przenośnych (np. PDA). Kompilator Javy nie generuje kodu wykonywalnego specyficznego dla danej architektury systemowej, a kod pośredni tzw. B-code, który interpretowany jest przez maszynę wirtualną (ang. JVM Java Virtual Machine). JVM dostosowuje instrukcje zawarte w pseudokodzie do platformy i procesora, na którym uruchomiony jest program Javy. Dzięki temu programy napisane w Javie są przenośne i mogą działać na wielu różnych platformach systemowych, o ile wyposażono je w odpowiednie maszyny wirtualne. Java jest językiem zorientowanym na zastosowania sieciowe i przetwarzanie rozproszone. Dzięki obiektowości, dla Javy nie ma znaczenia, czy dane pobierane są z pliku, czy poprzez połączenie HTTP czy FTP. Wyspecjalizowane funkcje przetwarzania rozproszonego pozwalają zarówno na komunikację między aplikacjami Javy (RMI), jak i między aplikacjami napisanymi w innych językach (CORBA, WebServices). Inne biblioteki pozwalają na pisanie programów

49 3.2. Technologie 43 działających w przeglądarkach internetowych (aplety) oraz aplikacji działających po stronie serwera (serwlety). W zamierzeniu projektantów Java miała zastąpić C++ obiektową wersję języka C. Jej projektanci zaczęli od rozpoznania cech języka C++, które są przyczyną największej ilości błędów programistycznych, by stworzyć język prosty w użyciu, bezpieczny i niezawodny. O ile po pięciu odsłonach Javy jej prostota jest dyskusyjna, o tyle język faktycznie robi dużo, by utrudnić programiście popełnienie błędu. Przede wszystkim Java posiada system wyjątków, czyli sytuacji, gdy kod programu natrafia na nieprzewidywalne trudności, takie jak np.: czytanie z niedostępnego pliku lub nieprawidłowego adresu URL, podanie nieprawidłowych danych przez użytkownika. W innych językach programowania programista oczywiście może wprowadzić wewnętrzne testy sprawdzające poprawność danych, pozycję indeksu tablicy, inicjalizację zmiennych itd., ale jest to jego dobra wola i nie jest to jakoś szczególnie wspierane przez dany język. W Javie jest inaczej obsługa wyjątków jest obowiązkowa, bez tego program się nie skompiluje. Przy tym obiekty wchodzące w skład pakietu standardowego Javy implementują wyjątki w każdym miejscu kodu, którego wykonanie jest niepewne ze względu na okoliczności zewnętrzne. Wszystkie opisane cechy, czyli obiektowość, niezależność od platformy systemowej, rozwiązanie zagadnień sieciowych, bezpieczeństwo i niezawodność sprawiły, że Java jest obecnie jednym z najbardziej popularnych języków programowania na świecie i nic nie zapowiada, żeby miało się to w najbliższym czasie zmienić Eclipse Eclipse to udostępniona na zasadzie Open Source (patrz słownik) platforma służąca do integracji różnego typu narzędzi programistycznych [18]. Działają one w ramach jednego środowiska, co sprawia, że użytkownik przekonany jest, że ma do czynienia z zaawansowanym, ale pojedynczym produktem. Sam jest w stanie je skonfigurować dobierając takie moduły (pluginy), które odpowiadają realizowanym przez niego zadaniom. Standardowo Eclipse wyposażone jest w zestaw narzędzi do tworzenia aplikacji w języku Java. Oprócz tego, że zapewnia ono duży komfort pracy i jest wyjątkowo elastyczne, bardzo blisko potrafi integrować się z innymi modułami. Dostępne są moduły do pisania w języku C, C++, HTML, a nawet w Cobolu.

50 44 Narzędzia Eclipse został zaprezentowany w listopadzie 2001 roku przez IBM, Object Technology International (OTI) oraz osiem innych firm. Produkt został przyjęty entuzjastycznie.the New York Times napisał: Eclipse łamie dotychczasowy wzorzec produktu firmowego i pojawia się w kluczowym dla całej branży momencie... Filozofia, która przyświecała twórcom narzędzia, polega na tym, aby do maksimum zautomatyzować wszystkie powtarzalne i przyziemne wręcz czynności towarzyszące pisaniu programu, czyli zredukować czas potrzebny na ich wykonanie. Tym samym doprowadzono do sytuacji, gdy programista koncentruje się na rzeczach naprawdę istotnych. Dlatego uproszczono edycję kodu, sposób nawigacji, wprowadzono też mechanizmy, które pozwalaj na generowanie wielu typowych elementów programu. Szczególnymi częściami środowiska Eclipse są: edytor, brudnopis oraz debugger. Edytor, ma możliwość wyróżniania składni i uzupełniania kodu. Istnieje również kilka powiązanych z nim widoków, które służą do prezentacji struktury kodu, szybkiej w niej nawigacji oraz wskazują wszelkie miejsca, które należy uzupełnić bądź zweryfikować. Brudnopis (ang. scrapbook) pozwala na testowanie fragmentów kodu i budowanie wyrażeń bez konieczności uruchamiania całej aplikacji. Debugger jest narzędziem pozwalającym programiście na obserwację działania aplikacji krok po kroku. Daje ponadto możliwość podglądania zmiennych programu podczas jego działania. Eclipse to ponadto pewien rodzaj fundamentu, który umożliwia scalenie aplikacji służących do projektowania i modelowania, programowania, testowania czy też tworzenia np.plików graficznych. Eclipse osiąga to poprzez dostarczenie programiście określonej architektury, w której występuje zbiór reguł oraz klas pozwalających na tworzenie kolejnych modułów w ramach określonego standardu. Środowisko posiada również mechanizmy pozwalające na pracę zespołową. W roli systemu kontroli wersji występuje system CVS (patrz słownik). Dzięki niemu programista ma możliwość korzystania ze współdzielonego kodu. Natomiast automatycznie nadawane numery wersji pozwalają śledzić i synchronizować zmiany, a nawet stworzyć kilka gałęzi projektu w repozytorium. System pomocy w Eclipse jest to dostępna bezpośrednio dokumentacja oraz pomoc kontekstowa. Istnieje możliwość dołączenia do niej dodatkowych dokumentów, co nie wymaga żadnych umiejętności programistycznych. Ponadto można odwołać się do sieciowej wersji systemu pomocy. Eclipse to platforma, która jest nie tylko otwarta, ale również dostępna dla maksymalnej liczby osób. Również niepełnosprawnych. Środowisko można

51 3.2. Technologie 45 Tablica 3.1: Systemy operacyjne, na których można uruchomić platformę Eclipse System operacyjny Interfejs użytkownika Microsoft Windows XP, 2000, NT, 98, Me Windows Red Hat Linux 7.1 x86 Motif, GTK 2.0 SuSE Linux 7.1 x86 Motif, GTK 2.0 Sun Solaris 8 SPARC Motif IBM AIX 5.1 PowerPC Motif HP-UX 11i HP9000 Motif QNX x86 Photon Mac OS X Carbon uruchomić na wielu systemach operacyjnych. Pokazuje to tablica 3.1. Dzięki odpowiednio skonstruowanemu interfejsowi, wszystkie funkcje wykonywane typowo przy pomocy myszki dostępne są także z poziomu klawiatury. Eclipse współpracuje z oprogramowaniem, które odczytuje na głos zawartość ekranu. Dodatkowo można użyć systemu rozpoznawania mowy, do wydawania komend systemowych. Bogate możliwości w zakresie konfiguracji pozwalają dobrać odpowiednio duży rozmiar czcionki oraz jej kolor. Środowisko dostępne jest ponadto w wielu wersjach językowych. Przetłumaczone zostało na język niemiecki, włoski, hiszpański, francuski, japoński, koreański, chiński (uproszczony) oraz chiński (tradycyjny). Tłumaczenia te dostępne są nie tylko dla użytkowników samej platformy, ale również dla twórców modułów dodatkowych. Dzięki temu proces przygotowywania wersji narodowych jest uproszczony, a wejście na międzynarodowe rynki nie jest już tak trudną do pokonania barierą Tomcat Tomcat jest częścią szeroko zakrojonego projektu Jakarta Apache nadzorowanego przez Apache Software Foundation [15]. W skład Jakarty wchodzą różne narzędzia programistyczne wykorzystujące Javę biblioteki, interfejsy programistyczne API (patrz słownik), programy pomocnicze, szkielety aplikacji. Tomcat jest to otoczenie (kontener: patrz słownik) dla wykonywanych programów Javy, zgodne z opracowaną przez Sun specyfikacją serwletów, czyli odpowiedników apletów Javy (aplet: patrz słownik) wykonywanych po stronie serwera. Tomcat zajął miejsce zarzuconego projektu JServ i stanowi wzorcową implementację dwóch specyfikacji programistycznych Java Servlets oraz Java Server Pages.

52 46 Narzędzia Rysunek 3.5: Struktura aplikacji WWW. Serwer Tomcat może służyć jako niezależny serwer WWW lub współpracować z innymi serwerami najbardziej oczywistym partnerem jest Apache, chociaż możliwa jest integracja innych produktów za pomocą odpowiednich adapterów (adapter: patrz słownik) Tapestry Tapestry to szkielet aplikacji (ang. application framework) przeznaczony do budowy złożonych aplikacji WWW (ang. web application) przy wykorzystaniu technologii Java. Aplikacje Tapestry działają w ramach kontenera serwletów Java (np. Tomcat) lub serwera aplikacji (np. JBoss, WebSphere lub WebLogic), a samo Tapestry stanowi warstwę pośrednią pomiędzy kontenerem, a tymi aplikacjami (patrz rys. 3.5). Większość rozbudowanych aplikacji WWW budowana jest w oparciu o model MVC (ang. Model View Controller), zaproponowany po raz pierwszy przez firmę Xerox na początku lat osiemdziesiątych. Model ten zakłada podział aplikacji na trzy niezależne, współpracujące ze sobą jednostki: warstwę logiki biznesowej (Model), warstwę prezentacji (View), warstwę przetwarzania żądania (Controller). Tapestry zostało zaprojektowane, aby pełnić rolę warstwy prezentacji, a zatem jego zadania ograniczają się do prezentowania informacji użytkownikowi końcowemu (w postaci dokumentów HTML) oraz obsługi zdarzeń takich jak kliknięcie odnośników na stronie, czy przesłanie formularza. Głównym celem projektantów było jednak maksymalne uproszczenie procesu konstrukcji samej warstwy prezentacyjnej, a tym samym odciążenie programisty/projektanta od takich zadań jak: zarządzanie sesją, zarządzanie adresami URL (parsowanie i konstrukcja adresów URL), przetwarzanie formularzy.

53 3.2. Technologie 47 Każda aplikacja Tapestry składa się z takich elementów jak strony i komponenty. Szkielet Tapestry standardowo dostarcza już pewną liczbę komponentów, m.in. do obsługi formularzy, przetwarzania odnośników, czy kontrolowania przepływu sterowania w ramach stron HTML. Pozostałe można stworzyć samemu, korzystając z dostępnych narzędzi SYSDEO Sysdeo to plugin pozwalający na zarządzanie kontenerem serwletów Tomcat z poziomu Eclipsa. Plugin pozwala na: uruchamianie, zatrzymywanie i restartowanie pracy Tomcata, zintegrowanie konsoli Tomcata z konsolą Eclipsa, dodawanie projektów Java do ścieżki systemowej Tomcata (ang. classpath), eksportowanie projektów do plików *.war, wybranie pliku konfiguracyjnego dla Tomcata. Sysdeo w znacznym stopniu upraszcza proces uruchamiania aplikacji WWW działających pod kontrolą Tomcata, wspierając tym samym proces testowania projektu i oszczędzając czas pracy programistów Spindle Spindle to pakiet Eclipsa, który automatycznie generuje szkielet aplikacji Tapestry. Z jego pomocą można w łatwy sposób generować szkielety stron, komponentów i klas. Spindle automatycznie uzupełnia nazwy znaczników stosowane w plikach, podkreśla błędy i sugeruje poprawne nazwy znaczników JDO Java Data Objects (JDO) jest to interfejs API dostarczający obiektowego mechanizmu trwałości i standardowych interfejsów umożliwiających korzystanie z baz danych [21]. Interfejs JDO API, umożliwia bezpośrednie zapisywanie instancji obiektów Java do bazy danych w sposób trwały. Ponadto, korzystanie z JDO przynosi programiście następujące korzyści: przenośność aplikacja napisana w oparciu o JDO API może zostać uruchomiona na wielu implementacjach, bez potrzeby ponownej rekompilacji lub zmiany kodu źródłowego niezależność od systemu bazy danych

54 48 Narzędzia wygoda w użyciu programiści nie muszą przejmować się szczegółami odnośnie realizacji trwałości tworzonych przez nich obiektów, tym wszystkim zajmuje się właśnie JDO wysoka wydajność JDO optymalizuje sposoby dostępu do przechowywanych obiektów w celu zapewnienia optymalnej wydajności aplikacji integracja z mechanizmami EJB (ang. Enterprise Java Beans) (EJB: patrz słownik): aplikacje mogą korzystać z zaawansowanego mechanizmu EJB w celu zdalnego przekazywania komunikatów, automatycznej koordynacji rozproszonego przetwarzania oraz zapewnienia pewnego poziomu bezpieczeństwa JPOX JPOX (ang. Java Persistent Object JDO) jest to darmowa i w pełni zgodna implementacja interfejsu JDO w wersji 1.0 oraz 2.0, która zapewnia trwałość obiektów Java w stosunku do wszystkich proponowanych na rynku systemów baz danych [20]. Wspiera ponadto wszystkie główne wzorce obiektowo-relacyjnego mapowania (ang. Object-Relational Mapping), które pozwalają, przy wykonywaniu zapytań do bazy, na użycie mechanizmu JDOQL albo czystego SQL a. Rozpowszechniany jest na zasadzie licencji open source Apache 2, która pozwala nie tylko na dostęp do mechanizmu trwałości obiektów, ale także do kodu źródłowego JUnit JUnit jest to platforma testująca napisana przez Erich a Gamma e i Kent a Beck a [24]. Używana przez programistów oprogramowania, którzy wykorzystują mechanizmy testów jednostkowych (test jednostkowy: patrz słownik). Łatwo można zbudować testy pojedynczych klas i metod, jak i całe przypadki testowe dla programów w Javie. Umożliwia ponadto testowanie dużych aplikacji i automatyczne generowanie raportów z testów. JUnit jest projektem open source rozpowszechnianym na zasadzie licencji CPL (ang. Common Public License) (licencja CPL: patrz słownik).

55 3.2. Technologie JMock JMock jest to biblioteka służąca do testowania oprogramowania w języku Java za pomocą specjalnych obiektów o nazwie mock [8]. Mocki (ang. mock objects) bardzo ułatwiają pisanie testów jednostkowych. Programista może się wyłącznie skupić na testowaniu właściwej klasy nie martwiąc się o jej zależności, ponieważ ma gwarancję, że podstawione mocki zachowają się zawsze zgodnie z jego oczekiwaniami. Szczególnie wykorzystywane są tzw. mocki dynamiczne (mock dynamiczny: patrz słownik), które pozwalają ograniczyć liczbę tworzonych klas na potrzeby testów. Powstają w pamięci i dzięki temu nie obciążają projektu dziesiątkami dodatkowych klas testowych. Dodatkową zaletą jest proste definiowanie właściwie dowolnych zachowań i szerokie możliwości weryfikacji rzeczywistych interakcji testowanej klasy z podstawionym mockiem. Wykorzystanie mocka dynamicznego przebiega w następujący sposób: Stworzenie i zdefiniowanie mocka Podstawienie mocka do testowanej klasy Wywołanie testowanej metody Weryfikacja interakcji testowanej klasy z mockiem PostgreSQL PostgreSQL jest to, udostępniany na zasadzie open source, system obiektowo relacyjnych baz danych. Stworzony przez Uniwersytet Kalifornijski i rozwijany od ponad 15 lat, osiągnął bardzo dużą niezawodność, stabilność i poprawność w działaniu [28]. Posiada wyrafinowane narzędzia takie jak: algorytmy kontroli współbieżnego dostępu do danych (ang. Multi Version Concurrency Control) system znaczników czasowych (ang. timestamp) mechanizm asynchronicznych replikacji mechanizm punktów kontrolnych (ang.savepoints) mechanizm kopii online (ang. backup) zaawansowany optymalizator zapytań (ang. query optimizer) dzienniki systemowe (ang. logs) obsługę złożonych zapytań procedury składowane system perspektyw

56 50 Narzędzia PostgreSQL jest zgodny z większością standardów dotyczących baz danych. Implementacja języka zapytań SQL (patrz słownik), zastosowana w systemie, spełnia standardy ANSI SQL 92/99 oraz w dużej części standard z 2003 roku. Dzięki temu język SQL, oprócz standardowych operacji na bazie danych, wspiera zaawansowane mechanizmy podzapytań (włączając w to także podzapytania w klauzuli FROM) oraz transakcyjności. Aby zapewnić spójność danych, system zawiera obsługę szeregu ograniczeń takich jak: klucze podstawowe (ang. primary keys), klucze obce (ang. foreign keys) wraz z możliwością kaskadowego usuwania bądź aktualizacji powiązań. Ponadto zaimplementowana została obsługa różnego rodzaju ograniczeń jakie użytkownik może nałożyć na tworzone schematy baz danych. PostgreSQL oferuje także zaawansowany mechanizm indeksowania danych GiST (ang. Generalized Search Tree), w którym zostały zaimplementowane algorytmy sortowania i wyszukiwania takie jak: B drzewo, B+ drzewo, R drzewo i wiele innych. Dzięki zastosowaniu tych algorytmów poprawiono w znaczącym stopniu czas dostępu, jak i operacji na danych. Obsługa procedur składowanych może odbywać się w wielu językach programowania jak np. Java, Perl, Python, Ruby, Tcl, C/C++ i we własnym języku PostgreSQL PL/pgSQL, który jest podobny do komercyjnego systemy firmy Oracle PL/SQL. Jako projekt open source, PostgreSQL daje bardzo duże pole manewru w tworzeniu: nowych typów danych funkcji operatorów funkcji agregujących algorytmów indeksowania języków procedur Jest rozwijany przez osoby na całym świecie w celach komercyjnych, prywatnych oraz naukowych.

57 Rozdział 4 Budowa systemu 4.1 Funkcjonalność Współpraca z metaserwerami Użytkownik wprowadzając sekwencję aminokwasową do systemu WebMobis, może dokonać jej analizy za pomocą biologicznych serwerów obliczeniowych (patrz lista metaserwerów, punkt 4.1.5). Serwery te umieszczone są w różnych miejscach na całym świecie. System WebMobis dzięki swojej modułowej budowie posiada klasy, które pełnią rolę warstwy pośredniej w komunikacji między systemem a metaserwerami. Stanowią one pewnego rodzaju fundament w przetwarzaniu i analizie sekwencji aminokwasowych. Lista metaserwerów pobierana jest z klasy BioServersList za pomocą metody getall(). Użytkownik, chcąc przeprowadzić analizę konkretnej sekwencji, na stronie ShowSequence wybiera metaserwery obliczeniowe i naciska przycisk Analyze. Powoduje to wywołanie metody formsubmit() z klasy ShowSequence. Pobiera ona listę zaznaczonych metaserwerów a następnie za pomocą metody sendquery(map selectedservers) z klasy BioServerManager wysyła zapytanie z sekwencją aminokwasową. Użytkownik ma możliwość określenia czasu oczekiwania na zapytanie, wpisując datę w formacie DD/MM/YYYY do pola o nazwie Computation deadline. Może się zdarzyć, że po wysłaniu zapytania do metaserwerów trzeba będzie poczekać na wyniki, bądź też pojawi się błąd lub komunikat informujący o problemach, np. niedostępności serwerów. 51

58 52 Budowa systemu Rysunek 4.1: Autoryzacja użytkownika Obsługa użytkowników System Webmobis może być używany przez wielu użytkowników. Każdy z nich posiada swoją nazwę (ang.username, login) oraz hasło. Informacje te są potrzebne podczas procesu autoryzacji użytkowników. Rysunek 4.1 przedstawia główną stronę portalu, na której użytkownik podaje swoją nazwę i hasło. Podział na użytkowników wynika z tego, że każdy z nich posiada swoją własną listę białek, plików pdb i dopasowań (ang. alignmentów). Dzięki oddzieleniu użytkowników od siebie, białka oraz wyniki analiz są pamiętane oddzielnie dla każdego użytkownika. Użytkowników dzielimy na zwykłych i administratorów. Zwykły użytkownik może tylko zmieniać informacje dotyczące niego samego, natomiast administrator może zmieniać ustawienia swoje i innych użytkowników, usuwać i tworzyć innych użytkowników, w tym zwykłych i administratorów. W momencie pierwszego uruchomienia systemu tworzony jest użytkownik admin z hasłem biaue3k. Konto to pozwala administratorowi na szybkie i sprawnie dodawanie, usuwanie i zmienianie ustawień użytkowników systemu (patrz rys. 4.2). Należy pamiętać o zmianie hasła zaraz po pierwszym uruchomieniu systemu Webmobis. Użytkownik który po raz pierwszy wchodzi na główną stronę portalu może zarejestrować się samodzielnie. W tym celu musi kliknąć na odnośnik sign up i wpisać podstawowe informacje na swój temat: nazwę użytkownika, hasło i adres (patrz rys. 4.3, 4.4) Wprowadzenie sekwencji białkowej Po zalogowaniu się do systemu WebMobis, na stronie Headquater (patrz rys. 4.5), użytkownik ma możliwość wprowadzenia sekwencji aminokwasowej w formacie FASTA. Format ten zakłada, że każda sekwencja aminokwasowa składa się z ciągu literowych oznaczeń aminokwasów budujących łańcuch

59 4.1. Funkcjonalność 53 Rysunek 4.2: Funkcje dostępne administratorowi. Rysunek 4.3: Utworzenie nowego konta. Rysunek 4.4: Okno rejestracji użytkownika.

60 54 Budowa systemu polipeptydowy, poprzedzonych nagłówkiem postaci > nazwa sekwencji, np.: >proteinnr1 MTEITAAMVKELRESTGAGMMDCKNALSETNGDFDKAVQLLREK Sekwencja może zostać wpisana bezpośrednio z klawiatury do formularza (formularz Type in a new sequence rys. 4.5), pobrana z pliku za pomocą komponentu o nazwie UploadFasta (formularz Upload your sequence from file rys. 4.5) lub pobrana z bazy danych EMBL (formularz SRS retrieval - rys. 4.5). Za każdym razem tworzony jest nowy obiekt reprezentujący sekwencję, który zostaje przypisany do danego użytkownika. Rysunek 4.5: Strona Headquarter

61 4.1. Funkcjonalność Dodawanie własnych plików PDB Aby umożliwić użytkownikom wprowadzanie i analizę plików PDB, bez wprowadzania sekwencji FASTA, stworzono mechanizm dodawania pustej sekwencji w formularzu o nazwie New Protein (patrz rys. 4.5). Podając jedynie nazwę sekwencji uzyskuje się możliwość dodawania własnych plików PDB, a następnie ich analizę za pomocą narzędzi z pakietu biotools (patrz rozdział 3.1) Projekt i budowa komponentów analizy struktur białkowych Użytkownik wprowadzając sekwencję aminokwasową w formacie FASTA (patrz słownik) na stronie HeadQuater uzyskuje dostęp do strony ShowSequence (patrz rys. 4.6), na której może dokonywać analizy wcześniej wprowadzonej sekwencji za pomocą ośmiu dedykowanych metaserwerów: MGen EasyPred Wurst Sparks2 Gen Fugue2 Sam T02 Forte Planujemy również dodanie dzięwiątego metaserwera, zaprojektowanego przez studentów i pracowników Politechniki Poznańskiej. Metaserwery, jako wyniki swojego działania, przekazują: dopasowanie sekwencji aminokwasowych (ang. pairwise alignment) struktury trzeciorzędowe białek w postaci plików PDB W celu czytelnego pogrupowania i późniejszej analizy wyników, stworzone zostały trzy komponenty odpowiedzialne za przechowywanie otrzymanych wyników oraz ich późniejsze przetwarzanie Pairwise Alignment Table Komponent, przedstawiony na rys. 4.6, odpowiedzialny jest za pobieranie i wyświetlenie listy dopasowań dwóch sekwencji aminokwasowych z poszczególnych metaserwerów. Dostępne dopasowania pobierane są za pomocą metody getalignmentresults() z klasy Protein.

62 56 Budowa systemu Rysunek 4.6: Strona ShowSequence

63 4.1. Funkcjonalność 57 Rysunek 4.7: Zawartość dopasowania przedstawiona na stronie AlignmentView Elementy z listy dopasowań są obiektami klasy PairwiseAlignmentItem, posiadającymi następujące składowe: nazwa pliku przedstawiającego dopasowanie (ang. filename) kolumna Alignment zawartość dopasowania (ang. content) nazwę przetwarzającego metaserwera (ang. serverdescriptor) kolumna Server status operacji (ang. status) kolumna Status datę zmiany statusu (ang. statustime) kolumna Operation time Uzytkownik ma możliwość dokładnego zapoznania się z wyliczonym przez metaserwer dopasowaniem po naciśnięciu na odpowiadającym mu pliku z kolumny Aligment. Zawartość dopasownia przedstawiana jest na osobnej stronie AlignmentView (patrz rys. 4.7). Metaserwery mogą z pewnym opóźnieniem przesyłać wyniki. Stąd, do rozróżniania wyników dostępnych od niedostępnych i błędnych, wprowadzono pole status, które może przyjmować następujące wartości (opisane szczegółowo ) Dzięki statusowi uzytkownik może zobaczyć, czy przetwarzanie zakończyło się pomyślnie, czy też wystąpił określony problem. Komponent umożliwia usuwanie z listy poszczególnych dopasowań.odbywa się to poprzez zaznaczenie jednego, bądź kilku elementów i wywołanie metody deleteselected() przy pomocy przycisku o nazwie Delete selected. Dostępny jest również przycisk ręcznego odświeżenia okna komponentu, w celu sprawdzenia czy poszczególne elementy z listy dopasowań nie zmieniły statusu na odebrany (ang. Result received), co oznacza poprawne przetworzenie zapytania. Zadanie to realizuje przycisk o nazwie Update Secondary Structures Table Do reprezentacji otrzymanych struktur drugorzędowych, służy komponent o nazwie SecondaryStructuresTable przedstawiony na rysunku 4.6. Pobiera on

64 58 Budowa systemu i prezentuje struktury drugorzędowe białek otrzymane jako wynik działania narzedzi z pakietu biotools. Pobranie elementów następuje za pomocą metody getsecondaryresults(), która pobiera je z kolekcji secondaryresults w klasie Protein. Poszczególnym strukturom drugorzędowym zostaje przypisany odpowiedni status, zgodnie ze stanem przetwarzania, w jakim się znajduje (opisane szczegółowo ). Następnie już jako obiekty klasy SecondaryStructuresItem wyposażone w następujące pola: zawartość struktury (ang. contentstructure) kolumna Struct nazwę przetwarzającego narzędzia z pakietu biotools (ang. tooldescriptor) kolumna Tool status operacji (ang. status) kolumna Status datę zmiany statusu (ang. statustime) kolumna Operation time trafiają do listy obiektów o nazwie list. Korzystając z metody getsecondstructlist() mechanizm Tapestry generuje elementy HTML komponentu. Prezentacja budowy określonej struktury drugorzędowej pokazana jest w kolumnie o nazwie Structure, jeżeli struktura została poprawnie przetworzona. Jeżeli struktura nie jest jeszcze dostępna, to zgodnie ze statusem z pola Status, w kolumnie Structure zamiast struktury pojawi się jeden z komunikatów opisanych w punkcie Podobnie jak w komponencie PairwiseAlignment wprowadzone zostało pole status pokazujące aktualny stan przetwarzania struktury, który może zostać odświeżony przez użytkownika, za pomocą przycisku Update. Szczegółowa specyfikacja wartości tego pola znajduje się w punkcie Ponadto istnieje możliwość usunięcia z systemu jednej bądź kilku struktur drugorzędowych, wywołując przyciskiem Delete selected, metodę deleteselected() PDB Result Table Mataserwery, oprócz dopasowań dwóch sekwencji (ang. pairwise alignment), przekazują rezultaty w postaci plików PDB, które reprezentują struktury trzeciorzędowe białek. Komponent PdbTable, przedstawiony na rysunku 4.8, ma za zadanie poprawnie odczytać listę plików PDB z kolekcji elementów o nazwie pdbresults z klasy Protein, za pomocą metody getpdbresults(). Pobrane wyniki są dodawane do kolekcji PdbFileList jako obiekty klasy PdbItem, co umożliwia ich późniejsze wyświetlenie i przetwarzanie. Każdy obiekt klasy PdbItem posiada: nazwę pliku przedstawiającego strukturę trzeciorzędową (ang. file) kolumna PDB filename

65 4.1. Funkcjonalność 59 Rysunek 4.8: Strona ShowSequence komponent PdbTable zawartość pliku PDB (ang. content) nazwę przetwarzającego metaserwera (ang. serverdescriptor) kolumna Server status operacji (ang. status) kolumna Status identyfikator w bazie danych (ang. resultid) datę zmiany statusu (ang. statustime) kolumna Operation time Do sygnalizacji użytkownikowi różnego typu błędów jak i opóźnień przetwarzania, służy pole status. Dokładna specyfikacja wartości tego pola znajduje się w punkcie Jeżeli wszystko odbywa się poprawnie, to użytkownik otrzymując poprawny wynik z metaserwera w postaci pliku PDB, może dokonać jego analizy za pomocą wymienionych narzedzi z pakietu biotools. Każdy plik PDB można obejrzeć w widoku 3D za pomocą narzędzia Jmol (patrz punkt 3.1.3), dostępnego w kolumnie Options. W momencie wybrania opcji Jmol, użytkownik uzyskuje dostęp do strony JmolView, na której może obejrzeć wizualizację danego pliku PDB, korzystając z różnych opcji tego narzędzia. Ponadto z komponentem są zintegrowane następujące narzędzia: LGScore DSSP MinRMS

66 60 Budowa systemu MaxSub Dostępne są one pod listą plików PDB. Dodatkowo wprowadzona została kontrola błędów, ponieważ część z wymienionych narzędzi potrzebuje więcej niż jeden plik PDB do swojego przetwarzania. Konieczne było także rozróżnienie ilości zaznaczonych przez użytkownika plików PDB. Realizuje to metoda getselectedpdbfiles(int numbertoget). Wszelkie błędy związane z zaznaczeniem niepoprawnej ilości plików PDB do przetwarzania, zgłaszane są w postaci odpowiedniego komunikatu pod dostępnymi narzędziami. Użytkownik ma możliwość dołączenia swoich własnych plików PDB, które posiada u siebie lokalnie, dzieki zintegrowanemu komponentowi Uploads. Możliwość dodawania własnych plików PDB do konkrentej sekwencji jest bardzo istotne z punktu użyteczności komponentu PdbTable. Wspomnianą użyteczność komponentu rozszerza możliwość ściągnięcia pliku PDB i jego zapisania lokalnie na komputerze uzytkownika. Realizowane jest to poprzez naciśnięcie na nazwie wybranego pliku PDB w kolumnie PDB filename. Istnieje ponadto możliwość usuwania zaznaczonej ilości plików PDB za pomocą metody deleteselected(), dostępnej pod przyciskiem o nazwie Delete selected. Odświeżanie dostępnych wyników PDB następuje w momencie odświeżenia strony ShowSequence, bądź ręcznie poprzez przycisk o nazwie Update Status przetwarzania Każdy rezultat przetwarzania posiada pole status, które informuje użytkownika o stanie przetwarzania. Pole te może przyjmować następujące wartości: Success poprawna odpowiedź metaserwera Sent pomyślne wysłanie zapytania do metaserwera Sending wysyłanie zapytania do metaserwera w toku Page error niepoprawny adres strony serwera Server error niepoprawny adres metaserwera Query error błąd w treści zapytania Address error błąd w adresie URL serwera IO error błąd połączenia z metaserwerem Pdb mail error brak pliku PDB w wiadomości (ang. mail) Timeout przekroczenie czasu oczekiwania na wynik przetwarzania Parsing mail error błąd podczas pobierania pliku PDB z wiadomości nadesłanej przez metaserwer

67 4.2. Serwer HTTP 61 Service unavailable metaserwer jest niedostępny Result received wynik przetwarzania poprawnie odebrany Quota Error przekroczenie dostępnego miejsca Ponadto, w kolumnach reprezentujących nazwy przekazanych wyników mogą zamiast nazw wyników pojawić się dodatkowe komunikaty: Processing ERROR występuje dla każdego rodzaju błędu z pola status Not Available Yet zapytanie zostało wysłane, ale nie jest jeszcze dostępne do dalszej analizy (oczekiwanie na rezultat przetwarzania) Dodawanie plików PDB W projekcie każdy użytkownik ma możliwość wprowadzania własnych plików PDB, dołączając je pod już istniejącą sekwencję albo tworząc pustą (patrz podrozdział 4.1.4). Zadanie to realizuje komponent o nazwie Uploads. Odpowiedzialny jest on za poprawne odczytanie pliku PDB i utworzenie obiektu klasy PdbResult, której zadaniem jest przechowywać informacje o wszystkich plikach PDB w systemie. Dla dodawanego ręcznie pliku PDB, w obiekcie klasy PdbResult, pamiętana jest nazwa pliku, czas dodania, zawartość oraz status, który informuje o tym, iż plik nie jest wynikiem automatycznego przetwarznia za pomocą metaserwerów Wizualizacja Jmola Pliki PDB, dostępne na stronie ShowSequence (rys. 4.8) zawierają opis struktury białka w przestrzenii 3D. Do wizualizacji tych plików wykorzystujemy applet Jmol dostępny na stronie JmolView portalu. Szczegółowy opis można znaleźć w punkcie Serwer HTTP Strona wizualna Użytkownik systemu Webmobis komunikuje się z systemem Webmobis korzystając z przeglądarki internetowej takiej jak np. Internet Explorer czy Mozilla Firefox. Tym samym strona wizualna projektu została zaimplementowana za pomocą języka HTML. HTML to hipertekstowy język znaczników zaprojektowany przez Tima Berners-Lee w 1981 roku. Rewolucyjność HTML a polega na tym, że użytkownik może przemieszczać się od jednego dokumentu

68 62 Budowa systemu Rysunek 4.9: Overlib: wyjaśnienie funkcji. do drugie nie wiedząc gdzie fizycznie te dokumenty się znajdują, klikając na tzw. odnośniki (ang links). Poza HTML em wykorzystaliśmy style CSS (ang. Cascading Style Sheets), które pozwalają na łatwe zarządzanie wyglądem strony. Dzięki temu zmiana wyglądu np. tła, kolorów, tabel itd. sprowadza się tylko do niewielkiej modyfikacji odpowiedniego pliku.css, przez co nie trzeba modyfikować plików HTML. Jest to bardzo wygodne narzędzie dla projektanta Ruchome menu Aby ułatwić pracę użytkownikom, stworzone zostało menu pozwalające na prostą i wygodną nawigację na stronie. Wykorzystano do tego celu technologię HTML, JavaScript (patrz słownik) i CSS. Dużą zaletą menu jest jego stała pozycja: znajduje się zawsze na górze widocznego obszaru okna przeglądarki, nawet przy przewijaniu strony. Efekt ten został uzyskany dzięki użyciu opcji ustalonej, stałej pozycji w przeglądarkach poprawnie interpretujących CSS (m. in. Mozilla Firefox, Opera, Konqueror). W przypadku Microsoft Internet Explorer pozycja menu utrzymywana jest dzięki JavaScript System podpowiedzi W WebMobis zaimplementowany został system podpowiedzi (ang. hints), mający na celu ułatwienie osobom rozpoczynającym pracę w serwisie zorientowanie się w jego funkcjach. Wykorzystana została darmowa biblioteka OverLib ( Podpowiedź ukazuje się, gdy użytkownik ustawi kursor nad opisanym elementem. Przykładowe podpowiedzi mogą wyjaśniać działanie obiektu (rysunek 4.9), a także niektóre pojęcia (rysunek 4.10).

69 4.2. Serwer HTTP 63 Rysunek 4.10: Overlib: objaśnienie opcji wraz z opisem technicznym (zielony kolor) Obsługa błędów i wyjątków Obsługa błędów i wyjątków, które mogą pojawić się podczas pracy systemu, to jedno z głównych wymagań jakie stawia się przed każdym dobrze zaprojektowanym systemem informatycznym. W systemie Webmobis błędy mogą wynikać z następujących przyczyn: niepoprawne wprowadzenie nazwy i hasła przy autoryzacji, niepoprawne wpisanie sekwencji w formacie Fasta, niepoprawne wypełnienie formularza przy rejestracji, wygaśnięcie sesji, utrata połączenia z bazą danych, wybranie większej lub mniejszej liczby plików pdb do analizy. Tego typu błędy bardzo trudno zlikwidować, ponieważ nie zależą od twórcy systemu, a od środowiska i użytkowników, którzy z niego korzystają. Aby rozwiązać ten problem utworzono procedury informujące użytkownika końcowego o powstałym problemie oraz sugerujące co należy zrobić, aby go rozwiązać. W sytuacji gdy użytkownik wprowadzi niepoprawne dane przy autoryzacji wówczas może otrzymać komunikaty pokazane na rysunkach 4.11 i O błędzie wygaśnięcia sesji użytkownik informowany jest w sposób pokazany na rysunku Innego rodzaju błędy, które mogą się pojawić, wyświetlane są w sposób przedstawiony na rysunku 4.14.

70 64 Budowa systemu Rysunek 4.11: Użytkownik nie wprowadził ani hasła, ani loginu, a próbuje się zalogować. Rysunek 4.12: Użytkownik niepoprawnie wprowadził login lub hasło. Rysunek 4.13: Informacja o tym, że sesja użytkownika wygasła. Rysunek 4.14: Nieoczekiwany błąd wraz opisem.

71 4.3. Zewnętrzne narzędzia Opracowanie sposobu przekazywania parametrów pomiędzy stronami w technologii Tapestry Technologia Tapestry znacznie upraszcza zarządzanie projektami aplikacji WWW. Dotyczy to również aspektu związanego z przekazywaniem parametrów między kolejnymi stronami. Twórca systemu nie musi przejmować się takimi zagadnieniami jak konstrukcja sesji, budowa adresów URL do poszczególnych stron czy dodawaniem do nich parametrów. Tym wszystkim zajmuje się Tapestry. Programista musi tylko określić, co chce przekazywać między kolejnymi stronami. Dane mogą być przekazywane w dwojaki sposób. Pierwszy z nich polega na wykorzystaniu formularza. Użytkownik podając dane, wypełnia wszystkie pola, po czym zatwierdza je naciskając przykładowo przycisk Add sequence po wprowadzeniu sekwencji (patrz rys. 4.5). W tym momencie każde wprowadzone pole zostaje przesłane do serwera, gdzie następuje przetworzenie danych i zwrócenie wyników w postaci komunikatu błędu lub jako nowa strona. Drugi sposób przekazywania parametrów związany jest z odnośnikami (ang. links). W adresie URL obok adresu samego serwera można wprowadzić dodatkowe parametry np. W tym przypadku do adresu dodane zostały dwa parametry protein i user. Pierwszy z nich ma wartość Hemoglobine i oznacza białko, które chcemy analizować, drugi oznacza użytkownika, który zleca żądanie. Wszystkie parametry oddzielone są od adresu serwera za pomocą znaku?, natomiast same parametry oddzielone są między sobą przy pomocy znaku & System Webmobis wykorzystuje obie metody przekazywania parametrów. 4.3 Zewnętrzne narzędzia Większość narzędzi użytych w projekcie obsługiwana jest w podobny sposób. Są one uruchamiane za pomocą skryptów w trybie tekstowym. Wykorzystanie skryptów bash a niesie za sobą także obsługę odpowiednich kodów standardowych błędów. W związku z tym napisana została ogólna nadklasa, która nadzoruje cały proces od uruchomienia do zakończenia programu. Uniknięto w ten sposób wielu powtórzeń w podklasach odpowiedzialnych za pojedyncze narzędzie. Stworzoną klasę nazwano BioTools. Poza metodą uruchamiania narzędzi i przechwytywania wyników ich działania, klasę uzupełniono także o metody służące pobieraniu

72 66 Budowa systemu ścieżek do zainstalowanych narzędzi (punkt 4.3.1) oraz dodawania ewentualnych dodatkowych paramaterów dla programów. W skład całego pakietu BioTools wchodzą następujące klasy: BioTools (nadklasa) Blast MaxSub MinRMS LGScore DSSP Wszystkie klasy dziedziczące po BioTools w budowie i działaniu nie różnią się od siebie w znaczący sposób. Jednak zostały umieszczone osobno ze względu na różnicę w poleceniach wykonania i liście paramaterów. W każdej klasie jest konstruktor, który pozwala na stworzenie obiektu, z bezpośrednim ustawieniem parametrów oraz metody pozwalające na zrobienie tego manualnie. Wszystkie narzędzia działają na plikach i niestety nie ma możliwości przekazania struktury do programu jako łańcuch znakowy. W tym celu powstała klasa TempFileManager do zarządzania tymczasowymi plikami, bardziej szczegółowo opisana w punkcie Po stworzeniu obiektu i ustawieniu paramaterów tworzony jest plik lub pliki ze strukturami, w zależności od tego jak działa program (więcej szczegółów zostało przedstawionych w punkcie 3.1). Następnie na danym obiekcie wywoływana jest metoda execute() dziedziczona z nadklasy BioTools. Po wykonaniu zostaje zwrócony łańcuch wynikowy i usuwane są pliki tymczasowe. Wszystkie klasy w pakiecie działają dokładnie tak samo, z wyjątkiem klas Blast i MaxSub. W klasie Blast, metoda execute() jest przeciążona i po wykonaniu metody z superklasy dodatkowo parsowany jest łańcuch wynikowy w celu utworzenia kolekcji uszeregowań. Inna sytuacja ma miejsce w klasie MaxSub. Tutaj różnica polega na tym, iż metoda execute() nie wykonuje bezpośrednio programu, tylko skrypt uruchamiający MaxSub. Szczegóły opisane są w punkcie Dodatkowo dla potrzeb narzędzi zostały napisane skrypty instalacyjne, które bardziej szczegółowo opisane są w punkcie Skrypt instalacyjny Aby ułatwić pracę osobom instalującym WebMobis, stworzony został zestaw skryptów instalacyjnych dla narzędzi biologicznych (3.1). Starano się maksymalnie uprościć zadanie użytkownika i zwolnić go od obowiązku znajomości

73 4.3. Zewnętrzne narzędzia 67 adresów internetowych pod którymi pobrać można pakiety z narzędziami, metod ich kompilacji (MinRMS) czy też dopisywaniu ich do odpowiednich ścieżek. Struktura katalogów instalatora wygląda następująco: [bioinstall] --[files] - katalog tymczasowy dla plików ściągniętych z sieci --[unpacked] - rozpakowane pliki z internetu --[scripts] - zawiera skrypty dla poszczególnych narzędzi --[files] - programy ściągnięte przez użytkownika do instalacji --iblast.sh - skrypt instalujący blast --idssp.sh - skrypt instalujący DSSP --ijmol.sh - skrypt instalujący JMol --ilgscore.sh - skrypt instalujący LGScore --imaxsub.sh - skrypt instalujący MaxSub --iproperties.sh - skrypt ustawiający właściwości --properties.conf - plik z właściwościami instalatora --Instal.sh - główny skrypt instalacyjny Rysunek 4.15: Ekran instalatora biotools Obsługę instalatora można przedstawić w kilku krokach. Aby rozpocząć instalację, należy najpierw ustawić opcje w pliku properties.conf. Przykładowe ustawnienie wygląda następująco: INSTALL_DIR_PREFIX=home INSTALL_DIR=biotools PROJECT_PATH_PREFIX=home PROJECT_PATH=workspace/webmobis Opis poszczególnych zmiennych znajduje się poniżej:

74 68 Budowa systemu INSTALL DIR PREFIX wpis może przyjąć wartość home jeśli użytkownik chce instalować narzędzia w katalogu domowym, lub / jeśli chce użyć katalogu głównego; INSTALL DIR podkatalog INSTALL DIR PREFIX w którym mają znaleźć się narzędzia; PROJECT PATH PREFIX analogicznie do INSTALL DIR PREFIX, tylko docelowym katalogiem będzie tutaj katalog z projektem WebMobis, w którego konfiguracji konieczne jest wpisanie ścieżki do bionarzędzi; PROJECT PATH analogicznie do INSTALL DIR. Po zakończeniu ustawiania pliku properties.conf, należy uruchomić instalator za pomocą skryptu Install.sh. Jeśli w systemie zainstalowano program dialog 1, zostanie wyświetlone okienko dialogowe (rysunek 4.15), gdzie wybrać można programy, które mają zostać zainstalowane. W przeciwnym wypadku użytkownik zostanie poproszony o wpisanie nazw narzędzi. Po zakończeniu wyboru, sterowanie przejmują pomniejsze skrypty, specyficzne dla każdego z narzędzi. Każdy z nich sprawdza, czy użytkownik nie dograł do katalogu files spakowanej wersji programu. Jeśli nie, następuje próba ściągnięcia z Internetu najświeższej wersji. Następnie archiwa są rozpakowywane i wykonywane są czynności instalacyjne, inne dla każdego programu (np. BLAST wystarczy rozpakować, natomiast minrms wymaga kompilacji). Katalog docelowy jest pobierany z properties.conf. Ażeby uniezależnić działanie samego projektu od wersji programów, w katalogu docelowym tworzone są dowiązania symboliczne. Po zakończeniu pracy skryptu, wybrane narzędzia powinny się znaleźć w katalogu wpisanym w konfiguracji, a plik projektu webmobis.properties wskazywać na ten katalog Jmol Jmol jest jedynym z narzędzi, które nie dziedziczy po klasie BioTools. Spowodowane jest to różnicą w uruchamianiu, gdyż jak to zostało napisane w punkcie 3.1.3, Jmol jest apletem javowym. W związku z tym jest dołączony do projektu i umieszczony na serwerze. Kiedy użytkownik chce wizualizować strukturę, zostaje utworzona strona HTML z apletem (wcześniej, jest on ściągnięty lokalnie), dodatkowo wykorzystująca gotowy skrypt napisany w języku JavaScript. 1 Dialog służy do wyświetlania okienek dialogowych w trybie tekstowym powłoki. Autor: Savio Lam,

75 4.3. Zewnętrzne narzędzia 69 Rysunek 4.16: Strona JmolView Klasa Jmol powstała właśnie w celu tworzenia kodu HTML strony, na której umieszczony jest aplet. Jej metody generują nagłówek HTML z danymi odnośnie skryptu oraz ciało strony (ang. body). Strona HTML z wykorzystaniem skryptu umożliwia dodatkowe zarządzanie apletem, tj. rotacje struktury, wyświetlanie wiązań. Ponadto w kodzie zawarta jest informacja o nazwie pliku, w którym umieszczona jest nasza struktura. Wadą apletów jest to, że działają tylko po stronie klienta, a w konsekwencji mogą wykorzystywać dane pobrane tylko i wyłącznie z serwera, z którego aplet pochodzi. W związku z powyższym należało napisać aplikację, która przekazałaby do apletu żądany przez użytkownika plik PDB. Stworzony został serwlet (patrz słownik), którego zadaniem jest pobranie z bazy danych odpowiedniej struktury i wysłanie jej przez HTTP bez ingerencji użytkownika. Metoda klasy Jmol generująca stronę HTML, wstawia w ciało strony przekazany jako parametr identyfikator struktury w bazie danych. Przykład wizualizacji Jmol pokazany jest na rysunku 4.16.