Leszek Wawiórka. Rybosomalne białka P Plasmodium falciparum jako potencjalny składnik szczepionki przeciwko malarii

Transkrypt

1 Leszek Wawiórka Rybosomalne białka P Plasmodium falciparum jako potencjalny składnik szczepionki przeciwko malarii Przedmiotem pracy jest pentameryczny kompleks białek P P0 ( ) -(P1-P2) 2 zarodźca malarii Plasmodium falciparum, który wykazuje właściwości immunogenne oraz sposób otrzymywania tego kompleksu z zastosowaniem genetycznego układu w formie kasety ekspresyjnej zawierającej policistronowy układ trzech genów. Malaria jest obecnie jedną z najniebezpieczniejszych i najszybciej rozprzestrzeniających się chorób zakaźnych w rejonach tropikalnych, wywoływaną przez pierwotniaki z rodzaju Plasmodium. Najcięższy przebieg choroby wywołują infekcje zarodźcem o nazwie Plasmodium falciparum wykazującym dużą oporność na znane leki. Jedyną skuteczną metodą walki z malarią jest więc zastosowanie szczepionki, zawierającej właściwy antygen, wywołujący rodzaj określonej odporności immunologicznej, chroniącej organizm przed objawami klinicznymi malarii. Obecnie brak jest skutecznej szczepionki, która w pełni zabezpieczałaby przed infekcją tym pierwotniakiem i objawami klinicznymi choroby. Problem ten związany jest ze skomplikowanym cyklem rozwojowym zarodźca i ogromną zmiennością antygenów powierzchniowych charakterystycznych dla poszczególnych etapów rozwoju tego patogennego pierwotniaka (Waters, A. Cell 124, 2006r). Cykl życiowy zarodźca malarii Plasmodium falciparum obejmuje kilka stadiów rozwojowych w organizmie człowieka i komara, związanych z obecnością charakterystycznych antygenów indukujących specyficzną odpowiedź immunologiczną u człowieka. Ukłucie człowieka przez kilka gatunków komarów z rodzaju Anopheles powoduje wstrzyknięcie do krwioobiegu tzw. sporozoitów, które poprzez naczynia krwionośne dostają się do komórek wątroby, co daje początek tzw. hepatocytarnej fazie rozwoju pasożyta. W hepatocytach sporozoity przekształcają się w tzw. schizonty, a po około 7 dniach z wątroby do krwioobiegu, uwalniane są tzw. merozoity, infekujące czerwone ciałka krwi. Stadia te namnażają się w erytrocytach i dalej przekształcają się w trofozoidy, które rozwijając się dają nowe pokolenie schizontów, tzw. schizonty erytrocytarne. Te z kolei różnicują się w merozoity zakażające kolejne erytrocyty,

2 powodując lawinowy proces infekcji. Pewna pula trofozoidów może rozwijać się w gametocyty będące płciowym stadium rozwojowym zarodźca malarii. Dalszy rozwój pasożyta odbywa się w organizmie komara, do którego gametocyty dostają się wraz z krwią człowieka w momencie ukłucia. W ciele komara następuje aktywacja gametocytów (męskich i żeńskich), które łącząc się tworzą zygotę dającą początek pokoleniu diploidalnemu. Zygota przekształca się dalej w ookinete, ta zaś w oocystę produkującą bardzo liczne formy infekcyjne- sporozity (Waters, A. Cell 124, 2006r). Znane strategie opracowania potencjalnych składników szczepionki przeciw malarii oparte są właśnie na licznej grupie specyficznych antygenów pasożyta dla różnych jego stadiów rozwojowych. Dotychczas określono szereg antygenów z różnych faz rozwojowych zarodźca będących potencjalnymi składnikami szczepionki. Spośród antygenów fazy preerytrocytarnej, białko CSP (circumsporozoite protein) opisane zostało jako immunodominujący epitop, i stanowi bardzo obiecujący cel do opracowania szczepionki. Badania kliniczne prowadzone obecnie przez firmę GlaxoSmithKline Biologicals, testującą szczepionkę RTS,S/AS02A opartą na białku CSP z P. falciparum 3D7, zawierającą dwa aktywne polipeptydy RTA i S (Gordon D.M., J. Infect. Dis., 171, 1995r). Opracowano także inne potencjalne szczepionki na bazie białka CSP, takie jak: ICC-1132 CS/hepatitis B z Apovia Inc., San Diego (Birkett A., Infect. Immun. 70, 2002r). Wiele badań wykazało, że inne antygeny powierzchniowe pasożyta fazy preerytrocytarnej mogą być także potencjalnie wykorzystane jako szczepionka lub też jako jeden z elementów szczepionki kombinowanej (Ballou W. R., Am. J. Trop. Med. Hyg., 71(Suppl2), 2004r.) Zidentyfikowano szereg antygenów charakterystycznych dla fazy erytrocytarnej. I tak, najważniejszym antygenem jest białko MSP1 (Merozoite Surface Protein 1) na podstawie którego opracowywane są obecnie szczepionki wywołujące odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko merozoitom Plasmodium falciparum 3D7. Przykładem tego jest preparat FMP-1/AS02A, oparty na rekombinacyjnym białku MSP1 (fragment C-terminalny o masie 42 kda) produkowanym w E. coli, opracowany przez The Walter Reed Army Institute of Research we współpracy z innymi ośrodkami naukowymi, stanowi potencjalną szczepionkę, która przeszła szereg testów klinicznych (Angov E., Mol. Biochem. Parasitol., 128, 2003r). Opracowano także antygenowy preparat oparty na C-terminalnym fragmencie białka MSP1 o masie molekularnej 19

3 kda przez the University of Hawaii (Chang S.P., Infect. Immun. 64, 1996r) and the Institut Pasteur (Garraud O., Scand. J. Immunol., 49, 1999r). Spośród innych antygenów charakterystycznych dla stadium erytrocytarnego znane jest białko AMP1 (Apical Membrane Protein 1), które wywołuje protekcyjny wpływ na patogeny malarii (Hodder A.N., Infect. Immun. 69, 2001r). I tak, Walter Reed Army Institute of Research wraz z USAID i GSKBio opracował potencjalną szczepionkę FMP2.1, opartą na rekombinacyjnym białku AMP1 produkowanym w układzie E. coli. Inne podejście to opracowany antygen PfCP-2.9, stanowiący fuzję białek AMP1 i MSP1 19 kda opracowany przez The Second Military Medical University in Shanghai wraz z the World Health Organization. Trzecia forma zarodźca w organizmie człowieka to tzw. stadium płciowe. Badania wykazały, że w tym stadium rozwoju patogenu, również są produkowane specyficzne antygeny, a przeciwciała skierowane przeciwko tym antygenom blokują rozwój płciowy zarodźca. Spośród antygenów charakterystycznych dla stadium płciowego, znane jest białko Pfs25, które może stać się składnikiem szczepionki hamującej transmisje malarii za pośrednictwem komara na człowieka. Prace nad nim rowadzone są przez Malaria Vaccine Development Unit z National Institutes of Health USA (Ballou W. R., Am. J. Trop. Med. Hyg., 71(Suppl2), 2004r.). Inne badania (Chatterjee S., Mol. Biochem. Parasitol., 107, 2000r.), wskazują na immunogenne właściwości pojedynczego rybosomalnego białka P0, które indukuje wytwarzanie ochronnych przeciwciał na infekcję zarodźcem malarii. Świadczy o tym hamowanie zasiedlania mysich erytrocytów przez merozoity zarodźca, którym podano poliklonalne przeciwciała skierowane przeciwko białku P0 (Goswami, A., J. Biol. Chem., 272, 1997r). Na uwagę zasługuje fakt, iż rybosomalne białka P, a w szczególności białko P0, zostały znalezione na powierzchni erytrocytarnych form pasożyta - merozoitach oraz na powierzchni komórek płciowych - gametocytach. Białka te w przeciwieństwie do wielu innych białek powierzchniowych zarodźca, których obecność związana jest tylko z jedną formą rozwojową, mogą występować we wszystkich formach rozwojowych pasożyta. Tak więc, rybosomalne białka P są logicznym kandydatem (antygenem) do przygotowania szczepionki przeciw malarii, choć ich skuteczność w działaniu ochronnym nie została ustalona. Brak jest bowiem danych dotyczących reakcji układu immunologicznego w szczególności na białka z grupy P1 i P2, co niewątpliwie wynika z ich właściwości fizykochemicznych (niewielka masa molekularna - ok. 10 kda i kwaśny charakter, pi ok. 4) oraz trudności w ich

4 preparatyce gdyż indywidualne rekombinacyjne białka w większości są nierozpuszczalne. Celem rozprawy jest uzyskanie antygenu patogenu malarii o optymalnych właściwościach immunostymulacyjnych i jednocześnie immunoprotekcyjnych. Cel ten osiągnięto przeprowadzając badania oparte na kompleksie rybosomalnych białek P, pochodzącym z zarodźca Plasmodium falciparum. Istotą, uzyskanego w ramach realizacji pracy, wynalazku jest antygen patogenu malarii schematycznie przedstawiony na rysunku 1, w postaci pentamerycznego kompleksu białek P, który zawiera fragment polipeptydu z rybosomalnego białka P0, obejmujący reszty aminokwasowe od 197 do 316, oraz dwa pełne rybosomalne białka P1 i P2, korzystnie występujące w układzie heterodimerycznym, co przedstawia Sekwencja 1, i opisywany jako P0 ( ) -(P1-P2) 2. Rysunek 1 Schemat obrazujący pentametryczny kompleks białek P, P0 ( ) -(P1-P2) 2. Otrzymany antygen, występuje w rozpuszczalnej i stabilnej formie, wykazując zarazem silne właściwości immunostymulujące. Właściwości powyższe wykazano na podstawie badań biochemicznych i immunologicznych opisanych poniżej w przykładach 2 i 3. Warta podkreślenia jest wysoce innowacyjna metoda otrzymywania antygenu obejmująca metodę nadekspresji białek z użyciem wektora bakteryjnego charakteryzującego się tym, że w wektorze używa się kasety genetycznej, zawierającej policistronowy układ trzech genów kodujących sekwencje aminokwasowe składników kompleksu białek P zdefiniowanego powyżej. Każdy gen w obrębie policistronowej kasety ekspresyjnej zawiera osobne sekwencje regulatorowe RBS, i sekwencje łącznikowe, a gen dla fragmentu białka P0 występuje w fuzji z genem dla białka GST.

5 Kaseta ekspresyjna została przedstawiona schematycznie nas rysunku 2. Rysunek 2. Kaseta zawiera gen dla białka GST w fuzji z genem dla fragmentu białka P0 ( ) oraz geny dla białek P1 i P2; RBS - sekwencja regulatorowa odpowiedzialna za wydajną inicjację translacji; 5 i 3 orientacja DNA. Część eksperymentalna pracy przedstawiono w poniższych przykładach. Przykład 1. Konstrukcja kasety ekspresyjnej Do otrzymania kasety ekspresyjnej wykorzystano sekwencje nukleotydowe zdeponowane w bazie danych genomu Plasmodium falciparum 3D7, www: Geny dla białek: P0 (PF11_0313), P1 (PF11_0043) i P2 (PFC0400w) zostały zsyntetyzowane w firmie GenScript, a następnie poddane amplifikacji metodą PCR i wklonowane do bakteryjnego wektora pgex4t-1. Pierwszym genem wprowadzonym do wektora pgex4t-1 był gen dla fragmentu białka P0 (obejmujący kodony dla aminokwasów ). Wykorzystano tu unikalne dla wektora pgex4t-1 miejsca restrykcyjne BamHI i EcoRI. Fragment genu dla białka P wklonowano zgodnie z ramką odczytu z genem reporterowym GST. Następnie wprowadzono kolejno geny dla rybosomalnych białek P1 i P2 wykorzystując kolejne unikalne pary miejsc restrykcyjnych dla enzymów EcoRI/SalI i SalI/NotI. Wymienione wyżej manipulacje genetyczne przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami. Sekwencje regulatorowe RBS i sekwencje łącznikowe oddzielających poszczególne geny zostały wprowadzone w procesie klonowania w starterach nukleotydowych użytych do amplifikacji DNA metodą PCR.

6 Przykład 2. Otrzymanie pentamerycznego kompleksu białek P Plasmodium falciparum 2.1 Otrzymanie kompleksu białek P. Ekspresję kompleksu białek P według wynalazku, przeprowadzono w heterologicznym układzie bakteryjnym Escherichia coli. Ekspresję prowadzono w kolbach hodowlanych zawierających pożywki LB (o składzie: 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% pepton, 1% NaCl) w temperaturze 37 o C. Pożywkę suplemetowano dodatkiem antybiotyku, ampicyliny o stężeniu 100 µg/ml. Każda kolba z pożywką szczepiona była całonocną hodowlą komórek E. coli szczepu BL21(DE3) zawierających wektor niosący kasetę ekspresyjną według wynalazku zdefiniowaną powyżej. Hodowlę prowadzono w temp. 37 o C z intensywnym napowietrzaniem kontrolując gęstość optyczną hodowli przy długości fali 600 nm (OD 600 ). Po godzinie hodowli od zaszczepienia pożywki, dodano ponownie ampicylinę w ilości 100 µg/ml. Gdy hodowla osiągnęła gęstość optyczną OD 600 =0.8, dodano induktora ekspresji, Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) do końcowego stężenia 0.5 mm. Hodowlę prowadzono przez kolejne cztery godziny. Po tym czasie, komórki odwirowywano (10 min, 3000 rpm na wirówce preparatywnej J-23 firmy Beckman), płukano zimnym buforem PBS i ponownie odwirowywano j.w. Dezintegrację komórek prowadzono poprzez sonifikację w cyklach 45 sek. z 60 sek. przerwami, wykorzystując sonifikator firmy MSE z trzpieniem tytanowym o grubości 2 cm. Dezintegrację prowadzono przez 20 cykli. W czasie dezintegracji monitorowano temperaturę (+4 o C) i utrzymywano ph 7,4. Otrzymany dezintegrat komórek bakteryjnych był poddawany frakcjonowaniu na drodze wirowania: 20 min, rpm w temp 4 o C. Po wirowaniu, otrzymano rozpuszczalną frakcję białek cytoplazmatycznych wraz z frakcją białek rybosomalnych. Frakcję tę traktowano detergentem Triton X-100, do jego końcowego stężenia 1% i mieszano na mieszadle magnetycznym przez 60 min w temperaturze 4 o C. Następnie, całość mieszaniny poddano ultrawirowaniu przez 90 minut przy rpm stosując rotor TY50.2 Ti firmy Beckman w celu osadzenia rybosomów. Uzyskany w ten sposób supernatant nazywany frakcją S-100, zawierał frakcję rozpuszczalnych białek cytoplazmatycznych zawierającą m. in. pentameryczny kompleks białek P. W celu izolacji i oczyszczania białek P, frakcję S-100 zmieszano ze złożem GST-trap, i poddano chromatografii powinowactwa. Wiązanie pentametrycznego kompleksu do nośnika prowadzono przez 60 min w temperaturze 4 o C. Po tym czasie, białka frakcji S-100 nie wiążące się do złoża zostały odseparowane na drodze wirowania (10 min, 3000 rpm na wirówce

7 preparatywnej J-23 firmy Beckman). Odwirowane złoże poddano najpierw płukaniu buforem PBS w objętości 10-krotnie większej od jego objętości a następnie, przeprowadzono drugie płukanie złoża taką samą objętością buforu PBST (bufor PBS z dodatkiem detergentu Tween 20 w stężeniu 0,1%). Trzecie płukanie przeprowadzono ponownie samym buforem PBS o objętości dwukrotnie większej od objętości złoża, co miało na celu usunięcia resztek białek frakcji S-100, które niespecyficznie mogły związać się do złoża GST-trap. W celu uwolnienia pentamerycznego kompleksu białek P złoże GST-trap inkubowano przez 60 minut w temperaturze 37 o C z roztworem trombiny ludzkiej (22 jednostki/ml złoża). Po tym czasie, do zebranego supernatantu zawierającego kompleks białek P zdefiniowany zgodnie z wynalazkiem, dodawano inhibitora trombiny - fluorku fenylometylosulfonowego (phenylmethanesulphonylfluoride, PMSF) do końcowego stężenia 1 mm. Opisana procedura pozwoliła na otrzymanie homogennego pentametrycznego kompleksu białekp. 2.2 Analiza oczyszczania kompleksu białek P. Analizę etapów oczyszczanie kompleksu białek P z wykorzystaniem standardowej metody SDS-PAGE obrazuje rysunek 3. Do analizy przygotowano próbki zawierające kolejno: 30μg białka ekstraktu komórkowego bakterii E. coli transformowanych wektorem zawierającym kasetę ekspresyjną przed i po indukcji (-IPTG; +IPTG); 30μg białka tzw. ciałek inkluzyjnych będących frakcją białek nierozpuszczalnych; 30μg białka frakcji S-100, która zawiera białka rozpuszczalne; 5μg białka kompleksu białek P, w którym etykieta GST pozostaje związana z białkiem P0; 5μg białka oczyszczonego preparatu kompleksu białek P po odcięciu białka GST.

8 Rysunek 3. Analiza SDS-PAGE etapów oczyszczania kompleksu białek P. Markery - białka markerowe o znanych masach molekularnych; ekstrakt komórkowy -IPTG, brak indukcji ekspresji; ekstrakt komórkowy +IPTG, indukcja ekspresji kompleksu białek P; ciałka inkluzyjne, frakcja białek nierozpuszczalnych; frakcja S-100, frakcja białek rozpuszczalnych; GST-P0 ( ) -(P1-P2) 2, frakcja zawierająca kompleks białek P w fuzji z białkiem GST; P0 ( ) -(P1-P2) 2, oczyszczony kompleks białek P pozbawiony białka GST. Przykład 3. Badanie właściwości kompleksu białek P, P0 ( ) -(P1-P2) 2. Preparat otrzymany według przykładu 1 poddano następującym analizom biochemicznym. 3.1 Analiza na sicie molekularnym. Otrzymany kompleks białek P poddano analitycznemu sączeniu molekularnemu na sicie molekularnym Superose 12 HR 10/30, zrównoważonym buforem o składzie 20 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm NaCl, wykorzystując system Akta Purifier FPLC, rysunek 4.

9 Rysunek 4. Analiza z wykorzystaniem sita molekularnego. Pojedynczy pik odpowiada oczyszczonemu pentametrycznemu kompleksowi białek: P0 ( ) -(P1-P2) 2. Kompleks białek P wypływa jako symetryczny jeden pik, wskazując tym samym że kompleks ten występuje w jednorodnej formie. 3.2 Spektrometria mas. W celu określenia dokładnej stechiometrii kompleksu białek P otrzymanego według przykładu 1.1 przeprowadzono analizę spektrometrii masowej w warunkach niedenaturujących z wykorzystaniem aparatu Q-TOF2. Wyniki analizy pokazuje rysunek 5. Rysunek 5.

10 Analiza kompleksu białek P z wykorzystaniem spektrometrii mas w warunkach niedenaturujących. Oszacowana eksperymentalnie masa molekularna kompleksu wynosi Da, co odpowiada wyliczonej teoretycznej masie Da kompleksu białek P według wynalazku. Analiza wykazała, że kompleks białek P zawiera pięć polipeptydów, z których jeden to fragment białka P0 ( ) (13196 Da) oraz dwa dimery P1-P2 (13013 i Da). Przykład 4: Analiza immunologiczna pentametrycznego kompleksu białek P P0 ( ) - (P1-P2) Immunizacja zwierząt laboratoryjnych. Do oceny immunostymulujacych właściwości pentametrycznego kompleksu białek P wykorzystano 6-7 tygodniowe myszy płci żeńskiej o wadze 18 g ± 2, zakupionych w Instytucie Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej w Warszawie. W każdej grupie badanej i kontrolnej znajdowało się 18 zwierząt. Badany kompleks łączono z kompletnym (I immunizacja) lub niekompletnym (II i III immunizacja) adiuwantem Freunda w stosunku objętościowym 1:1. Myszom podawano domięśniowo (mięsień udowy) 100 µl jałowej zawiesiny zawierającej 50 µg białka w dniu: 0, 21 i 42 (co trzy tygodnie). Próby krwi do analiz bieżących pobierano po upływie 2 tygodni od każdego szczepienia, tj. w 14, 35 i 56 dniu (grupy badane oraz kontrolne). Grupą kontrolną były zwierzęta, którym podawano jedynie kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda (grupa I) lub PBS (grupa II). Materiał do analiz pobierany był także od mysz nie szczepionych, po tygodniu od momentu dostawy (okres adaptacji). Do badań przeznaczano surowicę (określenie klasy produkowanych przeciwciał) oraz limfocyty izolowane z krwi i śledziony (badanie toksyczności białek, proliferacji komórek, oznaczanie powierzchniowych receptorów komórek). Jako punkt odniesienia w analizie immunologicznej wykorzystano znany antygen patogena - białko MSP-1 P. faciparum. Do analizy kontrolnej użyte zostało białko MSP (96 aminokwasów, pozycja aminokwasów w pełnym białku ; SWISS- PROT, MSP1 PLAFW, accession number P04933). Białko to zostało wyklonowane i poddane heterologicznej ekspresji w szczepie E. coli a następnie oczyszczeniu do stanu homogenności. Tak przygotowany antygen referencyjny wykorzystano do analiz immunologicznych.

11 4.2 Badanie toksyczności białek P. Limfocyty śledziony myszy inkubowano godz. z badanym kompleksem białek P, w zakresie jego stężeń µg/ml. Po wyznaczonym czasie (24h i 48h) żywotność komórek oznaczano metodą redukcji MTT. Wyniki badań uwidoczniono na rysunku 6, przedstawiając zależność procentu przeżywalności komórek od stężenia badanego białka. Rysunek 6 Żywotność limfocytów śledziony myszy inkubowanych przez 24 i 48 godzin w obecności różnych stężeń kompleksu białek P i białka MSP1. *różnice statystycznie istotne (p 0,05) w porównaniu z 24-godzinnym czasem inkubacji. Badany kompleks białek nie wykazywał toksycznego wpływu na limfocyty w zakresie stężeń µg/ml. W przypadku białka MSP-1, zachowanie było podobne, ale wydłużenie czasu inkubacji do 48h z tym antygenem powodowało obniżenie żywotności komórek o blisko 35%. 4.3 Badanie proliferacji limfocytów ze śledziony mysz kontrolnych i immunizowanych (po III immunizacji) w obecności kompleksu białek P i MSP-1.

12 Badanie proliferacji limfocytów prowadzone było według standardowych procedur, a wyniki uzyskane przy zastosowaniu dwóch metod MTT i testu ELISA BrdU były porównywalne. Wyniki badań przedstawia rysunek 7. *różnice statystycznie istotne w porównaniu do kontroli (limfocyty myszy nieimmunizowanych) stanowiącej 100% + różnice statystycznie istotne w porównaniu do niższego stężenia białka # różnice statystycznie istotne w porównaniu do tego samego stężenia białka użytego w odpowiedniej kontroli (limfocyty myszy, którym podawano adiuwanty, PBS lub nieimmunizowanych) Rysunek 7. Zależność proliferacji limfocytów izolowanych ze śledziony mysz kontrolnych i immunizowanych białkami: kompleks P i MSP-1 z P. faciparum. K1 proliferacja limfocytów izolowanych z mysz, którym podawano tylko adiuwant Freunda; P0 ( ) - (P1-P2) 2 proliferacja limfocytów mysz immunizowanych kompleksem białek P; MSP-1, proliferacja limfocytów immunizowanych białkiem MSP-1. W porównaniu z grupami kontrolnymi, limfocyty wszystkich immunizowanych mysz kompleksem białek P czy białkiem MSP-1 proliferowały intensywniej. Największy wzrost proliferacji limfocytów obserwowano w przypadku inkubacji z referencyjnym białkiem MSP-1 (do 300% w stosunku do grupy kontrolnej), zaś w przypadku kompleksu białek P wzrost proliferacji limfocytów wynosił ok. 250%.

13 4.4 Badanie poziomu surowiczych przeciwciał klasy IgM, IgG, IgG1 i IgG2a. Poziom wytworzonych przeciwciał oznaczano testem ELISA w surowicach krwi zebranych po upływie 2 tygodni od każdej immunizacji. W tym celu płytki opłaszczano zarówno antygenem zdefiniowanym według wynalazku powyżej jak i referencyjnym białkiem MSP-1. Wyniki przedstawiono jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia badanej surowicy, przy którym OD 405nm wynosiło 0,1. Wszystkie badane białka pobudzały odpowiedź humoralną, której poziom istotnie statystycznie wzrastał po kolejnych immunizacjach Porównanie miana przeciwciał klasy IgM i IgG2a powstających w odpowiedzi na immunizacje myszy preparatem białkowym kompleksu białek P i MSP-1 Przeciwciała klasy IgM najsilniej indukowane były przez wzorcowe białko MSP-1, zwłaszcza po I immunizacji, po czym obserwowano spadek miana. W przeciwieństwie do białka MSP-1, kompleks białek P indukował wytwarzanie immunoglobulin klasy IgM na niskim poziomie, który nie zmieniał się lub nieco obniżał po kolejnych immunizacjach, jak pokazuje rysunek 8. + różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji I ++ różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji II Rysunek 8 Poziom przeciwciał IgM i IgG2a w surowicy mysz immunizowanych kompleksem białek P i białkiem MSP-1. Wyniki przedstawiono jako odwrotność najwyższego

14 rozcieńczenia badanej surowicy, przy którym OD 405nm wynosiło 0,1. Cyfry rzymskie I, II i III oznaczają poszczególne immunizacje. Porównanie danych zamieszzczonych na rysunku 8 pozwala na stwierdzenie, że badane białka pobudzały odpowiedź humoralną, której poziom istotnie wzrastał po kolejnych immunizacjach (z wyjątkiem IgM). Indukcja przeciwciał klasy IgM z największą wydajnością odbywała się w obecności wzorcowego białka MSP-1, zwłaszcza po I immunizacji, po czym obserwowano spadek miana przeciwciał. W przeciwieństwie do białka MSP-1, kompleks białek P indukował wytwarzanie immunoglobulin klasy IgM na niskim poziomie, który nie zmieniał się lub nieco obniżał po kolejnych immunizacjach. Wzrost miana przeciwciał klasy IgG2a była najbardziej zauważalna po II immunizacji. Białko MSP-1 i kompleks białek P działały podobnie (obecność IgG2a wykrywano w rozcieńczeniu surowicy odpowiednio 1:4800 i 1:10000). Po III immunizacji poziom IgG2a był bardziej wyrównany zarówno dla kompleksu białek P jak i MSP-1 mieszcząc się w granicach rozcieńczeń 1: : Porównanie miana przeciwciał klasy IgG oraz podklasy IgG1 powstających w odpowiedzi na immunizację mysz preparatem białkowym kompleksu białek P lub białka MSP-1. Przeciwciała IgG są najważniejszymi immunoglobulinami odpowiedzi wtórnej, cechującymi się wysokim powinowactwem do antygenu, zdolnością do jego opsonizacji (uruchamianie mechanizmów bójczych), aktywacji dopełniacza i przenikaniem przez łożysko. Obecność IgG wykrywa się dopiero po upływie pewnego czasu od momentu kontaktu z antygenem, stąd w naszych badaniach obserwowano bardzo niskie miana tych przeciwciał po pierwszej immunizacji, zaś ich miano radykalnie wzrastało po drugiej i trzeciej immunizacji, jak pokazuje rysunek 9.

15 + różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji I ++ różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji II Rysunek 9. Poziom przeciwciał IgG i IgG1 w surowicy myszy immunizowanych kompleksem białek P i białkiem MSP-1. Wyniki przedstawiono jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia badanej surowicy, przy którym OD 405nm wynosiło 0,1. Cyfry rzymskie I, II i III oznaczają poszczególne immunizacje. Najlepszym induktorem syntezy przeciwciał okazało się białko MSP-1 i kompleks białek P (obecność IgG wykrywano w rozcieńczeniu surowicy, odpowiednio - 1: i 1:100000). Po trzeciej immunizacji poziom IgG był bardziej wyrównany dla kompleksu białek P i MSP-1 i mieścił się w granicach rozcieńczeń 1: : W podklasie przeciwciał IgG1, najsilniejszymi induktorami syntezy IgG1 po drugiej immunizacji okazało się białko MSP-1 (rozcieńczenie surowicy 1:104000) oraz kompleks białek P (1:78000). Po trzeciej immunizacji poziom IgG1 wzrósł jeszcze i był bardziej wyrównany dla obu badanych antygenów Porównanie ilości limfocytów cytotoksycznych (Tc) i regulatorowych (Treg) powstających w odpowiedzi na immunizacje mysz preparatem białkowym kompleksu białek P i MSP-1.

16 Limfocyty Tc są najważniejszymi komórkami odpowiedzi immunologicznej w stadium preerytrocytarnym Plasmodium falciparum, które niszczą zakażone pierwotniakiem hepatocyty. Limfocyty Treg hamują odpowiedź zapalną, ale ich pojawienie się jest korzystne dla gospodarza w późniejszym etapie infekcji, co zapobiega dalszym patologicznym powikłaniom. Jeśli supresyjna aktywność tych komórek ujawni się zbyt wcześnie to pozwoli na niekontrolowany wzrost liczby pasożytów, a w efekcie zwiększy prawdopodobieństwo wystąpienia ciężkiej postaci malarii. Liczebność (przedstawioną w %) populacji limfocytów krwi Tc i Treg określano po upływie 2 tygodni od każdej immunizacji, oznaczając charakterystyczne dla tych komórek markery powierzchniowe (odpowiednio CD4-CD8+ oraz CD4+CD25+) metodą cytometrii przepływowej. Wyniki tych badań przedstawia poniższa Tabela. Tabela 1. immunizacja K1 P (P1-P2) 2 MSP-1 % Tc % Treg % Tc % Treg % Tc % Treg I 6,33±0,5 24,4±0,9 6,97±0,4 21,2±2,3 7,03±0,9 23,0±2,6 II 6,79±1,2 24,0±2,8 10,9±0, ,1±02 12,3±1,2 + 23,4±1,1 III 8,19±0,5 23,4±0,5 5,9±1,3 35,7±3,3 ++ 6,56±0,7 33,8±6, różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji I ++ różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji II Porównanie danych przedstawionych w Tabeli 1 pozwala na stwierdzenie, że badane białka w porównywalnym stopniu indukowały powstawanie populacji limfocytów Tc (zauważalne zwłaszcza po II immunizacji) oraz limfocytów Treg (po III immunizacji). Na podkreślenie zasługuje, korzystne dla rozwoju odporności, późne pojawienie się limfocytów Treg. Podsumowując, na podstawie przeprowadzonych badań immunologicznych można wysnuć wniosek, iż rekombinacyjny kompleks białek P P (P1-P2) 2 dobrze indukuje odpowiedź immunologiczną. Ponadto przebieg i wygaszanie reakcji zapalnych jest w pełni porównywalny z wzorcowym białkiem MSP-1. Daje to więc racjonalne podstawy by sądzić, że kompleks białek P P (P1-P2) 2 może być składnikiem szczepionki przeciw malarii.

17