Retikulocyty i ich znaczenie Wszystkie komórki krwi pochodzą z komórek macierzystych. W czasie proliferacji różnicują się do komórek trzech linii komórkowych krwi (erytropoeza, granulopoeza i trombopoeza). Żywotność krążących krwinek czerwonych wynosi około 120 dni. W czasie jednej doby prawie 1% ogólnej liczby czerwonych krwinek jest traconych i uzupełnianych przez nowe komórki. Każdej sekundy produkowanych jest około dwóch milionów krwinek czerwonych. Erytroblasty ortochromatyczne pozbywają się jądra komórkowego i tworzą retikulocyty, które są następnie wprowadzane do krwioobiegu. Poprzez usunięcie retikulum endoplazmatycznego, retikulocyt rozwija się w dojrzałą krwinkę czerwoną w ciągu 4 dni. Z reguły retikulocyty pozostają w szpiku kostnym przez 3 dni, a 1 dzień są obecne w krwi obwodowej. Nazwa "retikulocyt pochodzi od struktury podobnej do siateczki, która staje się widoczna po barwieniu przyżyciowym, barwnikami takimi jak błękit brylantowo-krezolowy lub błękit metylenowy (strącanie fragmentów kwasu rybonukleinowego). Historia 1865: Erb odkrył siateczkę wewnątrzkomórkową z użyciem kwasu pikrynowego, pierwszy opis retikulocytów. 1881: Ehrlich wykorzystując barwienie przyżyciowe, pokazał wewnątrzkomórkową sieć, substantia reticulofilamentosa 1891: Smith zidentyfikował retikulocyty jako niedojrzałe krwinki czerwone. 1932: Heilmeyer klasyfikuje etapy dojrzewania (patrz Tab.1). 1950: Seip wyznacza zakresy referencyjne etapów dojrzewania (patrz Tab.1). 1960: Zliczanie retikulocytów za pomocą metod opartych na, Kosenov i Mai. 1983: Tanke automatyzuje pomiar retikulocytów za pomocą i cytometrii przepływowej. Stadium dojrzewania zgodne z Opis morfologiczny Kwantyfikacja według Seipa klasyfikacją Heilmeyera Stadium 0 Jądro Stadium I Zwarte retikulum 0,1 Stadium II Luźne retikulum 7,0 Stadium III Rozproszone retikulum 32,0 Stadium IV Niewiele rozproszonych ziarnistości 61,0 Tabela 1. Stadia dojrzewania retikulocytów Etapy dojrzewania I i IV są często błędnie interpretowane: etap I jest czasem opisywany jako erytroblast, a stadium IV jako dojrzała krwinka czerwona, ponieważ niska zawartość RNA nie jest wykrywana. Prawidłowa interpretacja stadium IV jest szczególnie ważna, ponieważ ten etap dojrzewania dominuje we krwi obwodowej. Na podstawie częstych błędnych interpretacji stadium IV, Gilmer i Koepke zdefiniowali retikulocyty w 1976 roku: "Retikulocyt jest krwinką czerwoną niezawierającą jadra, która posiada co najmniej dwie lub więcej "kropek" z niebiesko zabarwionym, zasadochłonnym materiałem polyribosomalnym w cytoplazmie (barwienie nowym błękitem metylenowym). Te kropki powinny znajdować się w wyraźnej odległości od ściany komórkowej, aby nie pomylić ich z ciałkami Heinza. Komórki z jasną, niebieską ziarnistością cytoplazmatyczną, widoczną bez dokładnego ogniskowania, należy traktować jako retikulocyty w IV stadium dojrzewania". W 1985 roku National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) w USA i Międzynarodowa Rada Normalizacyjna w Hematologii (International Council for Standardization in Haematology, ICSH) zdefiniowali komórki z pojedynczą kropką jako dojrzałe krwinki czerwone (nie retikulocyty) i zarekomendowali to jako standard oceny mikroskopowej (ręcznego) liczenia i klasyfikacji. Retikulocyty odzwierciedlają regenerację erytropoezy. W zrównoważonym układzie ponad 90% retikulocytów w końcowych stadiach dojrzałości (III i IV) znajduje się we krwi obwodowej. Jeśli erytropoeza jest pobudzana, tym wcześniej retikulocyty o niższym stadium dojrzewania przechodzą do krwi obwodowej = "shift" (przesunięcie), podobnie do "przesunięcie w lewo" w granulopoezie. Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 1
Wskazania do liczenia retikulocytów podstawowa diagnostyka we wszystkich rodzajach niedokrwistości terapia monitorowana suplementacji żelaza, witaminy B12 i kwasu foliowego terapia monitorowana w czasie podawania erytropoetyny Monitorowanie podczas transplantacji komórek macierzystych Materiał próbki Krew pobrana na EDTA Fig. 1 Rozmaz krwi obwodowej. Polichromazja i Stabilność In vitro liczby retikulocytów wczesne stadia krwinek czerwonych w bardzo ciężkiej Ustalenie liczby retikulocytów z krwi pobranej na hemolizie autoimmunologicznej i AITP EDTA jest wiarygodne do 72 godzin po pobieraniu próbek krwi. Temperatura przechowywania + 4 C lub + 20 C, nie ma znaczącego wpływu na wynik pomiaru [1]. Zliczanie manualne Wymagane materiały: barwienie przyżyciowe, szkiełko mikroskopowe, mikroskop 1. Krew wymieszać z równymi objętościami barwników przyżyciowych, takich jak błękit brylantowo-krezylowy. 2. Po inkubacji próbkę należy rozmazać na szkiełku mikroskopowym i wysuszyć na powietrzu. 3. Retykulocyty są liczone pod mikroskopem przy 1000-krotnym powiększeniu (obiektyw imersyjny). 4. Zliczane jest 1000 krwinek czerwonych. Przy 1000-krotnym powiększeniu odpowiada to około pięciu polom widzenia, każde składa się z około 200 komórek. 5. Liczba retikulocytów jest podawana w promilach [ ] lub w procentach [%]. Cytowany w literaturze poziom błędu dla ręcznego liczenia wynosi między 20-40% CV lub wyżej, w zależności od liczby retikulocytów. Liczenie 1000 komórek jest zalecane rutynowo. Zgodnie z zaleceniem ICSH (1990) w sprawie stopnia zliczania retikulocytów w zakresie referencyjnym, należy zliczyć co najmniej 4000 komórek, aby uniknąć przekroczenia błędu statystycznego w wysokości 5% (Tab. 2). Fig. 2 Retikulocyty (barwienie przyżyciowe) Wartość retikulocytów we krwi (%) Liczba komórek, które należy zliczyć aby uzyskać CV=5% 1-2 (zakres referencyjny) 4 000 3-5 1 000 6 10 600 20 25 150 30 40 100 Tabela 2. Zliczanie automatyczne W celu pomiaru retikulocytów, próbki inkubuje się z barwnikiem fluorescencyjnym, który wiąże się z RNA. Retikulocyty zliczane są za pomocą cytometrii przepływowej. Zautomatyzowane zliczanie retikulocytów pozwala na obiektywną klasyfikację komórek i zapewnia wysoki poziom powtarzalności wyników. Automatycznie zliczanych jest od 10000 do 30000 krwinek czerwonych. Daje to zarówno wysoki poziom zliczania jak i wysoki stopień precyzji, a wyniki są dostępne w mniej niż jedną minutę. Określenie liczby retikulocytów i ich klasyfikacja (indeks dojrzałości: LFR, MFR, HFR) daje informacje na temat poziomu aktywności erytropoezy. Zazwyczaj podaje się wartość retikulocytów w procentach lub promilach w odniesieniu do czerwonych ciałek krwi. Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 2
Interpretacja liczby retikulocytów jest problematyczna w ciężkich niedokrwistościach. Umiarkowany wzrost względnej liczby retikulocytów w ciężkich niedokrwistościach nie wskazuje na wystarczająco silną regenerację erytropoezy, lecz jedynie na skróconą żywotność czerwonych krwinek. Korzystne jest, aby podawać bezwzględne stężenie retikulocytów retikulocytów/µl, co zapewnia bezpośredni pomiar wydajności erytropoezy. Na przykład, wartość 20 retikulocytów jest uważana za wzrost. Jednakże w ciężkiej niedokrwistości z 2 milionów czerwonych krwinek, 20 retikulocytów stanowi jedynie 40,000 retikulocytów/µl, czyli wartość w najniższym przedziale odniesienia. Względna wartość (, %) Żywotność krwinek czerwonych Stężenie komórek (retikulocytów/µl) Wydajność erytropoezy Przeliczenie wartości względnej (%) na stężenie komórek (RET/µl): Fig. 3 Skatergram z kanału RET, Sysmex klasa X RBC = dojrzałe krwinki czerwone RET = retikulocyty PLT-O = płytki optyczne % 10 /μ 100 =ęż ó 10 /μ Zakresy referencyjne Wartości względne Wartości bezwzględne Kobiety 0,54 2,02 % 0,025 0,102 x 10 6 /µl Mężczyźni 0,48 1,64 % 0,026 0,078 x 10 6 /µl Zliczanie retikulocytów z wykorzystaniem fluorescencyjnej cytometrii przepływowej (Sysmex) jest złotym standardem w zliczaniu retikulocytów. Index retikulocytów (RI) Wartość względna (%, ) retikulocytów może wzrosnąć, jeśli faktycznie zwiększona jest liczba retikulocytów lub zmniejszona jest liczba krwinek czerwonych. Korekcja może być wykonana z wykorzystaniem hematokrytu pacjenta przez odniesienie do prawidłowego hematokrytu 0,45 [l/l]. Ten typ korekcji jest zalecany w przypadku niedokrwistości:!"# % $ %&# '/' ()*+,-./) RI = 1,34 5 5 Indeks produkcji retikulocytów (RPI) RPI jest indeksem, który pozwala na ocenę skuteczności erytropoezy, a tym samym wydajności szpiku kostnego. Fizjologiczne dojrzewanie retikulocytów jest podzielone na 3-dniowe dojrzewanie w szpiku kostnym i 1-dniowe we krwi obwodowej. W przypadku widocznej produkcji krwinek czerwonych, retikulocyty wcześniej przechodzą do krwi obwodowej (= 'shift'). Prowadzi to do wyraźnego wzrostu retikulocytów w obiegu, ale nie świadczy o wydajniejszej erytropoezie. Czas dojrzewania retikulocytów w szpiku kostnym jest proporcjonalny do hematokrytu im niższy hematokryt tym krótszy czas przebywania retikulocytów w szpiku, a dłuższy we krwi. Aby wykazać skuteczność szpiku kostnego, ilość retikulocytów jest korygowana przez współczynnik zależny od hematokrytu (RPI). Hematokryt Czas przebywania retikulocytów we krwi 45% 1 dzień 35% 1,5 dnia 25% 2 dni 15% 2,5 dnia Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 3
789 % RPI = :;<= >?@A;BC<DE< ABFEGH5?IJFóC CB GACE K:9 5 5 1,34 Przykład: hematokryt pacjenta HCT=0,25 l/l, retikulocyty = 20% 20 % RPI = 0,25 2 0,45 =5,5 Ocena RPI [2] Norma 1 Anemia z odpowiednią >3 regeneracją Anemia z niewystarczającą < 2 regereracją 0,45 standardowy HCT Frakcja niedojrzałych retikulocytów (IRF) Wartość IRF jest wczesnym markerem oceny regeneracji erytropoezy. Liczba retikulocytów zwiększa się po dwóch do trzech dniach, podczas gdy wartość IRF wzrasta po zaledwie kilku godzinach. Jeśli wartość IRF nie zwiększa się podczas leczenia niedokrwistości niedoborowych (erytropoetyną lub witaminami) wskazuje to na brak reakcji na leczenie. Ponadto, wskaźnik dojrzewania retikulocytów pomaga sklasyfikować anemie hipo-, normo- i hiper-regneratywne. Wartość IRF i liczba retikulocytów sprawdziły się w monitorowaniu przeszczepu szpiku kostnego i komórek macierzystych. W udanych przeszczepach, w 80% przypadków, wartość IRF osiągnie 5% wcześniej niż granulocyty ich klasyczny próg 0,5 x 10 9 granulocytów/l [3]. Oprócz konwencjonalnego pomiaru retikulocytów, fluorescencyjna cytometria przepływowa pozwala na klasyfikację retikulocytów na trzy etapy dojrzewania. Te etapy dojrzewania są zdefiniowane poprzez zawartość RNA retikulocytów (intensywności ). LFR MFR HFR Retikulocyty o niskiej Retikulocyty o średniej Retikulocyty o wysokiej Niewiele RNA Więcej RNA Wysoka zawartość RNA Dojrzałe retikulocyty Średnio-dojrzałe retikulocyty Niedojrzałe retikulocyty 86,5 98,5 % 1,5 11,3 % 0 1,4% IFR jest sumą MFR i HFR (IFR = MFR + HFR) i odnosi się do wskaźnika niedojrzałości retikulocytów. Zakres referencyjny IFR: Kobiety: 1,1 15,9 %; Mężczyźni: 1,5 13,7% Stabilność in vitro IFR : 6 godzin Fig. 4 Skatergram z kanału RET, Sysmex klasa X Fig. 5 Przydatność kliniczna IRF; Retikulocyty w chorobach hematologicznych Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 4
RET-He Oprócz ilościowej oceny parametrów morfologii krwi (RBC HGB, retikulocytów, IRF, MCV), RET-He umożliwia ocenę jakościową. RET-He (ekwiwalent hemoglobiny w retikulocytach) pokazuje zawartość HGB w świeżo produkowanych czerwonych krwinkach, a tym samym zapewnia w czasie rzeczywistym informacje na temat podaży żelaza do erytropoezy. Jest to szczególnie przydatne w odróżnianiu dwóch najpopularniejszych niedokrwistości (niedokrwistości z niedoboru żelaza i anemii chorób przewlekłych ). Innymi słowy - pozwala odróżnić rzeczywisty niedobór żelaza od "funkcjonalnego niedoboru żelaza" (zaburzenie mobilizacji żelaza). Określenie RET-He może być przeprowadzone na analizatorze hematologicznym wspólnie z rutynowymi parametrami krwi obwodowej. Główną zaletą w porównaniu do parametrów ferrytyny i transferryny jest to, że na RET-He nie wpływa "reakcja ostrej fazy". Wskazania Klasyfikacja normochromicznych i hypochromicznych niedokrwistości, różnicowanie między niedokrwistości z niedoboru żelaza i "funkcjonalnym" niedoborem żelaza Monitorowanie terapii przewlekłych zakażeń i nowotworów Monitorowanie leczenia erytropoetyną i suplementacji żelaza Zakres referencyjny RET-He: 28 35 pg Źródła [1] Cavill, Kraaijenhagen, Pradella, d Onofrio, Herkner, Rowan, Theodorsen, Tichelli: In vitro stability of the reticulocyte count. Clin Lab Haem 1996 Dec; 18 Suppl.1:9-11 [2] Manual Hämatologie 2008 (R. Fuchs, P. Staib) [3] d Onofrio G. et al: Indicators of haematopoietic recovery after bone marrow transplantation: the role of reticulocyte measurements. Clin Lab Haem 1996; 18(Suppl.1):45-53 [4] d Onofrio G, Kuse R, Foures C, Jou JM, Pradella M, Zini G: Reticulocytes in haematological disorders. Clinical and Laboratory Haematology 1996 Dec; 18 Suppl. 1:29-34. [5] Praktische Hämatologie (Herbert Begemann, Michael Begemann, Thieme) [6] Internet: www.de.wikipedia.org/wiki/homepage Free encyclopaedia [7] Internet: www.fpnotebook.com/hem82.htm Family Practice Medicine Resource [8] Retikulozyten: Reifung Analytik Klinische Bedeutung B. Porstmann, Verlag Wachholz Photos appear courtesy of Dr. Binder, Wuppertal. Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 5