Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu Elektroniczna Aparatura Medyczna

Transkrypt

1 POLITECHNIKA BIAŁOSTOCKA WYDZIAŁ ELEKTRYCZNY Katedra Telekomunikacji i Aparatury Elektronicznej Studia stacjonarne Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu Elektroniczna Aparatura Medyczna Ćwiczenie 4. Konstrukcja i budowa systemów do pomiarów podstawowych wielkości hematologicznych v. 02 Andrzej Holiczer Witold Holiczer Norbert Litwińczuk Grażyna Gilewska Białystok wrzesień

2 A. Wprowadzenie 1. Krew jako zawiesina wielofazowa Krew jest tkanką płynną wypełniającą naczynia krwionośne, przenoszącą rozmaite substancje z jednych narządów do drugich, zapewniając w ten sposób łączność między nimi. Krew może być uważana za środowisko, które zostało zamknięte wewnątrz ciała wyższych form życia i uległo takim zmianom w składzie, ażeby zapewnić pokrycie potrzeb wyżej wyspecjalizowanych komórek różnych rodzajów, składających się na organizm. Ogólnie rzecz biorąc krew składa się z cieczy zwanej osoczem oraz elementów (komórek) tworzących fazy stałe zwanych krwinkami. Krwinki stanowią około 45% objętościowych krwi i dzielą się na czerwone, białe oraz płytkowe. Uwzględniając, że wymiary krwinek mieszczą się w przedziale 1 m (krwinki płytkowe) do 20 m (monocyty), można klasyfikować krew jako zawiesinę wielofazową, w której fazy stałe tworzą krwinki natomiast fazą ciekłą jest układ koloidalny - osocze. Zakres objętości krwinek wynosi 2 fl (krwinki płytkowe) do 4200 fl (monocyty), co daje stosunek ich objętości 1:2100. Szczególny problem w analizie objętościowej stwarza tu porównywalna objętość najmniejszych limfocytów (dolna granica objętości: 65 fl) z objętością największych krwinek czerwonych (górna granica objętości: 110 fl).w stanach patologicznych nakładanie się obu krzywych rozkładu jest jeszcze bardziej znaczące. Na rys. 1, 2, 3 przedstawiono kształty i wielkość krwinek czerwonych, białych oraz płytkowych. Krwinki czerwone i płytkowe tworzą jednorodne pod względem morfologicznym populacje, które można różnicować na podstawie pomiaru ich objętości. Rys. 1. Krwinka czerwona (RBC), biała (WBC) i płytkowa (PLT) Rys. 2. Krwinki czerwone (RBC) Rys. 3. Krwinka biała (monocyt) na tle krwinek czerwonych (RBC) Stosunek koncentracji RBC : PLT : WBC wynosi około 1000 : 100 : 1. Przy odległościach między krwinkami porównywalnych z ich wymiarami trudno jest znaleźć metodę pomiarową charakteryzującą się odpowiednią rozdzielczością. Dlatego też wszystkie znane procedury pomiarowe, jako jeden z ich elementów zawierają rozcieńczanie krwi. Duży stosunek koncentracji krwinek czerwonych do białych przy porównywalnej ich objętości uniemożliwia pomiar koncentracji krwinek białych. W tym przypadku sięgnięto do metod chemicznych, wykorzystując fakt braku odporności błony komórkowej krwinek czerwonych na substancje rozpuszczające związki tłuszczowe (detergenty). Błona komórkowa krwinek czerwonych, w przeciwieństwie do krwinek białych, zawiera w swojej strukturze związki tłuszczowe. Dodany do rozcieńczonej próbki krwi detergent w postaci odczynnika lizującego powoduje selektywne zniszczenie błon krwinek czerwonych powodując tak zwaną hemolizę krwi. Dodatkowym efektem tego procesu jest uwolnienie hemoglobiny z krwinek czerwonych, co umożliwia pomiar jej stężenia jako składnika powstałego w ten sposób jednorodnego roztworu (wpływ krwinek białych jest w większości przypadków pomijalnie mały). 2

3 W klasycznym ujęciu do podstawowych parametrów hematologicznych zaliczamy: koncentrację krwinek czerwonych (RBC), stężenie hemoglobiny (HGB), hematokryt (HCT), koncentrację krwinek białych (WBC). Definicje podstawowych parametrów hematologicznych oraz ich pochodnych (wskaźników czerwonokrwinkowych) podano w tabeli 1. Tabela 1. Parametr Definicja J.m. Wielkość pochodna Koncentracja krwinek czerwonych (RBC) RBC N RBC 1/pl V Stężenie hemoglobiny (HGB) HGB m HGB g/l Średnia masa hemoglobiny w krwinkach czerwonych: V HGB MCH RBC Hematokryt V - Średnie stężenie hemoglobiny w krwinkach czerwonych: RBC HCT V MCHC HGB 100 HCT Średnia objętość krwinek czerwonych: HCT MCV RBC Koncentracja krwinek białych (WBC) WBC N 1/nl WBC V N RBC liczba krwinek czerwonych; V objętość krwi; m HGB masa hemoglobiny; V RBC objętość krwinek czerwonych; N WBC liczba krwinek białych. 2. Zasady pomiarowe Mikroskopowa metoda pomiaru koncentracji krwinek czerwonych. Zasada pomiaru polega na liczeniu krwinek czerwonych w rozcieńczonej roztworem izotonicznym próbce krwi. Zliczania dokonuje się pod mikroskopem w specjalnej komorze pomiarowej (rys. 4), np. Neubauera. Rys. 4. Komorowa metoda pomiaru koncentracji krwinek czerwonych widok krwinek w komorze Neubauera Metoda komorowa pomiaru koncentracji krwinek czerwonych jest obarczona znacznym błędem (10 do 15%). Nie jest obecnie stosowana do pomiaru koncentracji krwinek czerwonych. 3

4 Metoda konduktometryczna impulsowa. Podstawą zasady pomiarowej jest wykorzystanie zjawiska bardzo dużej rezystancji błon komórkowych względem otaczającego je środowiska. Istotę metody przedstawiono na rys. 5. Rys. 5. Konduktometryczna zasada pomiaru parametrów krwinek: a) przetwornik pomiarowy; b) przepływ krwinek przez element pomiarowy i kształt impulsu napięciowego. Krew rozcieńcza się roztworem izotonicznym o przewodności właściwej około 15 ms/cm i umieszcza w naczyńku pomiarowym, w którym zanurza się czujnik pomiarowy z systemem elektrod E0 E1 (Rys. 5a). W czujnik wbudowany jest element pomiarowy (A A, Rys. 5b) z cylindrycznym otworem (zwężką) o wymiarach m, h = m. Z pomocą źródła podciśnieniowego - p wymusza się przepływ zawiesiny krwinek przez element pomiarowy. Przy zasilaniu systemu elektrodowego ze źródła prądowego I, na wyjściu przetwornika powstają impulsy napięciowe U, spowodowane zmianą rezystancji w obszarze zwężki. Stosunek składowej przemiennej napięcia do stałej wynosi i jest zależny od stosunku objętości krwinki do objętości otworu elementu pomiarowego. W roku 1892 Maxwell wyprowadził zależność wiążącą rezystancję właściwą zawiesiny, składającej się z ośrodka rozpraszającego o rezystancji właściwej 1 oraz fazy rozproszonej w postaci cząstek kulistych o rezystancji właściwej 2. W roku 1924 Fricke uogólnił tę zależność dla przypadku elipsoid obrotowych. Przy założeniu 1 / 2 0, dla krwinki znajdującej się w zwężce uzyskamy: 1 1 a (1) 1 a( f 1) f - współczynnik kształtu i orientacji krwinek względem linii sił pola elektrycznego (f RBC = 1.22; f WBC = 1.50; f PLT = 1.26, a - wskaźnik udziału objętościowego fazy rozproszonej; w rozpatrywanym przypadku stosunek objętości krwinki v do objętości zwężki V z. Przyjmując dalej: v l l a Vz s l R R1 1 R R R1 (2) Vz s s i przy założeniu: v V z (3) otrzymamy: f R R1 v (4) l s Dla układu przedstawionego na rys. 5b: U I R (5) 4

5 Z (2 5) otrzymamy zależność na amplitudę sygnału napięciowego U: I U 1 f v s (6) 2 1 rezystancja właściwa roztworu izotonicznego, I wartość prądu przepływającego przez element pomiarowy, s pole powierzchni elementu pomiarowego, v objętość krwinki przepływającej przez element pomiarowy. Zależność (6) po wzmocnieniu napięciowym k U dla n tej krwinki przepływającej przez otwór pomiarowy (zwężkę, rys. 2) przybiera postać: D U = k k v n U n r 1 I f (7) k = - 2 s U n amplituda impulsu napięciowego zależna od objętości przepływającej przez otwór pomiarowy krwinki, k stała przetwarzania (k = -10 do -40 mv / fl) Pomiaru koncentracji krwinek dokonuje się przez ich zliczenie w określonej objętości zawiesiny V d, przy zadanym progu komparacji U K (rys. 5). Koncentrację krwinek w zawiesinie określamy z zależności przedstawionej w tabeli 1. W praktyce, z powodu niewystarczającej rozdzielczości czujników pomiarowych, krew rozcieńcza się w stopniu R. Zależność między koncentracjami krwinek w rozcieńczonej zawiesinie (RBC z, WBC z ), a koncentracjami we krwi (RBC, WBC) jest następująca: RBCz R RBC RBC; WBCz R WBC WBC (8) R RBC, R WBC stopień rozcieńczenia krwi do pomiaru koncentracji krwinek czerwonych i białych. Przebieg u(t) U K Czas Rys. 5. Przebieg napięcia przy przepływie krwinek przez otwór pomiarowy. Równania przetwarzania czujników koncentracji krwinek są następujące: NRBCz RRBC VdRBC RBC (9) NWBCz RWBC VdWBC WBC V drbc, V dwbc dozowana objętość rozcieńczonej krwi. Korzystając z zależności odwrotnej, na podstawie pomiaru N RBCz oraz N WBCz można obliczyć RBC i WBC. Uśredniając wartość N amplitud (7) pochodzących od przepływu krwinek czerwonych otrzymamy: m 1 N 1 N U = ĺ n U n U N D U = k k ĺ v k k MCV n = 1 N = (10) n = 1 m U średnia amplituda N impulsów, MCV średnia objętość krwinek czerwonych. Jest to równanie przetwarzania przetwornika średniej objętości krwinek czerwonych, z którego można obliczyć parametr MCV. Hematokryt (HCT) można obliczyć z zależności przedstawionych w tabeli 1. 5

6 Pomiar stężenia hemoglobiny metodą fotometrii absorpcyjnej. Podstawą metody jest prawo Bouguera Lamberta Beera. A= a(λ) d c (11) A absorbancja, a( ) wagowy współczynnik absorbancji, d grubość warstwy absorbującej, c stężenie wagowe. Pomiaru stężenia hemoglobiny dokonuje się metodą cyjanhemiglobinową przy długości fali promieniowania świetlnego = 540 nm. Ponieważ absorbancja cyjanhemiglobiny w krwi dla tej długości fali jest bardzo duża, próbkę rozcieńcza się odpowiednim odczynnikiem. Przy założeniu stałości natężenia promieniowania ( 0 = const.) padającego na kuwetę pomiarową (rys. 6) natężenie promieniowania za kuwetą jest zależne jedynie od stężenia cyjanhemiglobiny. Wynik stężenia hemoglobiny oblicza się z zależności: 1 HGB log (12) a d R 0 natężenie promieniowania monochromatycznego za kuwetą pomiarową, 0 natężenie promieniowania przed kuwetą pomiarową, R stopień rozcieńczenia próbki krwi. Na rys. 7 przedstawiono przebieg procesu pomiarowego stężenia hemoglobiny i koncentracji krwinek białych w półautomacie hematologicznym. Rys. 6. Schemat układu optycznego do pomiaru stężenia hemoglobiny metodą fotometrii absorpcyjnej Rys. 7. Przebieg procesu pomiarowego stężenia hemoglobiny i koncentracji krwinek białych w półautomacie hematologicznym 3. Rozcieńczanie próbki krwi jako element procesu pomiarowego Podstawową przyczyną konieczności wykonywania czynności rozcieńczania jest niedostateczna rozdzielczość znanych metod pomiarowych. Z powodu znacznych różnic w koncentracji poszczególnych rodzajów krwinek zakres stosowanych w systemach hematologicznych rozcieńczeń jest bardzo szeroki i wynosi od 1:200 do 1:80000 części objętościowych. Stopień rozcieńczenia definiuje się następująco: V R1 (13) V V1 V - objętość krwi, V 1 - objętość roztworu rozcieńczającego. Na ogół rozcieńczenia mniejsze niż 1:10000 wykonuje się w dwóch cyklach rozcieńczeń pojedynczych, pobierając do drugiego rozcieńczenia objętość V r z rozcieńczenia pierwszego: 6

7 V R r 2 (14) Vr V2 V 2 - objętość roztworu rozcieńczającego. Rozcieńczenie końcowe wynosi wówczas: R R 1 R 2 (15) Na rys. 8 przedstawiono schemat blokowy przygotowania próbki krwi do pomiarów koncentracji krwinek białych (WBC) i stężenia hemoglobiny (HGB) oraz koncentracji krwinek czerwonych (RBC) i hematokrytu (HCT) w półautomacie hematologicznym. Rys. 8. Schemat blokowy przygotowania próbki krwi do pomiarów HGB, WBC, RBC oraz HCT w półautomacie hematologicznym Z punktu widzenia stopnia automatyzacji procesu pomiarowego systemy hematologiczne można podzielić na: półautomaty hematologiczne, składające się z dwóch urządzeń: układu rozcieńczającego i jednostki pomiarowej (rys. 9), automaty hematologiczne, w których układ rozcieńczający i jednostka pomiarowa stanowią całość funkcjonalną (rys. 10). Rys. 9. Półautomat hematologiczny CBC 5 firmy Coulter Rys. 10. Automat hematologiczny LH 780 firmy Beckman Coulter 7

8 B. Realizacja ćwiczenia 1. Cel ćwiczenia laboratoryjnego Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodami pomiaru podstawowych parametrów hematologicznych, specyfiką obiektu pomiarów, jakim jest krew oraz z budową systemów do pomiaru tychże parametrów. 2. Aparatura, narzędzia pomocnicze i odczynniki stosowane w ćwiczeniu W ćwiczeniu wykorzystuje się następujące przyrządy pomiarowe, urządzenia pomocnicze i odczynniki: półautomat hematologiczny CBC5+DDIII, mieszadło hematologiczne AM-2, krew wzorcowa, roztwór izotoniczny, odczynnik hemolizujący. 3. Wymagania BHP W trakcie realizacji programu ćwiczenia należy przestrzegać zasad odczytanych i omówionych we wstępie do ćwiczeń, zawartych w: Regulaminie porządkowym w laboratorium z miernictwa w medycynie z uwzględnieniem przepisów BHP oraz w Instrukcji obsługi urządzeń elektronicznych znajdujących się w laboratorium z uwzględnieniem przepisów BHP. Regulamin i instrukcja są dostępne w pomieszczeniu laboratoryjnym w widocznym miejscu. Z uwagi na specyfikę niniejszego ćwiczenia należy dodatkowo przestrzegać następujących zasad: używana krew wzorcowa jest materiałem biologicznym przebadanym z bakteriologicznego i wirusologicznego punktu widzenia; w czasie przygotowywania próbek i wykonywania pomiarów w krwi należy jednak zachować szczególną ostrożność i używać rękawiczek jednokrotnego użytku, używany do pomiarów stężenia hemoglobiny i koncentracji krwinek białych odczynnik jest materiałem szkodliwym, w trakcie ćwiczenia należy unikać kontaktu tego odczynnika ze skórą, w szczególności z okiem i jego okolicami; w razie wystąpienia takiego zdarzenia należy przepłukać oczy pod bieżącą wodą. 4. Przebieg ćwiczenia 4.1. Zapoznać się z budową półautomatu hematologicznego CBC5 + DDIII Zdjąć obudowę układu rozcieńczającego DDIII i systemu pomiarowego CBC5; zapoznać się torami przepływu próbki i odczynnika Naszkicować i wstępnie opisać schemat hydrauliczno mechaniczny układu rozcieńczającego DDIII Zapoznać się z obsługą półautomatu hematologicznego CBC5 + DDIII Wykonać pomiary podstawowych parametrów hematologicznych w trzech przygotowanych próbkach krwi (CBC5 + DDIII) Tabela Wykonać pomiary koncentracji krwinek czerwonych w trzech kolejnych próbkach krwi; pomiary każdej próbki wykonać trzykrotnie, Tabele 2,3,4. 8

9 Przygotowanie próbek dokonujemy używając układu rozcieńczającego (rys.8). 1. Czynności przygotowania próbki do pomiaru WBC: przełączyć układ rozcieńczający na WBC, pierwsze przyciśnięcie - pobranie wzorca, wytrzeć końcówkę pipety, zabrać fiolkę z wzorcem, umieścić naczyńko WBC, drugie przyciśnięcie aparat dozuje roztwór izotoniczny, zamknąć naczyńko pokrywką; lekko wymieszać zawiesinę krwi, 2. Czynności przygotowania próbki do pomiaru RBC: przełączyć układ rozcieńczający na RBC, pierwsze przyciśnięcie - pobrać zawiesinę z naczyńka WBC, wytrzeć końcówkę pipety, umieścić naczyńko RBC, drugie przyciśnięcie aparat dozuje roztwór izotoniczny, zamknąć naczyńko pokrywką i lekko wymieszać zawiesinę. 3. Do próbki do pomiaru WBC dodać 3 krople odczynnika do pomiaru WBC i lekko wymieszać zawiesinę. Wyniki pomiarów CBC5 + DDIII RBC (10 6 1/mm 3 ) HCT (%) WBC (10 3 1/mm 3 ) HGB (g/dl) Tabela 1 Tabela 2 Próbki niezależne nr 1 nr 2 nr 3 m N sd N cv N Jedna próbka (nr 1) m 1 sd 1 cv 1 Wskaźniki czerwonokrwinkowe Wskaźniki czerwonokrwinkowe MCV ( m 3 ) MCH (pg) MCHC (g/dl) Tabela 3 Tabela 4 CBC5 + DDIII Jedna próbka (nr 2) m 2 sd 2 cv 2 Jedna próbka (nr 3) m 3 sd 3 cv 3 RBC (10 6 1/mm 3 ) HCT (%) WBC (10 3 1/mm 3 ) HGB (g/dl) Wskaźniki czerwonokrwinkowe Wskaźniki czerwonokrwinkowe MCV ( m 3 ) MCH (pg) MCHC (g/dl) 9

10 C. Procedura opracowania wyników pomiarów Ad. 4.3: Narysować i opisać schemat hydrauliczno mechaniczny układu rozcieńczającego DDIII. Schemat powinien zawierać wszystkie istotne dla pracy układu rozcieńczającego podzespoły i odzwierciedlać cykle pracy układu (cykl ssania, cykl dozowania) oraz cykle rozcieńczeń (rozcieńczenie R 1 do pomiaru WBC i HGB i R 2 do pomiaru RBC i HCT). Ad. 4.5: 1. Obliczyć wartości średnie, odchylenia standardowe i współczynniki zmienności każdej z przeprowadzonych serii pomiarów oraz obliczonych wartości MCV, MCH, MCHC. N 2 i N x m 1 i 1 sd m xi sd cv 100 N n 1 N 1 m 2. Porównać współczynniki zmienności obu serii pomiarowych; wyjaśnić przyczynę ewentualnych różnic między nimi (cv N, cv 1 ). 3. Dysponując danymi o granicznym błędzie względnym i układu rozcieńczającego oraz systemu pomiarowego (tabela 5) obliczyć standardową niepewność względną B pojedynczego pomiaru WBC, HGB, RBC i HCT. Dokonując obliczeń należy przyjąć: 1 zasadę sumowania granicznych błędów względnych: n δ max = δi, 100 i=1 metodę typu B określania standardowej niepewności względnej: Tabela 5 Parametr Rozcieńczenie WBC, HGB Rozcieńczenie RBC, HCT i (%) Pomiar RBC 2,0 % 1,0 % HCT 2,8 % 1,0 % WBC 3,0 % HGB * Przepisać z tabeli 1. 1,5 % max B = B (%) cv N * (%) 4. Przedyskutować różnice między teoretycznymi przewidywaniami przedziału standardowej niepewności względnej B, a praktycznie uzyskanymi rezultatami współczynnika zmienności cv N. Ad. 4.6: 1. Obliczyć wartości średnie, odchylenia standardowe i współczynniki zmienności serii pomiarów. 2. Porównać wartości średnie m* N i współczynniki zmienności cv* N (tabele 2,3,4) z ich odpowiednikami z tabeli 1 (m N, cv N ); wyjaśnić przyczynę różnic między nimi