Instrukcja używania zestawów do typowania antygenów zgodności tkankowej HLA SSPGo TM firmy Biofortuna (Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits)

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 1 z 12 Instrukcja używania zestawów do typowania antygenów zgodności tkankowej HLA SSPGo TM firmy Biofortuna (Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits) 1. Przeznaczenie Wydanie 5 zmienione, zgodne z CE, styczeń 2014 Zestawy HLA SSPGo firmy Biofortuna opierają się na badaniu na poziomie genomowego DNA i służą do jakościowego oznaczania alleli HLA na poziomie niskiej rozdzielczości (low resolution) lub do amplifikacji określonych grup alleli na poziomie pośredniej rozdzielczości ( intermediate/medium level resolution). Badanie na pośrednim poziomie rozdzielczości jest powszechnie definiowane jako badanie, w którym większość uzyskanych wyników można jednoznacznie przedstawić w postaci dwucyfrowej; np. DQB1*02, DQB1*05, itd. Badanie na wysokim poziomie rozdzielczości definiuje się jako badanie, w którym większość określonych alleli można przedstawić w postaci czterocyfrowej, jak np. DQB1*02:01, DQB1*05:01, itd. Jest to produkt do badań diagnostycznych in vitro, przeznaczony do użytku wyłącznie przez przeszkolony personel. 2. Wprowadzenie Cząsteczki HLA odgrywają kluczową rolę w układzie odpornościowym oraz odróżnianiu antygenów własnych od obcych ( self/non-self), w związku z tym, przed dokonaniem większości transplantacji, konieczne jest przeprowadzenie genotypowania oraz dobór pod względem HLA. Jako że antygeny HLA ograniczają swoistość odpowiedzi immunologicznych przez komórki T, genotypowanie HLA jest przydatnym narzędziem badawczym w każdym zaburzeniu układu odpornościowego lub każdej odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez patogeny, szczepionki lub leczenie. Genotypowanie HLA może być także przydatne w potwierdzeniu rozpoznania choroby, jeśli wykaże się, iż niektóre allele HLA są znacząco powiązane z danymi stanami chorobowymi. Większość genów HLA jest wysoce polimorficzna i zazwyczaj do dokładnego określenia antygenów HLA wymagane jest przeprowadzenie genotypowania DNA. Typowanie metodą PCR-SSP przy użyciu primerów o sekwencjach specyficznych dla badanych alleli (ang. Sequence-Specific Primers, SSP) 1 jest szybką metodą typowania HLA, szczególnie przydatną w sytuacjach, gdzie wymagane jest badanie na pośrednim poziomie rozdzielczości. Wszystkie zestawy Biofortuna SSP zawierają kompletne, liofilizowane zestawy reakcyjne, w tym polimerazę, a więc przed wykonaniem reakcji PCR osoba przeprowadzająca badanie musi jedynie dodać próbkę DNA. Podejmowane są wszelkie starania, aby zestawy te były aktualizowane względem publikowanych w bazie IMGT HLA informacji o nowych znanych sekwencjach. Aktualne dane o zestawach są dostępne na stronie www.biofortuna.com. 3. Opis testu Metoda PCR SSP opiera się o zasadę, że do amplifikacji dochodzi tylko wtedy, gdy końce 3 primerów są całkowicie dopasowane do sekwencji docelowej. W przypadku złego dopasowania primerów amplifikacja nie jest wydajna 2. Do

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 2 z 12 każdej mieszaniny reakcyjnej PCR dołączana jest kontrola wewnętrzna: para primerów, która umożliwia amplifikację konserwatywnego regionu genu metabolizmu podstawowego (tzw. housekeeping); para primerów kontroli wewnętrznej jest wskaźnikiem prawidłowego przebiegu reakcji PCR. W typowaniu metodą SSP zazwyczaj wykorzystuje się wiele reakcji, które po łącznej analizie wskazują na dany genotyp. Wizualizacja amplifikowanych produktów jest możliwa przy użyciu rozdziału elektroforetycznego w żelu agarozowym, który rozdziela fragmenty DNA według ich rozmiaru. 4. Zawartość zestawu Polipropylenowe płytki lub paski do PCR, zawierających od 8 do 96 studzienek reakcyjnych (w zależności od rodzaju zestawu), z których każde zawiera liofilizowane primery, polimerazę, mieszaninę dntp* oraz bufor. Każda płytka lub pasek są dostarczane w formie zakrytej, odpowiednio, folią lub wieczkiem i pakowane osobno w woreczki foliowe zawierające saszetkę z środkiem suszącym. Folie lub wieczka do naczyń do PCR 1 instrukcja użycia Świadectwo analizy Arkusze interpretacyjne i karty charakterystyk substancji niebezpiecznych (MSDS) można pobrać ze strony firmy Biofortuna www.biofortuna.com. Jeśli pobranie tych danych ze strony internetowej nie powiedzie się, prosimy o kontakt z lokalnym dystrybutorem. * CleanAmp dntp zostały wykorzystane w produktach SSPGo firmy Biofortuna na mocy licencji udzielonej przez firmę Trilink Biotechnologies Inc. 5. Niedostarczane odczynniki i sprzęt odpowiednie pipety i jałowe końcówki, np. pipety P10 z końcówkami o obj. 10 µl wyposażonymi w filtry zestaw/sprzęt do izolacji DNA spektrofotometr UV probówki polipropylenowe jałowa woda o stopniu czystości do biologii molekularnej termocykler spełniający następujące warunki: 96-dołkowa głowica z podgrzewaną do temperatury 104 C pokrywą, w celu eliminacji konieczności używania oleju, szybkość zmiany temperatury 1,0 C/s, zakres osiąganych temperatur między 4,0 C a 99,9 C, dokładność termiczna ± 0,25 C w zakresie od 35 C do 99 C, kalibracja temperatury względem wzorca, możliwość programowania zgodnie z warunkami termicznymi reakcji PCR podanymi w rozdziale 8 poniżej. Uwaga: szczegóły dotyczące konkretnego termocyklera znajdują się w dołączonym do niego przez producenta podręczniku użytkownika. Termocykler powinien być skalibrowany zgodnie z wytycznymi akredytacyjnymi Amerykańskiego Towarzystwa Zgodności Tkankowej i Immunogenetyki ( American Society of Histocompatibility and Immunogenetic, ASHI) lub Europejskiej Federacji Immunogenetyki (European Federation of Immunogenetics, EFI). odczynniki do elektroforezy w żelu (agaroza, 0,5 TBE, markery masy cząsteczkowej do analizy fragmentów DNA o wielkości do 1000 pz, roztwór bromku etydyny o stężeniu 10 mg/ml) sprzęt do elektroforezy w żelu (aparat do elektroforezy, zasilacz, system do dokumentacji żeli z transiluminatorem UV) Oprogramowanie do wspomagania ręcznego analizy SSPGo zestaw wyników badań i przechowywania danych archiwalnych można pobrać ze strony internetowej Biofortuna www.biofortuna.com. Uwaga: jakiekolwiek odstępstwo od podanych warunków, takie jak inna szybkość zmiany temperatury termocyklera, może zakłócić interpretację wyników testu.

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 3 z 12 6. Środki bezpieczeństwa i ostrzeżenia Do diagnostyki in vitro Testy powinny być wykonywane wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel. Wszystkie uzyskane wyniki typowania powinny być zweryfikowane przez wykwalifikowany personel, zaś w przypadku ich wykorzystania przy podejmowaniu decyzji klinicznych, wyniki te powinny być potwierdzone przy użyciu innej metody typowania. Ze wszystkimi odczynnikami należy obchodzić się zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej. Czynności poprzedzające reakcję PCR oraz następujące po niej należy wykonywać w osobnych pomieszczeniach. Nie należy przenosić materiałów używanych po reakcji PCR z powrotem do pomieszczenia, gdzie wykonywane były czynności poprzedzające PCR. Ostrzeżenie o zagrożeniu biologicznym: Wszystkie preparaty krwiopochodne należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Ostrzeżenie o zagrożeniu biologicznym: Bromek etydyny jest substancją potencjalnie rakotwórczą. W przypadku jego stosowania należy zawsze nosić rękawiczki, fartuch laboratoryjny oraz okulary ochronne. Ostrzeżenie o zagrożeniu biologicznym: Zachować ostrożność podczas stosowania źródeł promieniowania UV należy zawsze nosić rękawiczki, fartuch laboratoryjny oraz okulary ochronne. Nigdy nie patrzeć bezpośrednio w źródło światła UV. Karty charakterystyk substancji niebezpiecznych ( Material Safety Data Sheets) są dostępne na stronie internetowej www.biofortuna.com. 7. Przechowywanie i stabilność Zestawy Biofortuna SSPGo powinny być przechowywane w temp. 2-28 C. Odczynniki powinny być rekonstytuowane poprzez dodanie próbek DNA w ciągu 3 godzin od wyjęcia naczynek PCR z foliowych woreczków. Data ważności jest podana na opakowaniu. Nie stosować produktów po upływie daty ważności podanej na opakowaniu. Nie stosować zestawów, jeśli woreczki foliowe są rozdarte lub podziurawione, albo jeżeli w opakowaniu brakuje saszetki z środkiem suszącym. Tylko używanie dołączonych folii lub wieczek zapewnia szczelne zamknięcie naczyń do PCR po dodaniu DNA. Pominięcie tego etapu może spowodować odparowanie próbek podczas amplifikacji metodą PCR. Należy zwracać szczególną uwagę na krawędzie i rogi naczynek. Uwaga (1): W razie konieczności, wyjęte z opakowań foliowych płytki lub paski do PCR mogą być przechowywane do 3 godzin w temperaturze do 21 C przy wilgotności względnej nie wyższej niż 60% przed dodaniem DNA. Uwaga (2): Po dodaniu DNA, płytki lub paski do PCR wyjęte ze świeżo otwartych opakowań foliowych mogą być przechowywane do 24 godzin w temperaturze 2-8 C przed etapem PCR, o ile zostały szczelnie zakryte w celu uniknięcia strat powodowanych parowaniem. 8. Sposób użycia Wymogi dotyczące próbek DNA Każda reakcja testu jest optymalizowana na 50-100 ng DNA, aczkolwiek najistotniejszą kwestią jest to, aby każda reakcja była rekonstytuowana przez dodanie dokładnie odmierzonych 10 µl płynu. A zatem badanie można wykonać tylko z użyciem 10 µl roztworu DNA o stężeniu 5-10 ng/µl. Należy rozcieńczyć próbkę DNA do żądanego stężenia, używając wyłącznie jałowej wody o czystości do biologii molekularnej. Uwaga: Próbka DNA nie może zawierać końcowo więcej niż 2,5 mm Tris/0,25 mm EDTA. Należy używać DNA ekstrahowanego z próbek krwi pobieranej na cytrynian lub EDTA. Ponieważ heparyna może hamować reakcję PCR, nie należy przeprowadzać ekstrakcji DNA z heparynizowanych próbek krwi. Wykazano, że hemoglobina obecna w próbkach DNA w stężeniach wyższych niż 1 mg/dl zakłóca działanie zestawów SSPGo HLA.

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 4 z 12 DNA można ekstrahować dowolną z tradycyjnych technik. Należy upewnić się, że zmierzone przy pomocy spektrofotometru UV OD 260/280 próbki DNA mieści się w przedziale między 1,66 a 1,94. Wskazówki dotyczące czynności poprzedzających reakcję PCR i. Wyjąć płytkę lub pasek probówek SSPGo z zamkniętego woreczka. ii. Zapisać numer partii produktu. iii. Zanim usunie się folię lub wieczko, upewnić się, że liofilizowany osad znajduje się na dnie próbówki/studzienki. Jeżeli nie, należy go tam wprowadzić przez delikatne opukiwanie. Należy zauważyć, że pierwsza z reakcji dla każdego locus ma zawsze kolor bladoróżowy (czerwony po uwodnieniu) w odróżnieniu od pozostałych składników zestawu. Niektóre płytki PCR w ostatniej studzience zawierają zintegrowaną kontrolę bez matrycy (ang. no template control) o zabarwieniu purpurowym. iv. Przy użyciu jałowego sprzętu odmierzyć po 10 µl roztworu DNA do każdej reakcji na płytce lub w pasku probówek. Patrz komentarz w rozdziale 8 w części Wymogi dotyczące próbek DNA. Jeśli płytka zawiera kontrolę bez matrycy o purpurowym zabarwieniu, odmierzyć do niej 10 µl rozcieńczalnika (bez DNA). Patrz komentarz dotyczący kontroli bez matrycy w rozdziale 8. v. Upewnić się, czy przed wykonaniem cyklu termicznego w każdej reakcji DNA zetknęło się z liofilizatem odczynników. vi. Reakcje zabezpieczyć za pomocą dostarczonych arkuszy folii lub wieczek do probówek PCR. Upewnić się, czy folia ściśle przylega, aby zapobiec parowaniu. Należy zwracać szczególną uwagę na krawędzie i rogi. vii. Wstawić płytkę lub paski probówek bezpośrednio do termocyklera. Upewnić się, czy naczynka są całkowicie osadzone w bloku, a pokrywa jest w pełni dociśnięta. Jeśli któryś z tych warunków nie zostanie spełniony, poszczególne reakcje PCR mogą się nie powieść z uwagi na parowanie i kondensację podczas PCR. viii. Uruchomić program PCR (patrz Parametry reakcji PCR ). KOMENTARZ DOTYCZĄCY REKONSTYTUCJI: Odczynniki powinny zostać rekonstytuowane przy pomocy próbki DNA natychmiast po wyjęciu płytki z foliowego woreczka. Dodatkowe informacje podano w Uwagach (1) i (2). KOMENTARZ DOTYCZĄCY KONTROLI BEZ MATRYCY: Niektóre zestawy zawierają kontrolę bez matrycy (NTC) ja ko ostatnią reakcję na płytce. Reakcja ta zawiera purpurowy barwnik, który pozwala na jej odróżnienie od pozostałych reakcji. Kontrola NTC służy do wykrywania kontaminacji PCR lub kontaminacji genomowym DNA, jaka może występować w wodzie użytej do utworzenia roztworu DNA. W przypadku kontaminacji PCR można zaobserwować obecność amplikonu(ów) o różnej wielkości. KOMENTARZ DOTYCZĄCY WYSOKOŚCI PŁYTKI PCR/PROBÓWEK W PASKU: Zaleca się, aby wysokość płytek oraz probówek w paskach była taka sama, jeśli są one wkładane do tego samego urządzenia do przeprowadzania reakcji PCR. Różne wysokości mogą spowodować niewystarczający kontakt płytek lub probówek z pokrywą grzejną aparatu do przeprowadzania reakcji PCR. Może to przyczynić się do zmniejszenia wydajności amplifikacji metodą PCR lub też jej braku. Parametry reakcji PCR Dla reakcji PCR należy stosować poniższe parametry. Upewnić się, czy parametr szybkości zmiany temperatury (ang. ramp speed) wynosi 1 C na sekundę, a następnie włączyć pokrywę grzejną. Pełna instrukcja obsługi termocyklera znajduje się w dołączonym do niego przez producenta podręczniku użytkownika. Termocyklery powinny być skalibrowane zgodnie z wytycznymi akredytacyjnymi Amerykańskiego Towarzystwa Zgodności Tkankowej i Immunogenetyki ( American Society of Histocompatibility and Immunogenetic, ASHI) lub Europejskiej Federacji Immunogenetyki (European Federation of Immunogenetics, EFI). Denaturacja 94 C 5 minut Denaturacja 96 C 15 sekund Hybrydyzacja 66 C 50 sekund 10 cykli Polimeryzacja 72 C 30 sekund

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 5 z 12 Denaturacja 96 C 15 sekund Hybrydyzacja 64 C 50 sekund 20 cykli Polimeryzacja 72 C 30 sekund HOLD (utrzymanie stałej temperatury) 15 C przez okres nie dłuższy niż 72 godzin przed naniesieniem na żel. W razie konieczności płytka PCR może być przechowywana do 24 godzin w temperaturze 2-8 C przed naniesieniem na żel. Zawsze należy się upewnić, że płytka jest szczelnie zamknięta. Elektroforeza w żelu Poniższe wskazówki dotyczą elektroforezy poziomej w żelu agarozowym: Przygotować 2% żel agarozowy w buforze 0,5 TBE. Po schłodzeniu żelu do temperatury ok. 60 C dodać bromek etydyny do końcowego stężenia 0,5 µg/ml. Wylać żel i umieścić w nim grzebienie w standardzie płytki mikrotitracyjnej (np. 12 8 studzienek w odstępach 9 mm). Po zastygnięciu żelu wyjąć grzebienie i zalać żel buforem 0,5 TBE. Nanieść całkowitą objętość reakcji PCR do odpowiedniego zagłębienia w 2% żelu agarozowym, zapisując położenie każdej reakcji. Do określania wielkości produktu zalecane jest korzystanie ze wzorca masy w zakresie do 1000 pz. Prowadzić rozdział przez 20 minut w polu elektrycznym o natężeniu 10 V/cm. Szczegółowe informacje na temat poszczególnych urządzeń/wyposażenia znajduje się w dołączonym przez producenta do aparatu do elektroforezy podręczniku użytkownika. Obrazowanie żeli powinno być przeprowadzone przy użyciu systemu do dokumentacji żeli z transiluminatorem UV. Uwaga: Zbyt krótko prowadzona elektroforeza może spowodować, że duże amplikony wielkości powyżej 600 pz mogą nie rozdzielić się od amplikonu kontrolnego. Należy się upewnić, że warunki prowadzenia rozdziału umożliwiają zobaczenie takich amplikonów. Zbyt długo prowadzona elektroforeza może doprowadzić do utraty małych amplikonów na skutek ich wejścia w poprzedzające studzienki w żelu. 9. Interpretacja Zestawy SSPGo są opracowane w taki sposób, aby wyniki można było uzyskać ręcznie w oparciu o arkusze interpretacyjne dostępne na stronie www.biofortuna.com. W przypadku problemów z dostępem do strony prosimy o kontakt z lokalnym dystrybutorem. Przyłożyć obraz żelu do odpowiedniego arkusza interpretacyjnego, dopasowując numery zestawu i partii. Obejrzeć obraz żelu. Każda reakcja powinna zawierać prążek kontroli pozytywnej. Należy korzystać z arkusza interpretacyjnego, bowiem prążki te mogą mieć różne rozmiary w zależności od produktu SSPGo. Prążki kontroli wewnętrznej mogą wydawać się mniej intensywne, jeśli obecne są prążki swoiste dla alleli. Jeśli obecny jest prążek swoisty dla danego allelu, lecz brak jest prążka kontroli wewnętrznej, taki wynik nadal powinno się uważać za dodatni. Należy zignorować wszelkie prążki mniejsze niż 70 pz, bowiem są to pozostałe po reakcji primery. Określić liczbę dodatnich reakcji. Na reakcje dodatnie wskazuje obecność prążków o oczekiwanej wielkości, zgodnie z arkuszami interpretacyjnymi. Należy pamiętać, że w danej reakcji można uzyskać produkty o więcej niż jednej wielkości - są to reakcje multipleksowane (z dodatkiem większej ilości primerów) i są one odnotowane w arkuszach interpretacyjnych. Porównać dodatnie reakcje z arkuszami interpretacyjnymi. Wynik dodatni w reakcji wskazuje na obecność co najmniej jednego z alleli, podanych dla niej w arkuszu interpretacyjnym. Każdy określony allel można amplifikować w kilku probówkach jeśli dany allel jest obecny, wszystkie te reakcje powinny dać wynik dodatni.

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 6 z 12 Prążek kontrolny Prążek swoisty dla allelu Rys. 1 Przykłady reakcji dodatnich - obecność prążków swoistych dla danych alleli oraz prążków kontrolnych (reakcje 1-3); reakcje ujemne - obecność prążków kontrolnych i brak prążków swoistych dla danych alleli (reakcje 4-7) oraz brak reakcji - brak jakichkolwiek prążków (reakcja 8). Należy upewnić się, czy numer partii zestawu odpowiada wersji podanej w arkuszu interpretacyjnym. Oprogramowanie do wspomagania ręcznego analizy SSPGo zestaw wyników badań i przechowywania danych archiwalnych można pobrać ze strony internetowej Biofortuna www.biofortuna.com. 10. Procedury zapewnienia i kontroli jakości Jakość każdej serii zestawu SSPGo jest sprawdzana przed jej wprowadzeniem do sprzedaży przez firmę Biofortuna. Próbki każdej serii zestawu są sprawdzane względem zdefiniowanego panelu składającego się z próbek ludzkiego DNA w celu zapewnienia prawidłowego działania. Każda reakcja przeszła walidację względem co najmniej 47 dobrze scharakteryzowanych próbek DNA pochodzących z linii komórkowych. Firma Biofortuna zaleca, aby laboratoria przeprowadzały wewnętrzną walidację wszystkich nowych produktów do typowania przed ich użyciem do badania próbek klinicznych. Typowanie diagnostyczne powinno być przeprowadzane wyłącznie przez wysoce wykwalifikowany i w pełni przeszkolony personel, zaś uzyskane wyniki powinny być sprawdzane przez innego przeszkolonego pracownika. 11. Dane kliniczne Kierunek elektroforezy W pięciu ośrodkach testowych przeprowadzono badanie diagnostyczne in vitro, porównując wydajność zestawów do typowania HLA SSPGo z dostępnym na rynku One Lambda Labtype SSO. Typowanie locus prowadzone w ramach badania SSPGo dostarczyło wyników dla HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPB1, DPA1 i HLA-DQA1*05, DQB1*02, DQ8. Wyniki kliniczne zestawów do typowania HLA SSPGo były w 98,3-100% zgodne z wynikami uzyskanymi metodą odnośnikową (metodą SSO) z co najmniej 95% przedziałem ufności genotypowania alleli HLA klasy I i II w DNA uzyskanym z krwi pełnej w ilości 5-10 ng/μl. Odrzucając trzy (3) potwierdzone niezgodne wyniki genotypowania, uzyskano 100% zgodności dla 1 222 próbek i trzech partii każdego badanego zestawu w ośrodkach klinicznych w Stanach Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii. Powtarzalność wyników między ośrodkami dla zestawów do typowania HLA SSPGo badano w trzech ośrodkach używających reprezentatywnego panelu 8 reakcji PCR SSPGo dla dostarczonego DNA w próbkach o stężeniu 4ng/μl i 11ng/μl, wartościach granicznych zakresu stężeń dla zestawu. Całkowita liczba 958/960 poszczególnych reakcji rozłożonych równomiernie pomiędzy trzema zewnętrznymi ośrodkami była zgodna z próbkami DNA, co dawało ostatecznie zgodność rzędu 99,7% (dolna granica przedziału ufności wyniosła 0,995). Powtarzalność wyników z partii na partię badano na trzech partiach reprezentatywnego zestawu do typowania HLA SSPGo w jednym ośrodku/ przez jednego operatora, używając DNA w zakresie stężeń 5-10 ng/μl. Powtarzalność z partii na partię była w 100% zgodna z wynikami uzyskanymi dla metody odnośnikowej dla 130/130 próbek DNA testowanych na trzech (3) partiach reprezentatywnego zestawu do typowania HLA SSPGo w całkowej liczbie 390 oznaczeń. Uzyskano zgodność pozytywnej weryfikacji HLA przez SSPGo dla alleli klasy I i II w badaniu porównawczym, wykorzystującym próbki kliniczne testowane LABType SSO. Wewnętrzne testy HLA SSPGo dały zgodne wyniki dla

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 7 z 12 referencyjnych próbek DNA z wyjątkiem niedostępnych próbek takich jak pewne rzadkie allele HLA-DPB1 i rzadkie allele HLA-B oraz takich grup alleli jak B*59:01, B*78 i B*83:01. Nie potwierdzono wyników dla następujących rzadkich grup alleli B*59, B*78, B*83, DPB*21:01, DPB*26:01:02, DPB*27:01, DPB*28:01, DPB*29:01, DPB*31:01, DPB*34:01, DPB*35:01:01, DPB*39:01, DPB*45:1, DPB*46:01, DPB*51:01, DPB*55:01, DPB*59:01, DPB*63:01, DPB*81:01, DPB*85:01 i DPB*105:01 12. Bibliografia 1) Bunce M et al. Tissue Antigens. 1995 Nov;46(5):355-67. 2) Saiki RK et al. Nature. 1986 Nov 13-19;324(6093):163-6. 13. Wskazówki dotyczące wykrywania i rozwiązywania problemów z zestawami SSPGo Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Brak amplifikacji we wszystkich reakcjach Nieprawidłowe stężenie użytego DNA Określić ilość DNA mierząc OD 280 oraz upewnić się, czy dodano łącznie 50-100 ng DNA w objętości 10 µl na każdą reakcję. Inhibitory PCR obecne w próbce DNA Nie używać heparynizowanej krwi. Unikać próbek DNA zawierających hemoglobinę w stężeniu wyższym niż 1 mg/dl. Słaba jakość użytej próbki DNA Zbadać jakość DNA. Stosunek OD 260/280 mierzony za pomocą spektrofotometru UV powinien wynosić 1,66 1,94. Upewnić się, czy DNA jest w pełni zawieszone w roztworze. Odczynniki nie dają się w pełni rekonstytuować Nieprawidłowe ustawienia termocyklera Upewnić się, że próbka DNA została rozcieńczona wodą o czystości do biologii molekularnej i że nie zawiera więcej niż 2,5 mm Tris/0,25 mm EDTA. Upewnić się, że osady są w pełni nawodnione po dodaniu DNA. Upewnić się, czy do każdej reakcji dodano 10 µl roztworu DNA. Upewnić się, czy program PCR został prawidłowo wprowadzony zgodnie z instrukcją. Upewnić się, czy pokrywa grzejna termocyklera jest włączona i wystarczająco mocno dociśnięta. Problemy podczas elektroforezy Dalsze informacje, patrz instrukcja obsługi termocyklera. Upewnić się, czy do aparatu do elektroforezy jest podłączone zasilanie - sprawdzić zasilacz i oczyścić elektrody. Prowadzić elektroforezę w buforze 0,5 TBE. Upewnić się, czy użyto świeżego bromku etydyny w stężeniu 0,5 µg/ml. Sprawdzić, czy podczas obrazowania żeli natężenie światła UV było

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 8 z 12 Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie wystarczające. Losowe wypadanie (ang. drop-out) amplikonów specyficznych dla kontroli i/lub alleli Płytki nieprawidłowo zamknięte Błędy dotyczące żelu Problemy dotyczące termocyklera Problemy dotyczące parowania Dalsze informacje, patrz instrukcja obsługi aparatu do elektroforezy oraz zasilacza. Niedokładne zabezpieczenie płytek może doprowadzić do parowania próbek podczas reakcji PCR. Firma Biofortuna dostarcza z zestawem zalecane arkusze folii zabezpieczającej. W sprawie dodatkowych dostaw należy kontaktować się z lokalnym dystrybutorem. Upewnić się, czy wszystkie zagłębienia są odpowiednio zabezpieczone. Zwrócić szczególną uwagę na zagłębienia znajdujące się blisko krawędzi płytki lub paska PCR. Upewnić się, czy wszystkie zagłębienia na żelu zostały zapełnione w prawidłowej kolejności i czy jednakowa objętość reakcji PCR została dodana do każdego zagłębienia. Przeprowadzić kalibrację pipet zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Sprawdzić, czy zagłębienia zostały prawidłowo uformowane w żelu. Zachować ostrożność podczas wyjmowania grzebieni, bowiem można naruszyć dno zagłębień. Upewnić się, czy przed wylaniem żelu agaroza uległa całkowitemu rozpuszczeniu. Upewnić się, czy rozdział nie trwał zbyt długo, bowiem krótsze amplikony mogą wypadać z żelu na końcach. Upewnić się, czy rozdział trwał wystarczająco długo, aby doszło do separacji prążków. Używać świeżego roztworu bromku etydyny. Niepowodzenie reakcji, szczególnie w pozycjach skrajnych, może być spowodowane niewystarczającym dociśnięciem pokrywy. Może to być przyczyną parowania oraz kondensacji reakcji PCR od połowy naczynka PCR, prowadząc do błędów lub braku reakcji PCR. Przestrzegać wytycznych producenta dotyczących konserwacji oraz kalibracji termocyklera. Sprawdzić, czy parametry reakcji PCR są prawidłowo ustawione zgodnie z instrukcją używania. Upewnić się, czy wszystkie zagłębienia są odpowiednio zamknięte. Zwrócić szczególną uwagę na zagłębienia znajdujące się blisko krawędzi płytki lub pasków PCR. Upewnić się, czy pokrywa grzejna jest włączona i czy siła

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 9 z 12 Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie docisku jest wystarczająca. Upewnić się, czy używane są arkusze folii zabezpieczającej dostarczane przez firmę Biofortuna. W sprawie dodatkowych dostaw należy kontaktować się z lokalnym dystrybutorem. Sporadyczne błędy spowodowane przez problemy dotyczące próbek DNA Brak DNA: Upewnić się, czy DNA jest obecne we wszystkich zagłębieniach. Nieprawidłowa objętość: Upewnić się, czy do każdej reakcji dodano po 10 µl roztworu DNA. Zbyt dużo DNA: Ilość powyżej 200 ng lub poniżej 20 ng może spowodować błędy reakcji PCR. Zanieczyszczenia obecne w próbkach DNA mogą sporadycznie lub całkowicie uniemożliwić amplifikację. Rozmazany obraz żelu DNA Sprawdzić stężenie i czystość DNA. Dodanie zbyt dużej ilości DNA do reakcji PCR może przyczynić się do uzyskania rozmazanych obrazów żeli. Słaba amplifikacja Nieswoista amplifikacja Problem dotyczący stężenia DNA Problemy dotyczące termocyklera Błędy dotyczące żelu Problem dotyczący stężenia DNA Reakcje naniesione w nieprawidłowej kolejności Zidentyfikowany nowy allel Przyczyną może też być degradacja lub niska czystość DNA. Należy uzyskać nową próbkę. Sprawdzić, czy stężenie DNA nie jest zbyt wysokie ani zbyt niskie. Docelowe stężenie DNA w każdej reakcji powinno wynosić od 50 do 100 ng DNA w objętości 10 µl. Przestrzegać wytycznych producenta dotyczących konserwacji oraz kalibracji termocyklera. Sprawdzić, czy parametry reakcji PCR są prawidłowo ustawione zgodnie z instrukcją użytkowania. Upewnić się, czy do każdego zagłębienia dodano jednakową objętość reakcji - pomiędzy 5 µl a 10 µl. Przeprowadzić kalibrację pipet zgodnie z instrukcjami producenta. Używać świeżego roztworu bromku etydyny. Sprawdzić, czy stężenie DNA nie jest zbyt wysokie ani zbyt niskie. Docelowe stężenie DNA w każdej reakcji powinno wynosić od 50 do 100 ng DNA w objętości 10 µl. Sprawdzić ustawienie ścieżek w reakcji PCR oraz w żelu. Starać się nie dopuścić do przelania się produktów z sąsiednich zagłębień podczas elektroforezy poprzez ich odpowiednie napełnienie oraz wyjęcie grzebieni dopiero po zastygnięciu żelu. Wcześniej niezsekwencjonowane allele mogą być obecne w próbce, tworząc nowy wzór amplifikacji. W przypadku stosowania starych arkuszy interpretacyjnych należy pobrać bardziej aktualny arkusz ze strony www.biofortuna.com. Jeśli zaktualizowane

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 10 z 12 Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie dane nie pasują do nowego wzoru, należy go sprawdzić, stosując inny zestaw firmy Biofortuna lub podjąć próbę zidentyfikowania metodą sekwencjonowania. Wzór amplifikacji niemożliwy do zinterpretowania Niewłaściwa interpretacja artefaktu jako specyficznego prążka. Reakcje naniesione w nieprawidłowej kolejności Błędy poszczególnych reakcji PCR Brak krótkich amplikonów Zidentyfikowany nowy allel w próbce Sprawdzić prawidłowy rozmiar prążka w odpowiednich arkuszach interpretacyjnych. Sprawdzić, czy wszystkie specyficzne produkty amplifikacji mają prawidłową wielkość lub czy artefakt (przeniesienie, dimer primerów) nie został błędnie zinterpretowany jako produkt amplifikacji. Sprawdzić ustawienie ścieżek w reakcji PCR oraz w żelu. Sprawdzić, czy obecne są wszystkie wewnętrzne kontrole pozytywne. Ponownie zinterpretować wyniki, pomijając wszelkie brakujące reakcje. Rozdział elektroforetyczny zbyt długi, krótkie amplikony przesunęły się poza warstwę żelu lub za czoło bromku etydyny lub uległy rozproszeniu, przenikając do poprzedniego zagłębienia w żelu. Przeprowadzać elektroforezę w warunkach odpowiadających danemu systemowi żeli. Sporadycznie może dojść do odkrycia nowych alleli, w wyniku czego możliwe jest uzyskanie takiego wzoru amplifikacji, który nie odpowiada istniejącym allelom. Prosimy o kontakt z lokalnym dystrybutorem.

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 11 z 12 14. Historia zmian Zmiana: Z wersji 4 na wydanie 5 zmienione Data wprowadzenia poprawek: 21 stycznia 2014 Rozdział Rozdział 4: Zawartość zestawu Rozdział 5: Niedostarczane odczynniki i sprzęt Rozdział 8: Sposób użycia Rozdział 9: Interpretacja Rozdział 11: Dane kliniczne Rozdział 14: Historia zmian Opis poprawki Dodanie folii uszczelniających do zestawu Aktualizacja warunków, jakie musi spełniać termocykler z 96-dołkową głowicą Aktualizacja warunków przechowywania zestawu na 2-28 C Używanie nierekonstytuowanych płytek i pasków probówek do PCR Używanie rekonstytuowanych płytek i pasków probówek do PCR Rozcieńczanie DNA jałową wodą o czystości do biologii molekularnej Dodanie informacji o substancjach interferujących i aktualizacja wytycznych dotyczących czystości DNA Aktualizacja informacji o pomiarze OD 260/280 Dodanie informacji o lokalizacji liofilizowanego osadu przed dodaniem próbki Dodanie informacji o warunkach przechowywania amplifikowanego produktu Dodanie uwagi o czasie trwania elektroforezy Komentarz dotyczący informacji o danej partii produktu Numer partii zestawu musi dokładnie odpowiadać numerowi partii arkusza interpretacyjnego Dodanie całego rozdziału Dodanie całego rozdziału

DOT115v08: Instrukcje użytkowania dla Biofortuna SSPGoTM HLA zestawów. Wersja 5 CE Strona 12 z 12 15. Objaśnienia użytych symboli X Liczba testów P Przedstawiciel w krajach Wspólnoty Europejskiej Sprawdzić w instrukcji użycia i M V H Miejsce produkcji Do diagnostyki in vitro Data ważności 4: s 28: Temperatura przechowywania g Numer partii Rozprowadzane przez Global Trade Item Number 16. Dane kontaktowe producenta Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, Wielka Brytania Tel.: +44 (0) 151 334 0182 E-mail: info@biofortuna.com Strona internetowa: www.biofortuna.com 17. Tłumaczenia FranÇaise: Deutsch: Español: Italiano: České: Danske: Έλληνες: Magyar: Norske: Polska: Português: Россию: Slovenskému: Türk: Svenska: Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítások Oversettelser tilgjengelig Tłumaczenia dostępne Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga www.biofortuna.com