Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Wydział Lekarski

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Wydział Lekarski Grzegorz Matusiak Wpływ celekoksybu na śródbłonkowe i pozaśródbłonkowe szlaki wazodylatacyjne tętnic krezkowych obkurczonych endoteliną 1 Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Promotor: Dr hab. n. med. Grzegorz Grześk Bydgoszcz 2011

Kontrolowany skurcz jest świadectwem życia. (Lubert Stryer) Za cierpliwą motywację i wyrozumiałą kontrolę Doktorowi hab. n. med. Grzegorzowi Grześkowi - promotorowi niniejszej pracy, serdecznie dziękuję. Strona: 2

SPIS TREŚCI Wykaz skrótów... 5 Wykaz tabel i rycin... 9 1. Wstęp... 12 1.1. Śródbłonek budowa i funkcje... 13 1.2. Mięśniówka gładka i mechanizmy skurczu naczyniowego... 17 1.2.1. Mięśniówka gładka... 17 1.2.2. Rola wapnia w transdukcji sygnałów czynnościowych... 18 1.2.3. Mechanizmy skurczu naczyniowego... 20 1.2.4. Sterowanie skurczem mięśniówki gładkiej... 22 1.2.5. Mechanizmy i sterowanie rozkurczem naczyniowym... 25 1.2.6. Fosfodiesterazy... 28 1.2.7. Tlenek azotu (NO)... 31 1.3. Naczyniowy układ endotelinowy... 33 1.4. Prostanoidy i inhibitory cyklooksygenazy w regulacji tonusu naczyniowego... 40 2. Cel badań... 46 3. Materiał i metody badań... 47 3.1. Przygotowanie materiału do badań... 47 3.2. Zestaw aparaturowy... 48 3.3. Odczynniki i roztwory... 48 3.4. Przebieg doświadczeń... 49 3.4.1. Badanie skurczu mięśniówki gładkiej tętnic krezkowych poddawanych działaniu wzrastających stężeń ET-1 w płynie perfuzyjnym z i bez dodatku wybranych odczynników... 49 3.4.2. Badanie wpływu wybranych inhibitorów fosfodiesterazy oraz celekoksybu na wyindukowany endoteliną 1 skurcz naczyń krezkowych z zachowanym śródbłonkiem... 50 3.4.3. Badanie wpływu wybranych inhibitorów fosfodiesterazy oraz celekoksybu na naczynia krezkowe pozbawione śródbłonka i obkurczone endoteliną 1... 51 3.4.4. Badanie udziału wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej puli Ca 2+ w utrzymaniu skurczu indukowanego endoteliną 1... 52 3.5. Analiza danych... 53 Strona: 3

4. Wyniki badań... 54 4.1. Wpływ inhibitora Rho-kinazy (Y-27632) na wywoływany endoteliną 1 wzrost ciśnienia perfuzyjnego izolowanych tętnic krezkowych... 54 4.2. Wpływ antagonisty IP3 (2APB, 2-Aminoethoxydiphenylborate) na wywoływany endoteliną 1 wzrost ciśnienia perfuzyjnego izolowanych tętnic krezkowych... 56 4.3. Wpływ celekoksybu, zaprinastu, sildenafilu i rolipramu na obkurczone endoteliną 1 ludzkie tętnice krezkowe z zachowanym śródbłonkiem... 59 4.4. Wpływ celekoksybu, zaprinastu, sildenafilu i rolipramu na obkurczone endoteliną 1 ludzkie tętnice krezkowe pozbawione śródbłonka... 61 4.5. Wpływ wzrastających stężeń antagonisty IP3 (2APB) na ludzkie tętnice krezkowe obkurczone endoteliną 1 i perfundowane płynem bez oraz z jonami wapnia... 70 5. Dyskusja... 74 6. Wnioski... 85 7. Streszczenie... 86 8. Summary... 89 9. Piśmiennictwo... 92 10. Protokoły Komisji Bioetycznej... 114 Strona: 4

WYKAZ SKRÓTÓW 2APB 2-Aminoethoxydiphenylborate 8Br-cGMP 8-bromo-cykliczny guanozynomonofosforan AA kwas arachidonowy AC cyklaza adenylanowa ACE enzym (egzopeptydaza) konwertujący angiotensynę, kininaza II, CD 143 Ach acetylocholina Ang-1 angiopoetyna 1 Ang II angiotensyna II ANP przedsionkowy peptyd natriuretyczny AT 1 receptor dla Ang II typu 1 AT 2 receptor dla Ang II typu 2 ATP 5 -adenozynotrójfosforan ATP-aza adenozynotrójfosfataza BNP mózgowy peptyd natriuretyczny 8Br-cGMP 8-bromo-cykliczny - 3,5 - guanozynomonofosforan CaM kalmodulina camp cykliczny 3,5 -adenozynomonofosforan cgmp cykliczny 3,5 -guanozynomonofosforan CNP peptyd natriuretyczny typu C COX cyklooksygenaza (syntaza PG G/H) CRC krzywa stężenie-efekt CYP enzym z grupy monooksygenaz cytochromu P450 DAG diacyloglicerol E a E max EC 50 ECE EDCF EDHF EDRF efekt w obecności agonisty efekt maksymalny wartość stężenia wyzwalającego 50% efektu maksymalnego enzym konwertujący endotelinę czynnik wazokonstrykcyjny pochodzenia śródbłonkowego czynnik hiperpolaryzujący pochodzenia śródbłonkowego czynnik wazorelaksacyjny pochodzenia śródbłonkowego Strona: 5

EETs kwasy epoksyeikozatrienowe EGTA kwas etyleno-glikol-bis-aminoetylo eter-n,n,n,n tetra octowy enos śródbłonkowa syntaza NO (NOS3) ER siateczka śródplazmatyczna ET-1 endotelina 1 ET A, ET B receptor dla endoteliny typu A i typu B G białko G GC cyklaza guanylanowa GPCR receptor funkcjonalnie związany z białkiem G GTP guanozynotrójfosforan HLA leukocytarny antygen głównego ludzkiego układu zgodności tkankowej (MHC) HMG CoA hydroksymetyloglutarylo-koenzym A Hsp białko szoku cieplnego ICAM-1, ICAM-2 międzykomórkowa cząstka (glikoproteina) adhezyjna typu 1 i typu 2 IL interleukina INF interferon inos indukowana syntaza NO (NOS2) IP 3 inozytolo(1,4,5)trójfosforan IP 3 R receptor dla IP 3 L litr (dm 3, 1000 cm 3 ) LDL lipoproteina o małej gęstości L-NNA N G -NO 2 -L-Arginina, NOS inhibitor M mol (ok. 6,02214179 x 10 23 cząstek) MAPK kinaza białkowa aktywowana mitogenami MCAM błonowa cząsteczka adhezji komórkowej MHC główny układ zgodności tkankowej MLC łańcuch lekki miozyny MLCK kinaza łańcuchów lekkich miozyny MLCP fosfataza miozynowa (łańcuchów lekkich miozyny) NADH dinukleotyd nikotynamidoadeninowy w formie zredukowanej NADPH fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego w formie zredukowanej Strona: 6

NCX wymieniacz sodowo - wapniowy NEP endopeptydaza nerkowa NO tlenek azotu nnos neuronalna syntaza NO (NOS1) NOS NO-syntaza ODQ 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (sgc inhibitor) p graniczny poziom istotności różnic w seriach pomiarów PAF czynnik aktywujący płytki PAH tętnicze nadciśnienie płucne PAI-1 inhibitor tkankowego aktywatora plazminogenu typu 1 pd 2 log 10 (EC 50 ) PDE fosfodiesteraza PDGF czynnik wzrostowy pochodzenia płytkowego PG prostaglandyna PIP 2 fosfatydyloinozytolo(4,5)difosforan PIP 3 fosfatydyloinozytolo(3,4,5)trifosforan PKA kinaza proteinowa zależna od camp PKC kinaza proteinowa C PKG kinaza proteinowa zależna od cgmp PLB fosfolamban PLC fosfolipaza C PLD fosfolipaza D po 2 ciśnienie parcjalne tlenu R receptor RAA układ renina-angiotensyna-aldosteron Raf kinaza serynowo-treoninowa związana z onkogennymi retrowirusami (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma) Ras drobnocząsteczkowe białka G (GTPazy) związane z proliferacją i wzrostem komórek RhoA drobnocząsteczkowe białko G typu A RNS reaktywne formy azotu ROC kanały Ca 2+ sterowane receptorami ROK Rho-kinaza Strona: 7

ROS reaktywne formy tlenu RP względna siła działania RyR receptor rianodynowy SE odchylenie standardowe SERCA Ca 2+ - ATP-aza w retikulum endoplazmatycznym sgc cyklaza guanylanowa rozpuszczalna SMOC kanały Ca 2+ sterowane wtórnymi przekaźnikami SNP nitroprusydek sodu SOC kanały Ca 2+ sterowane retikulum endoplazmatycznym SOD dysmutaza ponadtlenkowa TF tkankowy czynnik krzepnięcia TFPI inhibitor tkankowego (zewnątrzpochodnego) szlaku krzepnięcia t-pa tkankowy aktywator plazminogenu TRPV rodzina kanałów jonowych przejściowo regulowanych receptorem VASP fosfoproteina stymulująca wazodylatację VCAM cząsteczka adhezji komórkowej naczyń VEGF naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu VOC kanały Ca 2+ sterowane potencjałem XeC xestospongina C XO oksydaza ksantynowa Y-27632 (R)-(+)-trans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-Pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride monohydrate Strona: 8

WYKAZ TABEL I RYCIN Tab. 1.1 Najważniejsze substancje pochodzenia śródbłonkowego o właściwościach naczyniokurczących (EDCF, endothelium-derived contracting factor) oraz o właściwościach naczyniorozszerzających (EDRF, endothelium-derived relaxing factor). Tab. 1.2 Sekwestracja jonów Ca 2+ w organizmie człowieka. Tab. 1.2.6 Inhibitory fosfodiesteraz ludzkich. Tab. 1.3.1 Ekspresja i wydzielanie endotelin. Tab. 1.3.2 Lokalizacja i specyficzność substratowa enzymów konwertujących endotelinę. Tab. 1.4 Receptory prostanoidowe charakterystyka sygnału przekaźnikowego, efekt naczyniowy. Tab. 4.2 Podstawowe parametry farmakometryczne wyliczone na podstawie danych z badań nad skurczem mięśniówki gładkiej tętnic krezkowych poddawanych działaniu wzrastających stężeń ET-1 w płynie perfuzyjnym z i bez dodatku Y-27632 oraz 2APB. Tab. 4.4 Podstawowe parametry farmakometryczne wyliczone na podstawie danych z badań nad reaktywnością mięśniówki gładkiej tętnic krezkowych obkurczonych ET-1 i poddawanych działaniu wzrastających stężeń celekoksybu, sildenafilu, rolipramu i zaprinastu w obecności oraz po usunięciu śródbłonka. Tab. 4.5 Podstawowe parametry farmakometryczne wyliczone na podstawie danych z badań nad reaktywnością mięśniówki gładkiej tętnic krezkowych obkurczonych ET-1 i poddawanych działaniu wzrastających stężeń 2APB w obecności oraz przy braku jonów wapnia w płynie perfundacyjnym. Strona: 9

Ryc. 1.2.3 Mechanizmy regulacji stężenia i wpływu wapnia na napięcie komórki mięśnia gładkiego. Ryc. 1.2.4 Mechanizmy aktywacji skurczu komórki mięśnia gładkiego. Ryc. 1.2.5 Mechanizmy aktywacji rozkurczu komórki mięśnia gładkiego. Ryc. 1.2.6 Specyficzność substratowa fosfodiesteraz ludzkich. Ryc. 1.2.7 Synteza NO z L-argininy przy udziale NOS. Ryc. 1.4 Selektywność wybranych inhibitorów cyklooksygenazy w stosunku do COX-1 i COX-2. Ryc. 4.1 Krzywe zależności efektu od stężenia ET-1 w warunkach kontrolnych oraz w obecności inhibitora Rho-kinazy (Y-27632). Ryc. 4.2.1 Krzywe zależności efektu od stężenia ET-1 w warunkach kontrolnych oraz w obecności 2APB. Ryc. 4.2.2 Efekt maksymalny (Em) i względna siła działania (RP) ET-1 dla tętnic krezkowych w płynie perfuzyjnym z i bez dodatku Y-27632 oraz 2APB. Ryc. 4.3 Krzywe zależności efektu od stężenia celekoksybu, zaprinastu, sildenafilu i rolipramu dla ludzkich tętnic krezkowych z zachowanym śródbłonkiem, obkurczonych ET-1. Ryc. 4.4.1 Krzywe zależności efektu od stężenia celekoksybu, zaprinastu, sildenafilu i rolipramu dla ludzkich tętnic krezkowych pozbawionych śródbłonka, obkurczonych ET-1. Ryc. 4.4.2 Krzywe zależności efektu od stężenia celekoksybu dla obkurczonych ET-1, ludzkich tętnic krezkowych z i bez śródbłonka. Strona: 10

Ryc. 4.4.3 Krzywe zależności efektu od stężenia sildenafilu dla obkurczonych ET-1, ludzkich tętnic krezkowych z i bez śródbłonka. Ryc. 4.4.4 Krzywe zależności efektu od stężenia zaprinastu dla obkurczonych ET-1, ludzkich tętnic krezkowych z i bez śródbłonka. Ryc. 4.4.5 Krzywe zależności efektu od stężenia rolipramu dla obkurczonych ET-1, ludzkich tętnic krezkowych z i bez śródbłonka. Ryc. 4.4.6 Em i RP analizowanych substancji dla tętnic ze śródbłonkiem i bez śródbłonka naczyniowego prezentowane na podstawie danych z tabeli 4.4. Ryc. 4.5.1 Krzywe zależności efektu od stężenia 2APB dla obkurczonych ET-1, ludzkich tętnic krezkowych, perfundowanych płynem z i bez Ca 2+. Ryc. 4.5.2 Krzywe zależności efektu od stężenia 2APB, celekoksybu, sildenafilu, zaprinastu i rolipramu dla obkurczonych ET-1, ludzkich tętnic krezkowych z zachowanym śródbłonkiem naczyniowym (zestawienie). Strona: 11

1. WSTĘP Historia badań nad wazoreaktywnością zaczyna się we wczesnych latach osiemdziesiątych. Wtedy to Robert Furchgott, Ferid Murad oraz Louis Ignarro postawili pierwsze kroki w identyfikacji mechanizmów interakcji zachodzących między śródbłonkiem a warstwą mięśni gładkich naczyń. Dowiedli oni, że tlenek azotu wywołuje relaksację komórek mięśniówki gładkiej, że śródbłonek jest niezbędny do wyzwalania naczyniorozszerzających właściwości acetylocholiny i, że realizacja tych właściwości jest wynikiem uwalniania przez śródbłonek tlenku azotu (określanego wówczas jako EDRF endothelium derived relaxing factor). W 1988 roku wyżej wymienieni naukowcy za swoje odkrycia zostali uhonorowani nagrodą Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny. W tym samym, 1988 roku, kiedy to przyznawano nagrodę Nobla za identyfikację podstawowych mechanizmów wazodylatacyjnych, Masashi Yanagisawa wyizolował z hodowli komórek śródbłonkowych świńskich tętnic substancję budowy peptydowej o wybitnych właściwościach naczyniokurczących. Substancję tę, ze względu na jej pochodzenie, nazwano endoteliną. Ponad dwadzieścia lat później, pomimo intensywnych badań nad innymi wazoreaktywnymi związkami pochodzenia śródbłonkowego, właściwości tlenku azotu i endoteliny pozostają punktem odniesienia dla wielu badań dotyczących tonusu naczyniowego. W niniejszej pracy położono nacisk na identyfikację mechanizmów odpowiedzialnych za znoszenie endotelinozależnego skurczu naczyniowego przy udziale inhibitora cyklooksygenazy 2 celekoksybu. Strona: 12

1.1. ŚRÓDBŁONEK BUDOWA I FUNKCJE Śródbłonek jest wysoce wyspecjalizowaną wyściółką naczyń krwionośnych i limfatycznych utworzoną z pojedynczej warstwy komórek pochodzenia mezenchymalnego (nie wykazuje ekspresji większości cytokeratyn charakterystycznych dla nabłonków pochodzenia endo- lub ektodermalnego). Ta pojedyncza warstwa komórek tworzy powierzchnię szacowaną u dorosłego człowieka na ponad tysiąc metrów kwadratowych i składa się z biliona (10 12 ) komórek o łącznej masie 1-2 kilogramów [Wnuczko i Szczepański, 2007]. Wraz z błoną podstawną śródbłonek stanowi tzw. błonę wewnętrzną naczynia tworzącą barierę między krwią a mięśniówką gładką. Ze względu na wybitną aktywność biologiczną, daleko wykraczającą poza pojęcie biernej bariery, śródbłonek jest przez wielu uznawany za największy gruczoł endokrynny człowieka. Mimo tego, że śródbłonek zbudowany jest z zaledwie jednej warstwy płaskich komórek (o grubości 0,2-0,3 µm) w warunkach prawidłowych stanowi barierę bardzo szczelną i trudną do pokonania szczególnie dla składników morfotycznych krwi, o jednocześnie dynamicznie zmieniającej się i selektywnej przepuszczalności. Swoją szczelność śródbłonek zawdzięcza licznym międzykomórkowym połączeniom ścisłym oraz integrującym białkom błonowym typu kadheryn (kadheryna 5, obecnie identyfikowana jako CD 144, jest jednym z markerów śródbłonka). Błona komórkowa komórek śródbłonka obfituje również w składniki białkowe typu adhezyjnego (tzw. adresyny i selektyny) warunkujące przyleganie i selektywną przepuszczalność dla nawet tak dużych cząstek jak choćby leukocyty (np. selektyna P odpowiedzialna za migrację granulocytów obojętnochłonnych, ICAM-1, ICAM- 2, VCAM i inne) [Deanfield i wsp., 2005]. Od strony światła naczynia komórki endotelium pokryte są warstwą glikokaliksu złożonego z glikozaminoglikanów z dominacją siarczanu heparanu. Glikokaliks oprócz właściwości antyhemostatycznych nadaje ścianie naczynia ujemny ładunek elektryczny przez co odpycha inne ujemnie naładowane składniki krwi głównie albuminy i krwinki. Za aktywność enzymatyczną błony endotelialnej odpowiada obecność w niej wielu białek katalitycznych takich jak kininaza II (ACE), lipaza lipoproteinowa, ektonukleazy. Błona komórek śródbłonka obfituje również w antygeny HLA klasy I i II, czynnik tkankowy (TF, dawniej zwany tromboplastyną) i inhibitory zewnątrzpochodnego toru aktywacji krzepnięcia (TFPIs) [Feletou i Vanhoutte, 2006]. Strona: 13

W cytoplazmie komórek śródbłonka zwracają uwagę duże ilości pęcherzyków pinocytarnych (co dowodzi znacznej aktywności metabolicznej) oraz, charakterystyczne tylko dla śródbłonka, ciałka Weibel-Palade`a zawierające glikoproteinę czynnik von Willebranda oraz parakrynne substancje sygnałowe takie jak endotelina 1 [Van Mourik i wsp., 2002]. Ze względu na bogactwo enzymatyczne i receptorowe, śródbłonek jest bardzo aktywną platformą interakcji między krwią (i niesionymi przez nią substancjami sygnałowymi) a ścianą naczynia - odgrywa zasadniczą rolę w regulowaniu wazomotoryki, hemostazy i angiogenezy a także w regulacji procesów zapalnych i immunologicznych. Istotną cechą śródbłonka, dzięki której może on pełnić te funkcje, jest również szybkość z jaką jego komórki ulegają pobudzeniu i odpowiadają na bodźce. Szybka wazokonstrykcja i wazodylatacja, a co za tym idzie wpływ na ciśnienie tętnicze i ukrwienie tkanek, są zależne od szeregu substancji wydzielanych przez śródbłonek w odpowiedzi na stymulację przez siły ścierania, hipoksję, działanie acetylocholiny, bradykininy czy serotoniny. Do wazoaktywnych substancji pochodzenia śródbłonkowego należy przede wszystkim tlenek azotu, endotelina, angiotensyna II, PAF, tromboksan A 2, EDHF (śródbłonkowy czynnik hiperpolaryzujący, endothelium derived hiperpolarizing factor), VASP (fosfoproteina stymulująca wazodylatację), prostacyklina, adenozyna (produkt błonowych ektonukleaz rozkładających ATP i ADP) a nawet niektóre leukotrieny (w tym uważane za naczyniorozszerzające LTC 4 i LTD 4 ). Dzięki wydzielaniu tlenku azotu śródbłonek odpowiada również za parakrynne działanie antyoksydacyjne (ograniczanie utleniania lipoprotein o małej gęstości LDL w przestrzeni podśródbłonkowej) oraz antyproliferacyjne (hamowanie mitogenezy komórek mięśni gładkich). Dyfundująca do światła naczynia prostacyklina warunkuje działanie antyagregacyjne śródbłonka na płytki krwi [Januszewicz, 2007]. Strona: 14

Tab. 1.1 Najważniejsze substancje pochodzenia śródbłonkowego o właściwościach naczyniokurczących (EDCF, endothelium-derived contracting factor) oraz o właściwościach naczyniorozszerzających (EDRF, endothelium-derived relaxing factor) [opracowanie własne]. EDCF Endotelina 1 (ET-1) Angiotensyna II (Ang II, jako produkt śródbłonkowego ACE) Czynnik aktywujący płytki (PAF) Tromboksan A 2 (TXA 2 ) Leukotrieny (LTA 4, LTB 4 ) Prostaglandyna H (PGH 2 ) ATP, ADP (pochodzenia śródbłonkowego) EDRF Tlenek azotu (NO) Prostacyklina (PGI 2 ) Fosfoproteina stymulująca wazodylatację (VASP) EETs Śródbłonkowy czynnik hiperpolaryzujący (EDHF EETs?, K +?) Adenozyna (jako produkt śródbłonkowych ektonukleaz) Leukotrieny (LTC 4, LTD 4 ) CNP (śródbłonkowy peptyd natriuretyczny typu C) Powierzchniowe działanie antykoagulacyjne zapewnia wytwarzana przez komórki śródbłonka antytrombina III wspomagana w swoim działaniu przez glikozaminoglikany zawierające reszty heparynopodobne. Śródbłonek wytwarza także kofaktor II heparyny oraz proteazowe neksyny I i II (PN-I, PN-II). Potencjał fibrynolityczny powierzchni naczynia zapewnia wytwarzanie tkankowego aktywatora plazminogenu (t-pa) oraz innych proteaz serynowych nasilających w obecności fibryny przekształcanie plazminogenu w plazminę. W mniejszym stopniu śródbłonek odpowiada za syntezę inhibitorów fibrynolizy, do których należą inhibitory aktywatorów plazminogenu (głównie PAI-1) [Urano i wsp., 2000]. W procesach angiogenezy a przypuszczalnie również remodelingu naczyniowego istotną rolę odgrywa VEGF (naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu, vascular endothelial growth factor) oraz angiopoetyna 1 (Ang-1), dla której komórki śródbłonka stanowią cel auto-parakrynny, gdyż same posiadają adekwatny receptor kinazy tyrozynowej (Tie-2). Wykazano, że pobudzenie tego receptora przez angiopoetynę wywiera działanie antyapoptotyczne na komórki śródbłonka [Wnuczko i Szczepański, 2007]. Strona: 15

Biorąc pod uwagę różnorodność i doniosłość funkcji pełnionych przez śródbłonek (a przedstawionych powyżej w sposób wybitnie skrótowy) nie dziwi fakt, że jego uszkodzenie jest bardzo często podstawą takich procesów patofizjologicznych i chorób jak nadciśnienie, miażdżyca, zakrzepica, zaburzenia perfuzji tkanek i narządów a nawet zaburzenia odporności i nowotworzenie. Z tego też względu leczenie dysfunkcji śródbłonka stanowi bardzo obiecującą i intensywnie badaną opcję terapeutyczną w wielu schorzeniach. Strona: 16

1.2. MIĘŚNIÓWKA GŁADKA I MECHANIZMY SKURCZU NACZYNIOWEGO 1.2.1. Mięśniówka gładka Komórki mięśniowe gładkie mają kształt wrzecionowaty, w ich najgrubszej, środkowej części położone jest pojedyncze jądro komórkowe. Długość komórek mięśniówki gładkiej waha się od 15 do 500 µm, grubość wynosi kilka mikrometrów. W tętnicach typu mięśniowego komórki mięśniowe gładkie stanowią dominującą warstwę naczynia (warstwę środkową) i ściśle przylegają do siebie, w miejscach zetknięcia tworząc liczne połączenia typu neksus. Sarkolema komórki mięśniowej gładkiej tworzy w wielu miejscach wpuklenia w głąb cytoplazmy, zwane jamkami komórkowymi lub kaweolami odgrywającymi rolę w neurohormonalnej regulacji czynności mięśnia gładkiego (w kaweolach zachodzą procesy egzo- i endocytozy oraz znajdują się zakończenia aksonalne). Cytoplazma komórek mięśniowych gładkich obfituje w miofilamenty cienkie (aktynowe) i miofilamenty grube (miozynowe) z wyraźną przewagą tych pierwszych (stosunek liczby miofilamentów cienkich do grubych wynosi 15:1). W odróżnieniu od miofilamentów tkanki mięśniowej poprzecznie prążkowanej nie tworzą one strukturalnie i czynnościowo uporządkowanej struktury sarkomeru. Cechą charakterystyczną miofilamentów cienkich w komórkach mięśni gładkich jest też brak kompleksu troponin. Końce miofilamentów cienkich zakotwiczone są w taśmach gęstych, występujących pod błoną komórkową, oraz w ciałkach gęstych w głębi cytoplazmy. Podczas skurczu błona komórkowa ulega głębokim wpukleniom w miejscach występowania taśm gęstych na skutek ich pociągania przez miofilamenty [Ostrowski i wsp., 1995]. Siateczka sarkoplazmatyczna gładka, istotna dla komórek mięśniowych ze względu na rolę magazynu wapnia, stanowi od 1 do 8% objętości komórki i ulokowana jest głównie w pobliżu błony komórkowej. We wnętrzu zbiorników siateczki sarkoplazmatycznej znajdują się białka wiążące wapń reprezentowane głównie przez kalsekwestrynę [Ostrowski i wsp., 1995; Van Breemen i wsp., 1995]. Strona: 17

1.2.2. Rola wapnia w transdukcji sygnałów czynnościowych W komórkach niepobudzonych typowe stężenie cytozolowego Ca 2+ wynosi ok. 1x10-7 M/L i jest o kilka rzędów wielkości niższe od stężenia tego jonu w środowisku zewnątrzkomórkowym. Tab. 1.2 Sekwestracja jonów Ca 2+ w organizmie człowieka [wg Szadujkis-Szadurski, 2008]. Stężenie Ca 2+ w: Ca 2+ surowicy krwi (całkowite) cytoplazmie w stanie spoczynku komórki cytoplazmie w stanie aktywacji komórki retikulum endoplazmatycznym 2,1-2,6 x 10-3 M/L 1 x 10-7 M/L 1 x 10-5 M/L 1 x 10-2 - 10-3 M/L Wewnątrzkomórkowe stężenie Ca 2+ musi pozostawać małe z uwagi na obfitość estrów fosforanowych w komórce i całkowitą nierozpuszczalność powstających z nich fosforanów wapnia. W związku z tym wszystkie komórki wykształciły systemy transportu służące usunięciu z komórki Ca 2+. Dotychczas najlepiej poznano budowę i funkcjonowanie Ca 2+ - ATPazy (SERCA) i wymiennika sodowo-wapniowego (NCX). Dzięki gradientowi stężeń przejściowe otwarcie kanałów wapniowych w błonie komórkowej lub w błonach wewnątrzkomórkowych wywołuje gwałtowny wzrost cytozolowego stężenia Ca 2+ co może zostać wykorzystane do celów sygnalizacyjnych. Do chwili obecnej wyodrębniono co najmniej kilka białek kanałowych umożliwiających kontrolowany napływ Ca 2+ z przestrzeni zewnątrzkomórkowej: kanały ROC (sterowane receptorami), SOC (sterowane retikulum endoplazmatycznym), SMOC (sterowane wtórnymi przekaźnikami), VOC (typu L, N, P, Q, R, T sterowane potencjałem przezbłonowym) [Himpens i wsp., 1995; Lee i wsp., 2002]. Sekwestrację wapnia z cytozolu umożliwia siateczka śródplazmatyczna bogata w białka wiążące Ca 2+ (takie jak kalsekwestryna, endoplazmina czy kalumenina) oraz w Strona: 18

błonową Ca 2+ -ATPazę. Jednocześnie układ zbiorników siateczki śródplazmatycznej obfituje w kanały wypływowe sterowane przez receptory dla IP 3 (IP 3 R) oraz przez receptory rianodynowe (RyR, aktywowane m.in. przez ATP i kofeinę) [Karaki i wsp., 1997]. Bez wątpienia o roli Ca 2+ jako wtórnego przekaźnika, oprócz gradientu stężeń, decyduje również jego zdolność do wiązania się z białkami. Jony wapnia (w przeciwieństwie do choćby jonów magnezu) wiążą zarówno atomy tlenu naładowane ujemnie (np. boczne łańcuchy glutaminianu i asparaginianu), jak i atomy tlenu nienaładowane (np. grupy karbonylowe lub atomy tlenu bocznych łańcuchów aminokwasowych). Pozwala to na sieciowanie różnych segmentów białka i indukowanie dużych zmian konformacyjnych. Do grupy białek enzymatycznych zależnych od jonów wapnia należą m.in. troponina, kalcyneuryna, kinaza białkowa C (PKC), fosfolipaza C (PLC), miozyna, endoplazmina oraz, odgrywająca kluczową rolę w procesach wazoreaktywności, kalmodulina. Kompleks Ca 2+ -kalmodulina owija się wokół kinazy łańcucha lekkiego miozyny, przez co włącza jego aktywność enzymatyczną. Stymuluje również szeroki wachlarz innych enzymów i białek, między innymi pompę Ca 2+ -ATPazową i enos (NOS3) przez co zapobiega zjawisku przeładowania wapniem i aktywuje śródbłonkowozależne procesy wazorelaksacyjne [Hilgers i Webb, 2005]. Strona: 19

1.2.3. Mechanizmy skurczu naczyniowego Zasadniczy mechanizm skurczu komórki mięśniowej gładkiej jest podobny do mechanizmu ślizgowego działającego w mięśniach szkieletowych i polega na aktywnym przesuwaniu się względem siebie miofilamentów aktynowych i miozynowych. Ruch miofilamentów jest możliwy dzięki powstawaniu odwracalnych mostków poprzecznych między aktyną i miozyną. Ta ostatnia, mając aktywność ATPazową zapewnia uwalnianie i przekształcanie energii chemicznych wiązań ATP w energię kinetyczną wślizgiwanie się filamentów miozynowych między filamenty aktynowe. W obu rodzajach miocytów (gładkich i poprzecznie prążkowanych) mechanizm skurczowy jest indukowany przez wysokie stężenie wewnątrzkomórkowe jonów Ca 2+. Na tym jednak podobieństwa się kończą. W odróżnieniu od komórki poprzecznie prążkowanej, aktywacja skurczu komórki mięśniowej gładkiej następuje na skutek fosforylacji łańcuchów lekkich miozyny. Reakcja fosforylacji jest katalizowana przez enzym kinazę łańcuchów lekkich miozyny (MLCK), który staje się aktywny po połączeniu z kompleksem kalmodulina-ca 2+. Fosforylacja łańcuchów lekkich miozyny przez kinazę prowadzi do ich wiązania się z aktyną, rozpadu ATP i zmian konformacyjnych miozyny powodujących jej ruch wzdłuż filamentów aktynowych. Z kolei defosforylacja łańcuchów lekkich miozyny powoduje rozkurcz komórki. Nieufosforylowane łańcuchy lekkie miozyny blokują wytwarzanie mostków poprzecznych między aktyną a miozyną [Kamm i Stull, 1985; Rembold i wsp., 1988, 2004]. Co ciekawe i charakterystyczne dla mięśnia gładkiego, w układzie oczyszczonych białek kurczliwych (aktyny i miozyny) usunięcie jonów wapnia nie powoduje rozkurczu dokonana raz fosforylacja łańcuchów lekkich miozyny jest wystarczającym warunkiem trwania skurczu izometrycznego. Tłumaczy się to mechanizmem mostkowania zamkowego polegającym na tym, że w skurczu izometrycznym miofilamenty nie przesuwają się względem siebie bo cykl wytwarzania i dysocjacji mostków między miofilamentami cienkimi a grubymi jest bardzo wolny. Zjawisko takie jest charakterystyczne wyłącznie dla mięśni gładkich i umożliwia niskoenergetyczne utrzymanie właściwego tonusu mięśniowego (in vivo, w warstwie mięśniowej tętnic, miocyty muszą znajdować się w stanie stałego skurczu izometrycznego aby przeciwstawiać się ciśnieniu krwi) [Dillon i wsp., 1981]. W komórkach mięśniowych gładkich zidentyfikowano też dodatkowy mechanizm regulujący powstawanie mostków między miofilamentami miozynowymi a aktynowymi, oparty na właściwościach białka kaldesmonu, który przy niskich stężeniach wapnia wiąże Strona: 20

się z aktyną utrudniając jej interakcje z miozyną. Kaldesmon związany z kalmoduliną i Ca 2+ traci powinowactwo do aktyny odsłaniając miejsca wiążące miozynę. Mechanizm ten częściowo uniezależnia rozkurcz naczyniowy od defosforylacji łańcuchów lekkich miozyny. Innym białkiem regulującym interakcje filamentów aktynowych i miozynowych jest kalponina, mająca powinowactwo i ograniczająca funkcję wielu białek wiążących wapń (w tym kompleksu Ca 2+ -CaM). Fosforylacja kaldesmonu i kalponiny zmniejsza ich aktywność i, jak się obecnie uważa, pozostaje głównie pod kontrolą szlaku Ras-Raf-MAPK [Hilgers i Webb, 2005]. Ryc. 1.2.3 Mechanizmy regulacji stężenia i wpływu wapnia na napięcie komórki mięśnia gładkiego (opisy skrótów w tekście) [opracowanie własne]. Strona: 21

1.2.4. Sterowanie skurczem mięśniówki gładkiej Jak wyjaśniono powyżej, napięcie mięśniówki gładkiej zależy od stężenia jonów wapnia w cytoplazmie i wrażliwości na wapń elementów kurczliwych. Napięcie spoczynkowe jest sumą tzw. napięcia neurogennego, powstającego w wyniku stałej stymulacji przez autonomiczny układ nerwowy (głównie noradrenalinę, NA) i tzw. napięcia biogennego, wynikającego z procesów samoistnej depolaryzacji. Wzrost napięcia spoczynkowego zachodzi pod wpływem rozciągnięcia błony komórkowej (napływ Ca 2+ z zewnątrz), bramkowania kanałów Ca 2+ (sterowanie chemiczne i elektryczne) oraz uwalniania wapnia z siateczki śródplazmatycznej. Działanie większości poznanych substancji naczyniokurczących (np. angiotensyny, endoteliny, serotoniny), czynników fizycznych (np. spadek po 2 w wyniku niedotlenienia) jak i mechanicznych (rozciąganie ściany naczynia) oraz elektrycznych (rozprzestrzeniająca się depolaryzacja) polega na wywoływaniu procesów desekwestracji wapniowej (wzrost cytozolowego stężenia Ca 2+ ) i / lub sensytyzacji wapniowej (uwrażliwienie na Ca 2+ ) [Sanders, 2008]. W małych naczyniach powstawanie skurczu jest zależne od jonów wapnia pochodzących ze środowiska zewnętrznego komórki. W procesie tzw. sprzężenia elektromechanicznego depolaryzacja błony komórkowej z -70 do -50 mv nasila napływ Ca 2+ przez kanały bramkowane potencjałem (VOC) co prowadzi do zwiększenia jego stężenia w komórce i wyzwala skurcz. W naczyniach dużych i średniego kalibru większą rolę odgrywa sprzężenie farmakomechaniczne. W tym przypadku do desekwestracji wapnia prowadzi otwieranie przez ligandy kanałów typu ROC znajdujących się w błonie komórkowej oraz otwieranie kanałów znajdujących się w błonie siateczki śródplazmatycznej sterowanych IP 3 i ryanodynowych. Uważa się, że bramkowanie kanałów w błonie komórkowej odpowiada za skurcz powolny lecz przedłużony, zaś otwieranie kanałów w siateczce śródplazmatycznej za skurcz szybki lub szybką fazę skurczu przedłużonego [Koledova i Khalil, 2006; House i wsp., 2008]. Proces sprzężenia farmakomechanicznego można podzielić na dwa etapy etap receptorowy polegający na aktywacji receptora przez ligand i etap pozareceptorowy zależny od przekaźników II rzędu i kaskad enzymatycznych uruchomionych przez aktywowany receptor. Za etap receptorowy sprzężenia farmakomechanicznego w mechanizmie skurczu naczyniowego odpowiadają takie substancje jak aminy katecholowe, angiotensyna II, Strona: 22

serotonina, ATP, endotelina 1 i wiele innych endo- i parakrynnych substancji o właściwościach naczyniokurczących. Etap pozareceptorowy zaczyna się od odłączenia podjednostek α-gtp białek G q aktywowanego receptora. Podjednostki te poprzez fosforylację stymulują fosfolipazę C do przetwarzania fosfatydyloinozytolu (PIP 2 ) w inozynotrójfosforan (IP 3 ) i diacyloglicerol (DAG). IP 3 dyfunduje do cytoplazmy i aktywuje receptory IP 3 R zwiększając wypływ Ca 2+ z siateczki śródplazmatycznej. DAG z kolei aktywuje kinazę białkową C (PKC) i łączy mechanizmy desekwestracji wapniowej z sensytyzacją wapniową - poznano przynajmniej kilka PKC zależnych białek, których działanie sprowadza się do zmian aktywności łańcuchów lekkich miozyny, głównie poprzez wpływ na kinazę i fosfatazę tych łańcuchów. Na przykład CPI-17 białko o hamujących właściwościach w stosunku do MLCP jest aktywowane przez PKC i Rho-kinazę (ROK). Również bezpośrednia fosforylacja MLCP przez Rho-kinazę powoduje tysiąckrotny wzrost hamujących właściwości CPI-17 na MLCP. Kilka innych, pobudzanych przez PKC, kinaz jak kinaza związana z integryną (ILK) czy kinaza białkowa p21 (PAKp21) ma również zdolność fosforylacyjnego inaktywowania MLCP [Allahdadi i wsp., 2006]. Ze względu na odkrycie szeregu substancji blokujących Rho-kinazę wydaję się ona jednak wyjątkowo atrakcyjnym celem w dążeniach do zmniejszania patologicznego skurczu naczyniowego. Strona: 23

Ryc. 1.2.4 Mechanizmy aktywacji skurczu komórki mięśnia gładkiego (opis skrótów w tekście) [opracowanie własne]. Strona: 24

1.2.5. Mechanizmy i sterowanie rozkurczem naczyniowym Jak wyjaśniono powyżej mechanizmy rozkurczu mięśniówki gładkiej są jedynie w małym stopniu zależne od spadku stężenia jonów wapniowych. O ile jednak w układach wyizolowanych miofilamentów samo usunięcie Ca 2+ nie gwarantuje szybkiego rozkurczu, to w układach komórkowych lub tkankowych niewątpliwie ułatwia zdobycie przewagi mechanizmom rozkurczowym. Tak więc sekwestracja wapniowa i desensytyzacja wapniowa odgrywają kluczową rolę w rozkurczu mięśniówki gładkiej. Do spadku stężenia cytozolowego Ca 2+ dochodzi wskutek gromadzenia Ca 2+ w retikulum endoplazmatycznym i wyrzucania Ca 2+ przez pompy błonowe i wymiennik 3Na + /Ca 2+ (NCX). Gromadzenie Ca 2+ w siateczce śródplazmatycznej zapewnia Ca 2+ -ATPaza (SERCA) hamowana przez fosfolamban. Jego dysocjacja lub PKA zależna fosforylacja (np. pod wpływem stymulacji β adrenergicznej) wybitnie zwiększa wydajność pompy [Feil i wsp., 2003; Dimopoulos i wsp., 2007]. Procesy desensytyzacji wapniowej są natomiast związane ze wzrostem stężenia w komórkach mięśni gładkich cyklicznego adenozynomonofosforanu (camp) i cyklicznego guanozynomonofosforanu (cgmp). Cykliczny AMP jest produkowany z ATP przez cyklazę adenylanową (AC) białko enzymatyczne wewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Aktywacja cyklazy adenylanowej, a co za tym idzie wzrost stężenia camp, zachodzi pod wpływem wielu czynników hormonalnych i neuromediatorowych oddziałujących na receptory uwalniające białka G αs (β 2 agoniści, histamina poprzez receptor H 2, prostacyklina, prostaglandyna D 2, prostaglandyna E 2, VIP, L-Arginina). Do hamowania cyklazy adenylanowej i spadku stężenia camp prowadzą czynniki oddziałujące na receptory uwalniające białka G αi (acetylocholina, NPY). Cykliczny AMP pełni więc funkcje przekaźnika II rzędu nie tylko w procesach wazoreaktywności [Koledova i Khalil, 2006; Ding i wsp., 2009]. U ludzi działanie camp polega na aktywacji kinazy proteinowej A (PKA) tetramerycznego białka, w którym wiązanie camp w obrębie 2 domen regulatorowych odsłania i aktywuje 2 domeny katalityczne. Domeny te są z kolei odpowiedzialne za transfer pirofosforanu z ATP na reszty serynowe lub treoninowe kontrolowanych przez PKA białek, do których należy wiele białek kanałowych, enzymatycznych a nawet transkrypcyjnych. Do białek kontrolowanych przez PKA należy również kinaza łańcuchów lekkich miozyny (MLCK). Fosforylacja MLCK przez PKA zachodzi w miejscu wiążącym kompleks Ca 2+ - Strona: 25

kalmodulina i zmniejsza powinowactwo MLCK do tego kompleksu. Hamuje to aktywność MLCK i prowadzi do rozkurczu. Mechanizm ten został dość dokładnie zbadany również w doświadczeniach in vivo stymulowanie β-adrenoreceptorów, bezpośrednie aktywowanie cyklazy adenylanowej przez forskolinę jak i hamowanie PDE4 prowadziło do zwiększenia stężenia wewnątrzkomórkowego camp, aktywowania PKA, fosforylacji MLCK i rozkurczu mięśni gładkich tchawicy [Nejman-Gryz i wsp., 2006]. Analogicznie do camp, cykliczny guanozynomonofosforan (cgmp) jest syntetyzowany przez cyklazę guanozynomonofosforanową (GC) z guanozynotrójfosforanu (GTP). W komórkach ssaków spotyka się co najmniej dwie formy tego enzymu cyklazę guanozynomonofosforanową związaną z błonami komórkowymi (mgc), aktywowaną przez hormony peptydowe takie jak np. natriuretyczny peptyd przedsionkowy (ANP) czy bradykinina (działająca przez receptor B 2 ), oraz cyklazę guanozynomonofosforanową rozpuszczalną (występującą w cytozolu, sgc) aktywowaną przez tlenek azotu (NO). Cykliczny GMP wywiera swoje działanie poprzez bramkowanie niektórych białek kanałowych (np. SMOC czy też kanałów sodowych w czopkach i pręcikach regulujących procesy widzenia) oraz aktywacje kilku kinaz białkowych wśród których najlepiej poznano znaczenie kinazy białkowej G (PKG) [Costa i wsp., 2005]. PKG jest bardzo starą filogenetycznie kinazą serynowo-treoninową występującą w różnych izoformach już u jednokomórkowców. U ssaków wyróżniono PKG-I występującą w cytoplazmie oraz PKG-II związaną z błoną komórkową i niewystępującą w mięśniówce gładkiej. Obydwie formy mają budowę dimeryczną z centrami katalitycznymi odsłanianymi przez przyłączenie cgmp do domeny regulatorowej [Pfeifer i wsp., 1999]. PKG podobnie jak PKA fosforyluje kinazę łańcuchów lekkich miozyny prowadząc do miorelaksacji. Rola PKG w procesach wazodylatacji wybiega jednak daleko poza fosforylację MLCK. Udowodniono, że PKG pobudza Ca 2+ zależne kanały potasowe, w wyniku czego dochodzi do hiperpolaryzacji błony komórkowej a tym samym do zamknięcia napięciozależnych kanałów wapniowych (ochrona przed przeładowaniem wapniem). PKG również bezpośrednio hamuje kanały VOC oraz (podobnie jak PKA) wpływa na przesunięcie wapnia z cytoplazmy do siateczki śródplazmatycznej poprzez fosforylację fosfolambanu (PLB) co prowadzi do aktywacji SERCA [Feil i wsp., 2003]. Zaobserwowano też, że skurcz wyidukowany egzogennym białkiem Rho-A zostaje zahamowany przez egzogenną PKG-I aktywowaną 8- Br-cGMP [Murthy i wsp., 2003]. Poza tym PKA wraz z PKG fosforylują dwa białka Strona: 26

zaangażowane w regulację skurczu mięśni gładkich VASP i białko szoku cieplnego Hsp20 [Lincoln i wsp., 2001]. Ryc. 1.2.5 Mechanizmy aktywacji rozkurczu komórki mięśnia gładkiego (opisy skrótów w tekście) [opracowanie własne]. Strona: 27

1.2.6. Fosfodiesterazy Fosfodiesterazy (PDEs) zostały po raz pierwszy wyizolowane z mózgu szczurów przez Uzunova i Weissa w 1972 roku. Już 5 lat później rozpoczęto stosowanie inhibitorów fosfodiesteraz jako środków leczniczych. Fosfodiesterazy są ważnymi enzymami (hydrolazami) w procesach wazoreaktywności, gdyż rozkładają cykliczne mononukleotydy (camp i cgmp) do 5`nukleotydomonofosforanów redukując sygnały przekazywane przez te przekaźniki II rzędu. Pojęcie fosfodiesterazy w szerokim znaczeniu definiuje enzym rozkładający wiązanie fosfodiestrowe. Stąd do fosfodiesteraz można zaliczyć wiele rodzin enzymów, wśród nich fosfolipazy C i D oraz DNAzy i RNAzy. Mając na myśli rozkład camp i cgmp powinno się więc używać określenia cyklofosfodiesteraza, co zwyczajowo jest rzadko praktykowane [Essayan, 2001]. Do chwili obecnej u ssaków opisano 11 typów fosfodiesteraz (PDE1 PDE11) różniących się między sobą specyficznością substratową i wrażliwością w stosunku do inhibitorów. PDE1, 2, 3, 10 i 11 hydrolizują wiązania fosfodiestrowe camp i cgmp; PDE4, 7, 8 rozkładają preferencyjnie camp a PDE5, 6 i 9 cgmp [Wallis i wsp., 1999; Rybalkin i wsp., 2003; Bender i Beavo, 2006; Butt i wsp., 2010]. Ryc. 1.2.6 Specyficzność substratowa fosfodiesteraz ludzkich [opracowanie własne]. Strona: 28

PDE3 jest określana jako fosfodiesteraza hamowana przez cgmp, gdyż w jego obecności traci zdolność do hydrolizy camp [Wallis i wsp., 1999]. Ciekawą zależność aktywności hydrolazowej od obecności cgmp zaobserwowano również w przypadku PDE2. Fosfodiesteraza ta, chociaż może rozkładać obydwa cykliczne mononukleotydy, w obecności cgmp zwiększa selektywność działania w kierunku camp, zmniejszając swoją aktywność w stosunku do cgmp. Zjawisko to nazwano krzyżową regulacją rozkładu camp i cgmp [Bender i Beavo, 2006]. PDE4 jest głównym enzymem rozkładającym camp (również w komórkach śródbłonka). Ze względu na rolę camp jako II przekaźnika we wszystkich komórkach inhibitory PDE4 rozpatrywano jako potencjalnie przydatne leki przeciwzapalne (w leczeniu astmy oskrzelowej, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc, alergicznym nieżycie błony śluzowej nosa i zatok), przeciwdepresyjne, przeciwpsychotyczne, przeciwotępienne a nawet przeciwnowotworowe [Nejman-Gryz i wsp., 2006; De Visser i wsp., 2008; Deree i wsp., 2008]. Również wiele innych inhibitorów fosfodiesteraz znalazło zastosowanie w związku z przedłużaniem i / lub potęgowaniem szlaków zależnych od camp i cgmp. Przykłady inhibitorów PDE wraz z ich specyfikacją substratową zebrano w tabeli poniżej. Wiele z tych związków jest już powszechnie wykorzystywanych jako substancje terapeutyczne. Strona: 29

Tab. 1.2.6 Inhibitory fosfodiesteraz ludzkich [zebrano z piśmiennictwa]. Nieselektywne PDE 1 PDE 2 PDE 3 PDE 4 PDE 5 PDE 6 PDE 7 Pochodne metyloksantyn: kofeina, aminofilina, pentoksyfilina, teobromina, teofilina, IBMX (3-izobutylo-1-metyloksantyna) Winpocetyna Anagrelid Milrinon, enoximon, anagrelid, amrinon, bukladezyna, cilostamid, cilostazol, quazinon, siguazodan, trequinsin, zardaweryna Rolipram, mesembryna, ibudilast, piclamilast, roflumilast, cilomilast, filamilast, drotaweryna, luteolina Sildenafil, tadalafil, wardenafil, udenafil, avanafil, mirodenafil, acetildenafil, lodenafil, dipyridamol, celekoksyb, waldekoksyb Zaprinast BRL-50481 PDE 9 BAY 73-6691 PDE 10 Papaweryna, tofisopam Strona: 30

1.2.7. Tlenek azotu (NO) Tlenek azotu (NO) zasługuje na oddzielną wzmiankę, gdyż jest bardzo ważną cząsteczką sygnalizacyjną w interakcjach między śródbłonkiem a mięśniówką gładką naczyń. NO pełni funkcję molekuły sygnałowej (mediującej między innymi rozkurcz naczyń) kiedy jest wytwarzany w małych stężeniach przez konstytutywną izoformę syntazy tlenku azotu w komórkach śródbłonka naczyń (enos, inaczej NOS3) lub w neuronach (nnos, inaczej NOS1). Może też pełnić funkcję źródła wysoce toksycznych oksydantów używanych do niszczenia mikroorganizmów, gdy produkowany jest w wysokich stężeniach przez indukowalną NOS w makrofagach (inos, inaczej NOS2) [Suschek i wsp., 2004]. Powstawanie NO w komórkach śródbłonkowych zachodzi w odpowiedzi na działanie agonistów rozszerzających naczynia, takich jak acetylocholina, histamina czy bradykinina. Receptorowe oddziaływanie tych związków prowadzi do wzrostu stężenia w komórce epitelialnej przekaźnika II rzędu Ca 2+. Ca 2+ działając w kompleksie z kalmoduliną aktywuje enos co przekłada się na wzrost wytwarzania tlenku azotu (związanie kalmoduliny działa jak "molekularny przełącznik", umożliwiając przepływ elektronów z reszty flawinowej grupy prostetycznej na domenę reduktazową połączoną z hemem). W przypadku inos (NOS2), kalmodulina pozostaje ściśle związana z domeną wiążącą białka nawet przy niskich śródkomórkowych stężeniach Ca 2+, będąc w zasadzie podjednostką tego izoenzymu [Bauer i Sotníková, 2010]. Produkcja NO przez aktywowaną enos jest procesem bardzo wydajnym, ograniczanym przez dostępność substratu L-argininy. Występuje ona jednak w komórkach śródbłonka w nadmiarze, toteż de facto o tempie syntezy NO decyduje aktywność NOS a nie dostępność substratu [Schmidt i wsp., 1993]. Wykazano ujemne sprzężenie zwrotne między aktywnością NOS3 a stężeniem NO. NO odwracalnie hamuje aktywność enos, reagując z resztami aminokwasowymi białka z utworzeniem grupy S-nitrozowej. Wydaje się, że proces ten może być regulowany przez stan oksydoredukcyjny komórki, co tłumaczy związek dysfunkcji śródbłonka ze stresem oksydacyjnym. Wykazano, że NOS1 i NOS2 również podlegają S-nitrozylacji ale nie dowiedziono dynamicznej regulacji ich funkcji enzymatycznej tą drogą [Hess i wsp., 2005]. Strona: 31

L-arginina + NADPH + O 2 N-hydroksy-L-arginina L-cytrulina + NADP + H 2 O + NO Ryc. 1.2.7 Synteza NO z L-argininy przy udziale NOS [wg Grześk i wsp., 2011]. Wytworzony z udziałem enos tlenek azotu dyfunduje ze śródbłonka do warstwy mięśni gładkich prowadząc do ich rozkurczu przez aktywację zależnej od NO cyklazy guanylanowej (sgc). Aktywacja cyklazy guanylowej przez tlenek azotu obejmuje jego wiązanie do grupy hemowej enzymu co prowadzi do około dwustukrotnego wzrostu przetwarzania GTP do cgmp [Friebe i Koesling, 2003]. Poprzez cgmp i PKG tlenek azotu reguluje nie tylko wazoreaktywność ale również wzrost, proliferację, migrację i apoptozę komórek ściany naczynia [Padayatti i wsp., 2004]. Niedawno odkryto alternatywną drogę działania NO, polegającą na utlenianiu tlenku azotu do azotynu oraz reakcji NO z grupami tiolowymi glutationu. Powstające nitraty i nitrozoglutation mają podobne właściwości do NO, dodatkowo hamując agregację płytek krwi [Kim-Skapiro i wsp., 2006]. Strona: 32

1.3. NACZYNIOWY UKŁAD ENDOTELINOWY Endoteliny zidentyfikowano w 1988 roku jako peptydy posiadające silne właściwości naczyniokurczące. Obecnie do rodziny endotelin zalicza się cztery 21-aminokwasowe peptydy (nazwane ET-1, ET-2, ET-3, ET-4) oraz liczne 31-aminokwasowe izoformy, których znaczenie, jak i przynależność nozologiczna są dopiero dyskutowane. Sekwencja peptydowa endotelin jest podobna do sarafotoksyny jadu gleboryjcowatych węży z Afryki i Bliskiego Wschodu [Abaham i Dashwood, 2008]. Główną i najlepiej poznaną pod względem funkcjonalnym endoteliną jest ET-1 wytwarzana i uwalniana przez śródbłonek naczyniowy, w sposób parakrynny regulująca opór naczyniowy oraz wzrost i proliferację komórek mięśniówki gładkiej. ET-1 wytwarzana jest również przez komórki nabłonka oddechowego, makrofagi, fibroblasty, kardiomiocyty i neurony [Granger, 2003; Hynynen i Khalil, 2006]. Jednak największe stężenie tkankowe ET- 1 stwierdzono w nerkach - może być ona wytwarzana przez komórki cewek, podocyty jak i komórki mezangium [Ahn i wsp., 2004; Boesen i Pollock, 2010]. Tab. 1.3.1 Ekspresja i wydzielanie endotelin [wg Ahn i wsp., 2004; Hynynen i Khalil, 2006; Boesen i Pollock, 2010]. ET-1 ET-2 ET-3 ET-4 Śródbłonek naczyń krwionośnych, nabłonek dróg oddechowych, makrofagi, fibroblasty, kardiomiocyty, neurony, podocyty, komórki mezangium. Komórki epitelialne przewodu pokarmowego. Komórki epitelialne przewodu pokarmowego, neurony OUN, komórki nabłonkowe cewek nerkowych. Komórki błony śluzowej jelit, komórki nabłonkowe płuc i nerek. Strona: 33

Synteza endotelin zaczyna się od transkrypcji genu dla 203-aminokwasowej preproendoteliny (preproet), która jest następnie cięta przez furynopodobne endopeptydazy na 37 41 aminokwasowe fragmenty zwane dużymi endotelinami (big ET-1, big ET-2, big ET-3 i big ET-4). Big ETs są rozszczepiane przez metaloproteinazy zawierające cynk enzymy konwertujące endotelinę (odpowiednio: ECE-1, ECE-2, ECE-3, ECE-4). Endoteliny mogą powstawać również z udziałem innych, mniej specyficznych metaloproteinaz oraz przede wszystkim przy udziale chymazy ten szlak syntezy ET-1 musi odgrywać niemałe znaczenie, gdyż myszy pozbawione genu ECE1 i ECE2 zachowują zdolność wytwarzania znacznych ilości ET-1[Kirkby i wsp., 2008]. ECE-1 jest znajdowany nie tylko w śródbłonku ale i w wielu różnych tkankach, zarówno jako enzym cytoplazmatyczny jak i umiejscowiony w błonie komórkowej [Masaki, 2004]. Tab. 1.3.2 Lokalizacja i specyficzność substratowa enzymów konwertujących endotelinę [wg Masaki, 2004; Hynynen i Khalil, 2006; Kirkby i wsp., 2008]. ECE-1 ECE-2 ECE-3 ECE-4 Zlokalizowany wewnątrzkomórkowo jak i na powierzchni błony komórkowej, preferencyjnie konwertujący big ET-1. Zlokalizowany wewnątrzkomórkowo, preferencyjnie konwertujący big ET-1 ale również big ET-2 i big ET-3. Konwertujący big ET-3 (ET- 1, ET-2 -?). Konwertujący big ET-4 (inne big ETs -?). Układ endotelinowy regulowany jest na poziomie syntezy, magazynowania i uwalniania. Uważa się, że regulacja na poziomie syntezy odgrywa największą rolę, szczególnie na etapie transkrypcji stężenie ET-1 mrna zwiększa się pod wpływem angiotensyny II, noradrenaliny, wazopresyny, TNFα, TGFβ, wielu interleukin, hipokapnii a zmniejsza się pod wpływem hipoksji, NO, PGI 2, ANP [Barnes i wsp., 1998]. ET-1 jest uwalniana przez śródbłonek w sposób konstytutywny zależny od intensywności procesów transkrypcji preproet, oraz w sposób gwałtowny jako wynik egzocytozy zawartości ciałek Weibel-Palade`a, które przypuszczalnie służą za magazyn dla Strona: 34

ET-1. Pobudzenie komórek śródbłonka powoduje przemieszczanie się tych ciałek w kierunku błony komórkowej i uwalnianie ET-1 na zasadzie egzocytozy [Russell i Davenport, 1999; Van Mourik i wsp., 2002]. U ludzi w surowicy krwi ET-1 osiąga niewielkie acz mierzalne stężenie 0,7 5,0 pg/ml (2,809x10-13 2,006x10-12 M/L) [Predel i wsp., 1990; Shichiri i wsp., 1990]. Badania porównawcze stężenia osoczowego ET-1 ze stężeniem tkankowym (w aorcie) wykonywano u zdrowych szczurów stężenia zmierzone w surowicy (między 0,7 a 4,9 fm/ml) były wielokrotnie niższe od zmierzonych w tkance (ok. 120 pg/g tkanki) [Zhao i wsp., 2000; Abdel-Sayed i wsp., 2003]. Niskie surowicze stężenie endoteliny może być spowodowane gwałtownie przebiegającymi procesami eliminacji, najprawdopodobniej zależnymi od nerkowych endopeptydaz (NEP). Przyjmuje się, że również śródbłonkowe receptory dla endoteliny pełnią funkcje oczyszczające [Kędzierski, 2001]. Za duży całkowity klirens ET- 1 odpowiadają głównie płuca, nerki i wątroba. W płucach i wątrobie głównym mechanizmem jest internalizacja kompleksu receptora ET B (ET A ) i ET-1, w nerkach rozkład przez obojętną endopeptydazę (najprawdopodobniej najbardziej aktywną w kanalikach proksymalnych) [Boesen i Pollock, 2010]. Do tej pory zidentyfikowano 3 receptory dla endoteliny: ET A, ET B, ET C. ET A i ET B są szeroko rozpowszechnione w różnych tkankach, kodowane w genach na chromosomie 4 i 13. Receptory ET B dzielone są nieraz na podtypy ET B1 i ET B2, choć niektórzy uważają, że podział ten nie ma molekularnych podstaw. Wiedza na temat receptora ET C jest jak dotychczas bardzo ograniczona [Kuc i Davenport, 2004; Bkaily i wsp., 2011]. Receptory ET A stwierdzono na komórkach mięśni gładkich praktycznie wszystkich naczyń krwionośnych a także dróg oddechowych, poza tym na kardiomiocytach, hepatocytach, neuronach, osteoblastach, melanocytach, keratynocytach, adipocytach, różnych komórkach układu rozrodczego. Receptor ET B został zidentyfikowany na śródbłonku oraz mięśniówce gładkiej naczyń krwionośnych, neuronach ośrodkowego układu nerwowego, kardiomiocytach i układzie bodźcoprzewodzącym serca, mięśniówce gładkiej dróg oddechowych, hepatocytach, osteoblastach, neuronach, różnych gruczołach endokrynnych przy czym łączne występowanie obydwu podtypów receptora dla ET-1 jest szeroko rozpowszechnione. Co ciekawe - obydwa receptory występują nie tylko na powierzchni komórek ale również w cytoplazmie i nukleoplazmie. Czy mają tu jednak znaczenie czynnościowe nie jest jasne [Bkaily i wsp., 2003; Bkaily i wsp., 2011]. Strona: 35

ET A i ET B wiążą ET-1 z jednakowym powinowactwem, ET-3 łączy się ze stukrotnie większym powinowactwem z ET B niż ET A. Na komórkach śródbłonka występują w przewadze receptory ET B, na komórkach mięśniówki gładkiej naczyń przeważają receptory ET A, przy czym zaobserwowano, że stosunek ET A /ET B rośnie wraz ze wzrostem średnicy naczynia [Schiffrin, 1995]. Udowodniono też wzrost gęstości receptorów ET A w błonach komórkowych mięśni gładkich pod wpływem insuliny i NO. Ilość receptorów ET B na powierzchni komórek śródbłonka zwiększa się pod wpływem TNFα i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF - fibroblast growth factor) [Iwasa i wsp., 2010]. Receptor ET A jest związany funkcjonalnie z białkiem G αq. Aktywacja receptora prowadzi do zwiększenia aktywności fosfolipazy C (PLC), która z kolei rozkłada fosfatydyloinozytol (PIP 2 ) do inozynotrójfosforanu (IP 3 ) i diacyloglicerolu (DAG). IP 3 poprzez receptor zlokalizowany na siateczce śródplazmatycznej uwalnia z niej do cytozolu zapasy wapnia. Połączenie jonów wapnia z kalmoduliną wywołuje skurcz w następstwie fosforylacji łańcuchów lekkich miozyny. DAG natomiast stymuluje w błonie komórkowej aktywność kinazy białkowej C (PKC) odpowiedzialnej za włączenie do szlaku sygnalizacyjnego nadrodziny białek Ras, do której należy między innymi białko RhoA. RhoA poprzez Rho-kinazę (ROK) hamuje aktywność fosfatazy łańcuchów lekkich miozyny co uwrażliwia aparat kurczliwy komórki mięśnia gładkiego na Ca 2+ i podtrzymuje skurcz. Oczywiście włączenie kaskady Ras-Raf-MAPK wiąże się również z modulacją transkrypcji w jądrze komórkowym. Prowadzi to do nasilenia procesów wzrostu i proliferacji komórek mięśnia gładkiego obok skurczu wywołanego wzrostem stężenia jonów wapnia w cytozolu i uwrażliwieniem na wapń [Barman, 2007]. W mechanizmach efektorowych związanych z pobudzeniem receptora ET A zakłada się również możliwość oddziaływania poprzez zwiększenie przepuszczalności błonowych kanałów wapniowych, aktywację fosfolipazy D przez DAG, aktywację białka G αi, aktywację fosfolipazy A 2 przez wzrost uwalniania kwasu arachidonowego, aktywację kinaz tyrozynowych rodziny src, aktywację JNK (c-jun-nh2- terminal kinase) [Cain i wsp., 2002; Daou i Srivastava, 2004; Bouallegue i wsp., 2007]. Pobudzenie śródbłonkowego receptora ET B(1) aktywuje natomiast szlaki sygnałowe prowadzące do uwalniania przez śródbłonek czynników wazorelaksacyjnych NO, prostacykliny i EDHF [D Orleans-Juste i wsp., 2002]. Choć ten ostatni nie został do tej pory jednoznacznie chemicznie zidentyfikowany - najczęściej zakłada się, że jego rolę pełnią metabolity cytochromu P-450 (kwasy epoksyeikozatrienowe, EETs), jony potasu lub specyficzne nadtlenki (jak choćby nadtlenek wodoru - H 2 O 2 ). Strona: 36