QUANTA Lite Gliadin IgA II 704525 Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite TM IgA II gliadyny jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał IgA gliadyny w surowicy człowieka. Obecność przeciwciał gliadyny może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi badaniami laboratoryjnymi w celu pomocy w diagnostyce celiakii. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Celiakia lub enteropatia związana z nadwrażliwością na gluten to choroba przewlekła, której główne cechy obejmują stan zapalny i charakterystyczne histologiczne spłaszczenie błony śluzowej przewodu pokarmowego, którego skutkiem jest zespół złego wchłaniania. Dokładna etiologia choroby pozostaje nieznana, ale gliadyna lub rozpuszczalna w alkoholu frakcja glutenu pszennego jest zdecydowanie czynnikiem toksycznym. 1 Początkowo, w celu zdiagnozowania celiakii i zaburzeń pokrewnych wykonywano szereg wielokrotnych biopsji jelitowych. Ostatnio zasugerowano wykonywanie badań serologicznych jako badań przesiewowych wykonywanych u pacjentów z podejrzeniem enteropatii wrażliwej na gluten, jak również do monitorowania przestrzegania diety. 2-5 Europejskie Towarzystwo Gastroenterologii Pediatrycznej (European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN)) w celu zmniejszenia liczby biopsji jelita potrzebnych do postawienia rozpoznania zaleciło stosowanie markerów serologicznych, takich jak gliadyna, jak również przeciwciał przeciwko retikulinie (białko tkanki łącznej układu chłonnego) i śródmięsnej (endomysium). 6 Ostatnie prace wykazały, że przeciwciała wchodzące w reakcję z gliadyną u pacjentów z celiakią wiążą się z bardzo ograniczoną liczbą konkretnych determinant antygenowych na cząsteczce gliadyny. 7,8 Te same badania wykazały ponadto, że deamidacja gliadyny przez transglutaminazę tkankową - enzym powiązany z celiakią - skutkuje zwiększonym wiązaniem przez przeciwciała przeciw gliadynie. W oparciu o powyższe obserwacje wykazano, że testy wykorzystujące deamidowane i zdefiniowane peptydy są dokładniejsze w wykrywaniu celiakii, niż standardowe testy wykrywające przeciwciała przeciw gliadynie. 9 U pacjentów cierpiących na enteropatię związaną z nadwrażliwością na gluten w surowicy wykrywane są zarówno przeciwciała IgA jak i IgG. 2,3 Wydaje się, że przeciwciała IgG przeciw gliadynie są bardziej wrażliwymi, lecz również mniej swoistymi markerami choroby niż przeciwciała klasy IgA. Przeciwciała IgA gliadyny są mniej wrażliwe, ale bardziej swoiste. Strategia stosowania czułych testów przesiewowych w populacji o podwyższonym ryzyku obejmuje badania zarówno w kierunku obecności przeciwciał IgG i IgA gliadyny, jako że znaczna część pacjentów z celiakią to chorzy z niedoborem IgA. 10 Przeciwciała IgA gliadyny są ważne w ocenie aktywności choroby w czasie oraz w celu monitorowania skuteczności stosowania diety bezglutenowej. 5 Zasada badania Oczyszczone peptydy gliadyny są wiązane z dołkami polistyrenowej płytki z mikrodołkami w warunkach, które pozwalają na zachowanie antygenu w stanie natywnym. Uprzednio wstępnie rozcieńczone kontrole i rozcieńczone surowice pacjenta są dodawane do oddzielnych dołków, dzięki czemu wszelkie przeciwciała IgA gliadyny wiążą się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgA. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgA znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgA znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków kontrolnych. Odczynniki 1. Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem peptydów gliadyny (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Ujemna kontrola ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał przeciwko IgA gliadyny, wstępnie rozcieńczona, 1,2ml 3. Słabo dodatnie IgA gliadyny ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy przeciwko IgA gliadyny wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 4. Wysoko dodatnie IgA gliadyny ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i ludzkie przeciwciała w surowicy przeciwko IgA gliadyny wstępnie rozcieńczone, 1,2 ml 5. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 6. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 7. Koniugat HRP IgA, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgA, 1 fiolka zabarwienie żółte, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 8. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 9. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka bezbarwny, 10 ml 1
Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Dlatego słabo dodatnie IgA II gliadyny ELISA, wysoko dodatnie IgA II gliadyny ELISA oraz ujemna kontrola ELISA powinny być traktowane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny. 11 3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/ dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Przechowywać wszystkie odczynniki zestawu w temperaturze 2-8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. 2
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A3 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeżeli badanie nie zostanie przeprowadzone w ciągu 8 godzin, próbki należy umieścić w lodówce, w temperaturze 2 8 C. 3) Jeżeli badanie nie zostanie przeprowadzone w ciągu 48 godzin lub próbka ma zostać wysłana, należy ją zamrozić w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 płytka z mikrodołkami IgA II gliadyny ELISA (12-1 x 8 dołków), wraz z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo dodatniej IgA gliadyny ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej wysoko dodatniej IgA II gliadyny ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu przeciwciała IgA HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgA 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, 200 300 i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo dodatniego IgA II gliadyny ELISA, wysoko dodatniego IgA II gliadyny ELISA oraz ujemnej kontroli ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał IgA gliadyny lub braku IgA gliadyny stosując jednostki umowne wymaga dwóch dołków dla każdego z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Dodać do dołków 100 µl wstępnie rozcieńczonego słabo dodatniej IgA II gliadyny ELISA, wysoko dodatniej IgA II gliadyny ELISA, ujemną kontrolę ELISA i rozcieńczone próbki pacjenta. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 3. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać 200 300 µl rozcieńczonego buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 4. Do każdego dołka dodać 100 µl koniugatu IgA HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie 2. 5. Etap płukania: Powtórzyć etap 3. 6. Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 7. do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 8. Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. 3
Kontrola jakości 1. Słabo dodatnie IgA II gliadyny ELISA, wysoko dodatnie IgA gliadyny ELISA i ujemna kontrola ELISA powinny być prowadzone z każdą partią próbek w celu zapewnienia, aby wszystkie odczynniki i procedury działały poprawnie. 2. Warto zauważyć, że słabo dodatnie IgA II gliadyny ELISA, wysoko dodatnie IgA II gliadyny ELISA i ujemna kontrola ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie kontrolują one metod proceduralnych związanych z rozcieńczeniem próbek. 3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < -20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonej wysoko dodatniej IgA II gliadyny ELISA musi być większa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej słabo dodatniej IgA II gliadyny ELISA, która musi być większa niż absorbancja rozcieńczonej kontroli ujemnej ELISA. b. Wstępnie rozcieńczona wysoko dodatnia IgA II gliadyny ELISA musi posiadać absorbancję większą niż 1,0, podczas gdy absorbancja wstępnie rozcieńczonej ujemnej kontroli ELISA nie może przekraczać wartości 0,2. c. Absorbancja słabo dodatniej IgA II gliadyny ELISA musi być większa niż dwukrotna wartość ujemnej kontroli ELISA lub powinna przekraczać 0,25. d. Ujemna kontrola ELISA i wysoko dodatnia IgA II gliadyny ELISA są przeznaczone do monitorowania znacznego braku działania odczynnika. Wysoko dodatnia IgA II gliadyny ELISA nie zapewnia dokładności przy wartości granicznej testu. e. W celu zapoznania się z dodatkowymi wytycznymi użytkownik powinien zapoznać się z dokumentem NCCLS C24-A2 dotyczącym stosowania odpowiednich procedur kontroli jakości. Obliczanie wyników W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność dla każdej próbki może być obliczona przez podzielenie średniej gęstości optycznej przez średnią słabo dodatniej gęstości optycznej IgA II gliadyny ELISA. Wynik jest pomnożony przez liczbę jednostek przypisanych do słabo dodatniego IgA II gliadyny ELISA znalezioną na etykiecie. Gęstość optyczna próbki Wartość próbki = x słabo dodatnia IgA gliadyny ELISA (jednostki) słabo dodatnia gęstość optyczna (jednostki) IgA II gliadyny ELISA Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą. Jednostki Negatywny <20 Słabo pozytywna 20-30 Możliwe są wyniki od średnio pozytywnych do Silnie pozytywna >30 1. Dodatni wynik wskazuje na obecność przeciwciał IgA gliadyny i wskazuje na możliwość pewnych enteropatii wrażliwych na gluten, takich jak choroba trzewna i opryszczkowate zapalenie skóry. 2. Negatywny wynik wskazuje na brak przeciwciał IgA gliadyny lub poziomy poniżej ujemnych wartości granicznych testu. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Uzyskano następujące wyniki uzyskane z INOVA QUANTA Lite IgA II gliadyny. Wartości IgA gliadyny uzyskane metodami badań różnych producentów nie mogą być stosowane zamiennie. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgA nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. 4
Ograniczenia badania 1. Negatywny wynik dla IgA przeciwko gliadynie u nieleczonego pacjenta nie wyklucza enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten, zwłaszcza gdy jednocześnie występuje u niego wysoki poziom przeciwciał IgG przeciwko gliadynie. Stwierdzone klinicznie zmiany często mogą być wyjaśnione przez niedobór IgA, stosunkowo często występujący w celiakii. 2. U leczonych pacjentów z ekspresją przeciwciał IgA, poziom IgA przeciwko gliadynie jest lepszym wskaźnikiem zgodności dietetycznej niż stężenie przeciwciał IgG przeciwko gliadynie 5. 3. fałszywie pozytywnych (wysokie poziomy przeciwciał bez charakterystycznych wyników histologicznych). Wiadomo, że inne schorzenia żołądkowo-jelitowe mogą indukować krążące przeciwciała gliadyny, głównie choroba Crohna, nietolerancja białek żywności (mleko krowie) i zespół złego wchłaniania po infekcji. 2 4. Związek między opryszczkowatym zapaleniem skóry i enteropatią wrażliwą na gluten jest tak silna, że sugeruje się, że obydwie choroby mają taką samą etiologię, u tych pacjentów, określenie przeciwciał gliadyny jest przydatne do wykrywania objawów celiakii oraz oszacowania stopnia zajęcia układu pokarmowego. 12,13 5. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Zdolność QUANTA Lite TM IgA II gliadyny do wykrywania przeciwciał IgA gliadyny był oceniany całą natywną gliadynę na fazie stałej zamiast syntetycznego peptydu. Normalny zakres 500 przypadkowo dobranych dawców krwi było badanych w kierunku obecności przeciwciał IgA gliadyny. Spośród nich, trzystu dawców było w wieku od 14 do 78 lat, a grupa obejmowała tę samą liczbę kobiet i mężczyzn. Jedenaście próbek (2,2%) było powyżej wartości granicznej 20-jednostek, przy czym dwie spośród 11 było jedynie słabo dodatnie przy 20,8 i 25,8 jednostek. Najwyższa wartość spośród tych 11 wynosiła 135 jednostek. Jedna z jedenastu próbek była zarówno ttg IgA i EMA dodatnia, co uważa się za wyniki prawdziwie dodatnie. Średnia wartość spośród tych 500 wynosiła 5,5 jednostek. Odchylenie standardowe jedynie ujemnych próbek wynosiła 2,6 jednostek. Średnia wartość to pięć odchyleń standardowych poniżej wartości granicznej 20 jednostek. Specyficzność po usunięciu jednego wyniku dotyczącego śródmięsnej (endomysium) oraz podwójnie dodatniego wyniku ttg wynosiła 98%. Badania porównawcze Sto trzynaście próbek z trzech laboratoriów referencyjnych choroby trzewnej były testowane zarówno QUANTA Lite IgA II gliadyny oraz standardowego zestawu IgA gliadyny. Te wyniki oraz 500 normalnych przedstawiono poniżej. IgA II gliadyna IgA gliadyna + - Całkowity + 21 21** 42-21* 550 571 Całkowita 42 571 613 Procentowa zgodność wyników pozytywnych: 21/42 (50,0%) Procentowa zgodność wyników negatywnych: 550/571 (96,3%) Ogólna zgodność: 571/613 (93,1%) * 15 z tych 21 wyników dało wynik fałszywie dodatni w standardowym zestawie IgA gliadyny, chorzy ci pochodzili ze zdrowej populacji. ** 11 z tych 21 wyników są prawdziwe dodatnie, u wszystkich z tych chorych rozpoznano celiakię. 5
Swoistość i wrażliwość kliniczna Próbki klinicznie definiuje się jako albo pacjentów dodatnich w kierunku celiakii, pacjentów dodatnich w kierunku celiakii na diecie bezglutenowej, pacjentów dodatnich w kierunku celiakii na diecie bezglutenowej, którzy jeszcze posiadają dodatnie przeciwciała przeciwko śródmięsnej (endomysium), lub krewnych pierwszego stopnia pacjenta z celiakią badanych z wykorzystaniem QUANTA Lite IgA II gliadyny i standardowego zestawu testów w kierunku gliadyny ELISA. Poniżej podano podsumowanie dla określonych klinicznie próbek i próbek z zakresu normalnego. Liczba pozytywnych (%) Grupa pacjentów (# z pacjentów) IgA gliadyny (obecna) Peptyd IgA II gliadyny Dodatni w kierunku celiakii (32) 16 (50%) 22 (69%) Dodatni w kierunku celiakii, Dieta bezglutenowa (30) 4 (13%) 4 (13%) Dodatni w kierunku celiakii (5) 3 (60%) 4 (80%) na diecie bezglutenowej, Występują przeciwciała przeciwko endomysium 1 stopnia krewni (20)* 2 (10%) 1 ( 5%) Niedobór przeciwciał IgA w celiakii (5)** 0 (0%) 0 (0%) Osoby zdrowe (521) 17 (3,3%) 11 (2,1%) * Wszystkich dwudziestu 1 stopnia krewnych miało ujemne wyniki przeciwciał przeciwko endomysium i ttg. ** Wszyscy spośród 5 pacjentów z niedoborem IgA miało dodatnie wyniki w teście wykonanym zestawem peptydu IgA II gliadyny. Reaktywność krzyżowa Aby ocenić potencjalne problemy reaktywności krzyżowej z innymi autoprzeciwciałami, uruchamiano badanie różnych dodatnich próbek o wysokim mianie autoprzeciwciał na zestawie QUANTA Lite IgA II gliadyny. Ogółem, przeprowadzono badania dla 45 próbek. Specyfikacje obejmowały aktynę (5), PCNA (1), AMA (1), fibrylerynę (1), chromatynę (1), histon (4), LKM (4), SS-B (4), Scl-70 (4), RNP (4), czynnik reumatoidalny RF IgM (4), centromer (4), β 2 IgG (2), β 2 IgM (1), β 2 IgA (1) oraz GBM (4). Średnia wartość dla tych 45 próbek wyniosła 3,3 jednostek. Najwyższa próbka, próbka histonu wynosiła 15,9 jednostek. Średnia wartość to pięć odchyleń standardowych poniżej wartości granicznej 20 jednostek. Precyzja i powtarzalność Wewnątrztestowa wydajność QUANTA Lite IgA II dla gliadyny poprzez badanie 9 próbek, każda z nich pięciokrotnie. Wyniki zostały podsumowane tabeli 1 poniżej. Tabela 1: Śródtestowa wydajność QUANTA Lite IgA II gliadyny 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Jednostki średnie 23,9 39,3 78,2 97,0 142,3 153,2 5,0 4,8 4,9 SD 0,5 0,8 2,5 1,8 1,7 5,0 0,4 0,4 0,3 CV % 1,9 2,1 3,2 2,1 1,2 3,3 7,3 8,9 6,4 Zmienność pomiędzy badaniami oceniono przeprowadzając badanie panelu 5 próbek i dołączonej do zestawu wysoko pozytywnej kontroli (HPC); dwa razy dziennie (rano i popołudniu) przez 3 dni, w dwóch powtórzeniach. Wyniki zostały podsumowane tabeli 2 poniżej. Tabela 2: Międzytestowa wydajność QUANTA Lite IgA II gliadyny HPC A B C D E Jednostki średnie 126,0 24,2 34,4 164,1 7,0 7,6 SD 1,5 4,0 0,7 5,1 0,6 1,0 CV % 1,2 16,4 2,0 3,1 8,9 13,8 6
Piśmiennictwo 1. Trier JS: Celiac Sprue. N Engl J Med 325: 1709-1719, 1991. 2. Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: 150-158, 1991. 3. McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: 1163-1165. 1991. 4. Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. J Intern Med 241: 403-506, 1992. 5. Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: 941-947, 1991. 6. Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: 909-911, 1990. 7. Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: 248-254, 2000. 8. Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidaion gliadin peptides. Clin Chem 47: 2023-2028, 2001. 9. Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clin Chem 50: 2370-2375, 2004. 10. Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: 367-371, 1992. 11. Centers for Disease Control/National Institutes of Health Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007. 12. Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestinal tract. J. Allergy Clin. Immunol. July 202-211,1986. 13. Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterlogy and Hepatology 3: 335-341, 2005. 7
8
QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00 + 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 624525POL Marzec 2011 Wersja 0 9