/11 1. PRZEZNACZENIE

PLATELIA LYME IgG 1 płytka 96 72952 TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO JAKOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO W LUDZKIEJ SUROWICY, OSOCZU LUB PŁYNIE MÓZGOWO- RDZENIOWYM 883689 2015/11 1. PRZEZNACZENIE Platelia TM Lyme IgG jest pośrednim testem immunoenzymatycznym do jakościowego wykrywania przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato w ludzkiej surowicy, osoczu lub płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR). 2. ZNACZENIE KLINICZNE Borelioza z Lyme (lub choroba z Lyme) jest to choroba niezakaźna, wywoływana przez Borrelia burgdorferi bakterię z rodziny krętków, przenoszoną przez kleszcze z rodzaju Ixodes (2). Gospodarzami tej bakterii są różne zwierzęta, a przeniesienie choroby na człowieka zachodzi poprzez ukąszenie przez zainfekowanego kleszcza. Ryzyko przeniesienia zakażenia jest tym większe im dłuższy jest czas pobierania pokarmu przez kleszcza (tj. czas ukąszenia). Częstość występowania choroby z Lyme jest wysoka w krajach o klimacie umiarkowanym i chłodnym na półkuli północnej, od Chin do Ameryki Północnej oraz od Skandynawii po Afrykę Północną. Szacuje się, że każdego roku w Stanach Zjednoczonych zgłaszanych jest około 17 000 przypadków (3), a w Europie przypuszczalnie ponad 50 000, przy czym stwierdzonym dodatnim gradiencie częstości w kierunku z zachodu na wschód(4). Wyraźnie wykazano, że Borrelia burgdorferi opisana w 1984 roku jako unikalny gatunek bakterii, w rzeczywistości sklada się z kilku gatunków, spośród których pięć jest chorobotwórczych dla człowieka: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii i Borrelia bavariensis (7,8). Dwa pozostałe gatunki są potencjalnie patogenne: Borrelia valaisiana i Borrelia lusitaniae. Te siedem gatunków krąży w Europie, a tylko B. burgdorferi sensu stricto występuje w Stanach Zjednoczonych. Objawy kliniczne choroby z Lyme są zróżnicowane i czasami trudne do rozpoznania (6). W klinicznym przebiegu choroby wyróżnić można trzy etapy. Etap wczesny (Stadium I) może być bezobjawowy i charakteryzuje się występowaniem zespołu objawów grypopodobnych. W 50 do 80% przypadków, kilka dni lub tygodni po ukąszeniu, pojawia się typowo zlokalizowana wysypka skórna, rozchodząca się koliście, określana jako rumień wędrujący (erythema migrans, EM). Jeżeli nie zostanie wdrożone leczenie, rozsiew bakterii drogą krwiopochodną powoduje wystąpienie po kilku tygodniach zapalenia stawów, zaburzeń neurologicznych lub o charakterze zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych oraz objawów skórnych lub sercowych (Stadium II). Po kilku miesiącach lub latach, choroba może przejść w stadium przewlekłe związane z występowaniem zanikowego zapalenia skóry obwodowych części kończyn (acrodermatitis chronica atrophicans), zapalenia mózgu, zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego oraz przewlekłego zapalenia stawów (Stadium III) (1). Każdy z gatunków Borrelia burgdorferi wykazuje specyficzny tropizm. Rumień wędrujący w stadium I występuje w przypadku wszystkich trzech gatunków. Jednakże powikłania neurologiczne częściej występują w przypadku zakażenia wywołanego przez B. garinii, zapalenie stawów częściej związane jest z zakażeniem wywołanym przez B. burgdorferi ss, podczas gdy zanikowe zapalenie skóry jest swoiste dla B. afzelii. Nie należy stawiać rozpoznania boreliozy bez dokładnej analizy historii choroby pacjenta, kryteriów klinicznych i biologicznych oraz bez oszacowania ryzyka narażenia na ukąszenie przez kleszcze. Ze względu na trudności w wykryciu bezpośrednim, izolacji z hodowli i wdrażaniu metod biologii molekularnej, badania serologiczne stanowią kluczowy element w biologicznej diagnostyce boreliozy (1,5,9). Przeciwciała klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi pojawiają się około 3 do 6 tygodni po zakażeniu i mogą utrzymywać się przez okres rozwoju choroby, podczas gdy przeciwciała klasy IgG pojawiają się później i osiągają wysoki poziom dopiero po kilku miesiącach lub latach. Nawet, jeżeli badanie serologiczne jest mniej przydatne w stadium wczesnym, jest ono bardzo istotne w stadium drugim i trzecim, zwłaszcza przy braku rumienia wędrującego. Jeżeli wynik badania serologicznego jest ujemny, mimo sugerującego zakażenie obrazu klinicznego, kolejne badanie serologiczne należy wykonać po trzech tygodniach od pierwszego badania. Obecność swoistych przeciwciał klasy IgM nie jest jednoznaczna ze stwierdzeniem niedawnego zakażenia. Podobnie, obecność swoistych przeciwciał klasy IgG nie zawsze świadczy o przebytym zakażeniu. Ponadto, oznaczenie indeksu wewnątrzoponowej syntezy swoistych przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato stanowi element pomocniczy przy podejrzeniu neuroboreliozy (10,11,12). Antygeny i przeciwciała wykorzystane w testach Platelia TM Lyme IgG (nr ref. 72952) oraz Platelia TM Lyme IgM (nr ref. 72951) zostały dobrane tak, aby pozwolić na wykrycie swoistych przeciwciał klasy IgG i klasy IgM, przeciwko zróżnicowanym amerykańskim i europejskim szczepom Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 1

3. ZASADA Platelia TM Lyme IgG jest pośrednim testem immunoenzymatycznym testem do jakościowego wykrywania przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato w ludzkiej surowicy, osoczu lub PMR. Mikropłytkę opłaszczono inaktywowanymi antygenami Borrelia burgdorferi. W koniugacie zastosowano przeciwciało monoklonalne, znakowane peroksydazą, swoiste wobec ludzkich łańcuchów gamma (anty-igg). Wykonanie oznaczenia obejmuje następujące etapy: Etap 1 Próbki pacjenta (surowica lub osocze) i kontrole rozcieńczane są w stosunku 1:101. Próbki CSF rozcieńczane są w stosunku 1:2. Rozcieńczone próbki są następnie nanoszone do studzienek mikropłytki. Podczas trwającej jedną godzinę inkubacji w temperaturze 37 C, przeciwciała klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi, występujące w próbce, wiążą się z antygenem Borrelia, którym opłaszczone są studzienki mikropłytki. Po inkubacji, niezwiązane przeciwciała niespecyficzne i inne białka surowicy usuwane są w trakcie płukania. Etap 2 Do studzienek mikropłytki dodawany jest koniugat (przeciwciało monoklonalne swoiste wobec ludzkich łańcuchów gamma, znakowane peroksydazą). Podczas trwającej jedną godzinę inkubacji w temperaturze 37 C, znakowane przeciwciało monoklonalne wiąże się do przeciwciał klasy IgG surowicy, wychwyconych przez antygen Borrelia. Niezwiązany koniugat usuwany jest przez płukanie po zakończeniu inkubacji. Etap 3 Obecność kompleksów immunologicznych (antygen Borrelia, przeciwciało klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferii, koniugat IgG) wykazywana jest poprzez dodanie do studzienki roztworu wyzwalającego reakcję enzymatyczną. Etap 4 Po inkubacji w temperaturze pokojowej (+18-30 C), reakcja enzymatyczna zatrzymywana jest przez dodanie roztworu 1N kwasu siarkowego. Odczyt gęstości optycznej uzyskany za pomocą czytnika ustawionego na 450/620 nm jest proporcjonalny do ilości przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi, występujących w próbce. 4. INFORMACJA O PRODUKCIE Dostarczona ilość odczynników umożliwia wykonanie 96 oznaczeń w maksymalnie 6 seriach. Wszystkie odczynniki przeznaczone są wyłącznie do diagnostyki in vitro. Etykieta Odczynnik Ilość R1 Mikropłytka Mikropłytka (gotowa do użytku) 1 mikropłytka 12 pasków po 8 odłamywalnych studzienek każdy, opłaszczonych inaktywowanym antygenem Borrelia R2 Stężony roztwór płuczący (20x) Stężony roztwór płuczący (20x) Bufor Tris-NaCl (ph 7.4), 2% Tween 20 1 fiolki 70 ml Środek konserwujący: 0,04 % ProClin 300 R3 Kontrola ujemna Kontrola ujemna Ludzka surowica, ujemna pod względem przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi oraz ujemna pod względem antygenu HBs, przeciwciał anty-hiv1, anty-hiv2 i anty-hcv Środek konserwujący: 0,15 % ProClin 300 R4 Kontrola wartości odcięcia Kontrola wartości odcięcia Ludzka surowica reaktywna pod względem przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi oraz ujemna pod względem antygenu HBs, przeciwciał anty-hiv1, anty-anti-hiv2 i anty-hcv Środek konserwujący: 0,15 % ProClin 300 R5 Kontrola dodatnia Kontrola dodatnia Ludzka surowica reaktywna pod względem przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi oraz ujemna pod względem antygenu HBs, przeciwciał anty-hiv1, anty-anti-hiv2 i anty-hcv Środek konserwujący: 0,15 % ProClin 300 R6 Koniugat (51x) Koniugat (51x) Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkim łańcuchom gamma, skoniugowane z peroksydazą chrzanową Środek konserwujący: 0,16 % ProClin 300 R7 Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik dla próbek i koniugatu (gotowy do użytku) Tris-NaCl (ph 7.7), płodowa surowica cielęca, 0.1% Tween 20 oraz czerwień fenolowa Środek konserwujący: 0,15 % ProClin 300 R9 Chromogen TMB Chromogen (gotowy do użytku) 3,3,5,5 tetrametylobenzydyna (< 0.1%), H 2O 2 (<1%) R10 Roztwór zatrzymujący Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowy do użytku) reakcję 1N roztwór kwasu siarkowego Warunki przechowywania oraz datę przydatności do użytku podano na opakowaniu zestawu. 1 fiolka 0.75 ml 1 fiolka 0.75 ml 1 fiolka 0.75 ml 1 fiolka 0.7 ml 2 fiolki 65 ml 1 fiolka 28 ml 1 fiolka 28 ml 2

5. ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Wiarygodność uzyskiwanych wyników zależy od właściwego stosowania następujących zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie daty ważności. Nie mieszać i nie łączyć w ramach jednego oznaczenia odczynników z różnych serii. UWAGA: W przypadku roztworu płuczącego (R2, oznaczenie na etykiecie: 20x, kolor zielony), chromogenu (R9, oznaczenie na etykiecie: TMB, kolor turkusowy) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, oznaczenie na etykiecie: 1N, kolor czerwony), można stosować inne serie niż zawarte w zestawie, pod warunkiem, że odczynniki są ściśle równoważne i w ramach jednego oznaczenia stosowana jest ta sama seria odczynnika. Przed użyciem odczekać 30 minut, aby odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową (+18-30 C). Starannie rekonstytuować lub rozcieńczać odczynniki, unikając ich zanieczyszczenia. Nie wykonywać oznaczenia w obecności reaktywnych par związków (kwasów, zasad, aldehydów) lub kurzu, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Stosować naczynia szklane dokładnie umyte i wypłukane wodą dejonizowaną lub najlepiej materiały jednorazowego użytku. Płukanie mikropłytki stanowi ważny etap procedury: należy przestrzegać zalecanej liczby cykli płukania i upewnić się, że studzienki są całkowicie napełniane, a następnie całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie może być przyczyną do błednych wyników. Nie dopuszczać do wyschnięcia mikropłytki między zakończeniem płukania a naniesieniem odczynnika. Nie stosować nigdy tych samych pojemników do pipetowania koniugatu i roztworu wywołującego. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na metale lub jony metali. W związku z tym nie należy dopuszczać do kontaktu jakiegokolwiek elementu metalowego z roztworami zawierającymi koniugat lub chromogen. Roztwór chromogenu (R9) powinien być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiego zabarwienia oznacza, że odczynnik nie może być stosowany i musi zostać wymieniony. Do każdej próbki stosować nową końcówkę pipety. Sprawdzać pipety i pozostały sprzęt pod względem dokładności i poprawności działania. Higiena i bezpieczeństwo pracy Materiał pochodzenia ludzkiego użyty do przygotowania odczynników został przebadany i uznany za niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBs Ag), przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (anty-hcv) oraz przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). Ze względu na to, iż żadna metoda nie daje całkowitej pewności co do braku czynników zakaźnych, odczynniki pochodzenia ludzkiego oraz próbki pacjentów należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Każdy materiał, który ma bezpośredni kontakt z próbkami i odczynnikami zawierającymi materiały pochodzenia ludzkiego, również roztwory płuczące, należy traktować jak materiał potencjalnie zakaźny. Pracując z próbkami i odczynnikami stosować rękawice jednorazowego użytku. Nie pipetować ustami. Unikać rozlewania próbek lub roztworów zawierających próbki. Rozlany materiał należy spłukać wybielaczem, rozcieńczonym do 10%. W razie rozlania kwasu, należy najpierw zobojętnić go dwuwęglanem sodu, a następnie spłukać środkiem wybielającym rozcieńczonym do 10% i osuszyć bibułą. Materiał stosowany do czyszczenia należy wyrzucać do pojemnika z odpadami zakaźnymi. Próbki pacjenta, odczynniki zawierające materiał pochodzenia ludzkiego, jak również materiały skażone należy wyrzucać po odkażeniu: - przez zanurzenie w środku wybielającym o ostatecznym stężeniu podchlorynu sodu wynoszącym 5%, na 30 minut; - lub przez sterylizację w autoklawie w temperaturze 121 C przez co najmniej 2 godziny. UWAGA: Nie wstawiać do autoklawu roztworów zawierających podchloryn sodu. Unikać kontaktu chromogenu i roztworu zatrzymującego reakcję ze skórą i błoną śluzową (ryzyko zatrucia, podrażnienia lub poparzenia). Z odpadami chemicznymi i biologicznymi należy postępować i usuwać je zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Wszystkie odczynniki w zestawie przeznaczone są wyłącznie do diagnostyki in vitro. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej www.bio-rad.com. 3

6. POBIERANIE, PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK 1. Zalecane rodzaje próbek to surowica i osocze (pobrane na EDTA, heparynę lub cytrynian) oraz PMR. 2. Podczas pobierania, obróbki i przechowywania próbek krwi należy przestrzegać poniższych zaleceń: Próbki krwi żylnej pobierać zgodnie z rutynową procedurą. W przypadku surowicy, przed wirowaniem odczekać do pełnego wykrzepienia próbek. Probówki powinny być cały czas zamknięte. Po odwirowaniu, oddzielić surowicę lub osocze od skrzepu lub krwinek czerwonych do dokładnie zamkniętej probówki do przechowywania. Próbki można przechowywać w temperaturze +2-8 C, jeżeli badanie zostanie wykonane w ciągu 7 dni. Jeżeli badanie nie zostanie wykonane w ciągu 7 dni lub w przypadku przygotowania do wysyłki, próbki należy zamrozić w temperaturze -20 C lub niższej. Nie używać próbek, które były rozmrażane więcej niż pięć razy. Uprzednio zamrożone próbki należy przed badaniem, po rozmrożeniu, dokładnie wymieszać (Vortex). 3. Próbki surowicy lub osocza zawierające 90 g/l albumin lub 100 mg/l niezwiązanej bilirubiny, próbki lipemiczne zawierające równoważność 36 g/l trójoleiny (trójglicerydy) oraz próbki zhemolizowane, zawierające do 10 g/l hemoglobiny nie wpływają na uzyskane wyniki. 4. Nie ogrzewać próbek. 5. W celu wykazania wewnątrzoponowej syntezy IgG, należy użyć próbek PMR pobranych metodą nakłucia lędźwiowego odcinka kręgosłupa, jednocześnie z pobraniem próbki z surowicy lub osocza. Należy stosować się do rutynowych zaleceń mających zastosowanie w przypadku pobierania próbek PMR. Szczególnie istotnym jest, nieużywanie do oznaczeń próbek zmienionych, o niejednorodnym wyglądzie (w takim wypadku preferowanym materiałem jest supernatant po odwirowaniu) lub próbek silnie zhemolizowanych. PMR należy oznaczać niezwłocznie po pobraniu. Jeśli konieczne jest przechowywanie PMR w celu dalszych badań, można to zrobić w temperaturze 4-8 C (krótki czas) lub -20 C (w dłuższym okresie) (11). UWAGA: Stabilność próbek PMR w temperaturze 4-8 C lub -20 C lub po wielu cyklach zamrażania i rozmrażania lub w obecności czynników interferujących, wymienionych powyżej w punkcie 3 nie była badana. 7. PROCEDURA BADANIA 7.1 MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIE DOSTARCZONE PRZEZ PRODUCENTA Mieszadło Vortex. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry o długości fali 450 nm i 620 nm (*). Inkubator mikropłytek z termostatem ustawionym na temp. 37±1 C (*). Automatyczne, półautomatyczne lub ręczne urządzenie do płukania mikropłytek (*). Jałowa woda destylowana lub dejonizowana. Rękawiczki jednorazowego użytku. Gogle lub okulary ochronne. Bibuła. Automatyczne lub półautomatyczne, nastawne lub stało-objętościowe pipety jedno- lub wielokanałowe, do odmierzania i dozowania objętości od 10 µl do 1000 µl oraz 1 ml, 2 ml i 10 ml. Cylindry miarowe o pojemności 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml. Podchloryn sodu (środek wybielający) i dwuwęglan sodu. Pojemnik na odpady zakaźne. Probówki jednorazowego użytku. (*) Szczegółowe informacje dotyczące zalecanego wyposażenia uzyskać można w naszym dziale technicznym. 7.2 REKONSTUTUCJA ODCZYNNIKÓW R1: Przed otwarciem torebki, odczekać 30 minut, aby ogrzać mikropłytkę do temperatury pokojowej (+18-30 C). Wyjąć ramkę, niewykorzystywane paski włożyć natychmiast z powrotem do torebki i sprawdzić czy w torebce znajduje się środek osuszający. Dokładnie zamknąć torebkę i przechowywać ją w temperaturze +2-8 C. R2: Rozcieńczyć roztwór płuczący 1/20 w wodzie destylowanej: na przykład 50 ml R2 i 950 ml wody destylowanej, aby uzyskać gotowy do użytku roztwór płuczący. Jeżeli płukanie wykonywane jest ręcznie, przygotować 350 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego na jedną płytkę zawierającą 12 pasków. R3, R4, R5: Rozcieńczyć 1/101 w Rozcieńczalniku (R7) (przykład: 10 µl R3 + 1 ml R7). R6+R7: Koniugat (R6) jest stężony 51x, odczynnik przed użyciem wymieszać. Rozcieńczyć 1/51 w rozcieńczalniku (R7). Na jedną płytkę rozcieńczyć 0.5 ml koniugatu (R6) w 25 ml rozcieńczalnika (R7). Podzielić te objętości przez 5, aby uzyskać objętość potrzebną na dwa paski. 7.3 PRZECHOWYWANIE ORAZ TRWAŁOŚĆ OTWARTYCH I / LUB ZREKONSTYTUOWANYCH ODCZYNNIKÓW Zestaw należy przechowywać w temperaturze +2-8 C. Przed pierwszym otwarciem, każdy składnik zestawu przechowywanego w temperaturze +2-8 C, zachowuje trwałość do daty przydatności do użytku, podanej na etykiecie zewnętrznej zestawu. R1: Po otwarciu, paski pozostają stabilne przez okres jednego miesiąca, o ile przechowywane są w temperaturze +2-8 C, w tej samej dokładnie zamkniętej torebce (sprawdzić czy w torebce jest środek osuszający). R2: Roztwór płuczący po rozcieńczeniu można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze +2-30 C. Stężony roztwór płuczący, przechowywany w temp. +2-30 C, jest stabilny do czasu upływu terminu przydatności do użytku podanego na etykiecie, pod warunkiem, że nie dojdzie do zanieczyszczenia. 4

R3, R4, R5, R6, R7: Po otwarciu, jeżeli nie dojdzie do zanieczyszczenia, odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C, są stabilne przez okres do jednego miesiąca. R6 + R7: Po rozcieńczeniu, roboczy roztwór koniugatu jest stabilny przez 8 godzin w temperaturze pokojowej (+18-30 C) lub przez 24 godziny w temperaturze +2-8 C. R9: Po otwarciu, jeżeli nie dojdzie do zanieczyszczenia, odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C jest stabilny przez okres 2 miesięcy. R10: Po otwarciu, jeżeli nie dojdzie do zanieczyszczenia, odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C jest stabilny do czasu upływu terminu przydatności podanego na etykiecie. 7.4 PROCEDURA DLA PRÓBEK SUROWICY I OSOCZA Ściśle przestrzegać procedury badania oraz zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Przed użyciem odczekać, aby odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową (+18-30 C). W celu walidacji uzyskanych wyników, w każdej serii badań stosować kontrolę ujemną, kontrolę cut-off oraz kontrolę dodatnią. 1. Dokładnie ustalić rozkład i plan identyfikacji kontroli i próbek pacjentów. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący (R2) [Zobacz Rozdział 7.2]. 3. Wyjąć ramkę i paski (R1) z torebki ochronnej [Zobacz Rozdział 7.2]. 4. Rozcieńczyć kontrole R3, R4, R5 oraz próbki pacjentów (S1, S2...) w rozcieńczalniku (R7), aby uzyskać rozcieńczenie 1/101: 10 µl próbki i 1.0 ml rozcieńczalnika (R7). Wymieszać rozcieńczone próbki na mieszadle Vortex. 5. Ściśle przestrzegać przedstawionej poniżej sekwencji postępowania, nanieść do każdej studzienki po 200 µl rozcieńczonych kontroli i próbek pacjenta: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Zakryć mikropłytkę folią adhezyjną i docisnąć mocno do płytki, aby zapewnić szczelność. Natychmiast inkubować mikropłytkę w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę ± 5 minut w temperaturze 37 C ± 1 C. 7. Po zakończeniu pierwszej inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek i usunąć do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Wypłukać mikropłytkę 4 razy stosując 350 µl roztworu płuczącego (R2). Odwrócić mikropłytkę na bibule i delikatnie postukując usunąć pozostały płyn. 8. Przygotować roztwór roboczy koniugatu (R6 + R7) [Zobacz Rozdział 7.2]. Natychmiast nanieść po 200 µl roztworu roboczego koniugatu (R6 + R7) do wszystkich studzienek. Roztwór należy delikatnie wstrząsnąć przed użyciem. 9. Zakryć mikropłytkę folią adhezyjną i docisnąć mocno do płytki, aby zapewnić szczelność. Natychmiast inkubować mikropłytkę w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze, przez 1 godzinę ± 5 minut, w temperaturze 37 C ± 1 C. 10. Po zakończeniu drugiej inkubacji zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek i usunąć do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Wypłukać mikropłytkę 4 razy stosując 350 µl roztworu płuczącego (R2). Odwrócić mikropłytkę na bibule i delikatnie postukując usunąć pozostały płyn. 11. Chroniąc przed dostępem światła, szybko nanieść do każdej studzienki po 200 µl roztworu chromogenu (R9). Inkubować reakcję w ciemności, przez 30 ± 5 minut, w temperaturze pokojowej (+18-30 C). Nie stosować folii adhezyjnej podczas tej inkubacji. 12. Zatrzymać reakcję enzymatyczną dodając po 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10) do każdej studzienki. Nanosić roztwór w tej samej kolejności i z taką samą szybkością jak roztwór wywołujący reakcję. 13. Ostrożnie wytrzeć spód płytki. W ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji, odczytać gęstość optyczną przy filtrze 450/620 nm, stosując czytnik płytek. Przed odczytem chronić paski przed działaniem światła. 14. Przed podaniem wyników, sprawdzić zgodność między odczytem a planem rozkładu płytki i próbek. 7.4 PROCEDURA DLA PRÓBEK PŁYNU MÓZGOWO-RDZENIOWEGO UWAGA: Oznaczenie wewnątrzoponowej syntezy przeciwciał klasy IgG w diagnostyce boreliozy opiera się na zastosowaniu wzoru Reibera. Dla każdego pacjenta z podejrzeniem neuroboreliozy, pobierane są jednocześnie sparowane próbki surowicy/osocza i PMR. Obie próbki badane są w jednym cyklu. Należy rozcieńczyć próbki CSF w rozcieńczalniku (R7), aby uzyskać rozcieńczenie 1:2: 150 µl próbki CSF i 150 µl rozcieńczalnika (R7). Za wyjątkiem rozcieńczenia próbek CSF, należy ściśle przestrzegać opisanego wyżej protokołu dla próbek surowicy lub osocza. 5

8 OBLICZANIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 8.1 Obliczanie wartości odcięcia (CO) Wartość odcięcia (cut-off value, CO) odpowiada średniej wartości gęstości optycznej (OD) duplikatów kontroli cut-off (R4): CO = średnia z OD R4 8.2 Obliczanie indeksu próbki (surowica lub osocze) Wynik próbki podawany jest jako indeks, przy zastosowaniu następującego wzoru: Indeks próbki = OD próbki/co 8.3 Kontrola jakości Na każdej płytce i w każdej serii oznaczeń należy uwzględniać wszystkie kontrole i przeanalizować uzyskane wyniki. W celu walidacji serii oznaczeń, muszą być spełnione następujące kryteria: Wartości gęstości optycznej: - CO > 0.200-0.80 x CO < OD R4 powtórzenie 1 < 1.20 x CO - 0.80 x CO < OD R4 powtórzenie 2 < 1.20 x CO (OD każdego powtórzenia kontroli wartości odcięcia (R4) nie może różnić się o więcej niż 20% od wartości CO). Indeks gęstości optycznej: - Indeks R3 (OD R3 / CO) < 0.5 - Indeks R5 (OD R5 / CO) >2.0 Jeżeli nie są spełnione powyższe kryteria kontroli jakości, oznaczenie należy powtórzyć. 8.4 Interpretacja wyników (surowica lub osocze) Indeks próbki Wynik Interpretacja Indeks < 0,80 Ujemny Próbkę należy traktować jako niereaktywną pod względem przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato. 0,80 Indeks < 1,2 Niejednoznaczny Próbka traktowana jest jako niejednoznaczna pod względem przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato. Wynik należy potwierdzić za pomocą kolejnego badania, wykonanego na nowej próbce krwi, pobranej w odstępie co najmniej 3 tygodni od czasu tego badania. Indeks 1,2 Dodatni Próbkę należy traktować jako reaktywną pod względem przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato. Jeżeli podejrzewa się zakażenie, do potwierdzenia rozpoznania przydatne mogą być uzupełniające badania serologiczne takie jak wykrywanie przeciwciał klasy IgM anty-borrelia. Jeżeli wynik badania serologicznego jest dodatni lub niejednoznaczny, zaleca się przebadanie próbki metodą potwierdzającą np. Western-Blot (9). 8.5 Obliczenia w celu oznaczenia syntezy wewnątrzoponowej Oznaczenie syntezy wewnątrzoponowej wykonywane jest z użyciem indeksu przeciwciał IgG (AI IgG) wyliczanego za pomocą wzoru Reibera (10,11,12). Dla każdej sparowanej próbki surowicy i PMR należy określić wartości OD (OD IgG Serum, OD IgG PMR) i sprawdzić, czy mieszczą się one w zakresie od 0,000 do 3,000. OSTRZEŻENIE: Jeśli OD surowicy (OD IgG surowica) lub OD PMR (OD IgG PMR) są poza zakresem OD wymienionym powyżej, próbkę należy zbadać ponownie, korzystając z większego rozcieńczenia w rozcieńczalniku R7 dostarczonym z zestawem. Po rozcieńczeniu, OD próbki musi zawierać się w zakresie od 0,000 do 3,000. W takim przypadku należy uwzględnić współczynnik rozcieńczenia zastosowany do obliczenia indeksu syntezy wewnątrzoponowej (patrz poniżej). Dla każdej badanej próbki surowicy należy określić następujące dane: Albuminy (g/l) = Albuminy surowica Całkowite IgG (g/l) = Całkowite IgG surowica Dla każdej badanej próbki PMR należy określić następujące dane: Albuminy (mg/l) = Albuminy PMR Całkowite IgG (mg/l) = Całkowite IgG PMR 6

Oblicz potrzebne wartości za pomocą wzorów poniżej:: Q Alb = Albuminy PMR / [Albuminy Surowica x 1000] Q lim(igg) = 0,93 x [Q Alb 2 + (6 x 10-6 )] 1/2 1,7 x 10-3 Q IgG = Całkowite IgG PMR / [Całkowite IgG Surowica x 1000] Q Spec(IgG) = OD IgG PMR / [OD IgG Surowica x 50,5] OSTRZEŻENIE: Jeśli np. próbki PMR i surowicy były rozcieńczone odpowiednio 1:5 i 1:10, aby mieściły się w przedziale OD od 0,000 do 3,000 OD, przed podstawieniem danych do wzoru na obliczenie Q Spec(IgG) należy pomnożyć OD CSF (OD IgG PMR) razy 5, a OD surowicy (OD IgG Surowica) razy 10. Indeks przeciwciał IgG (AI IgG) należy określić za pomocą jednego z dwóch wzorów podanych niżej: AI IgG = Q Spec(IgG) / Q IgG [jeśli Q IgG < Q lim(igg)] lub AI IgG = Q Spec(IgG) / Q lim(igg) [jeśli Q IgG > Q lim(igg)] 8.6 Interpretacja indeksu przeciwciał (AI IgG) w celu oznaczenia syntezy wewnątrzoponowej Wzór Reibera na określenie indeksu przeciwciał IgG nie ma zastosowania w następujących sytuacjach: indeks próbki PMR < 0,50 (*) indeks próbki PMR 0,50, przy indeksie surowicy/osocza < 0,50 (*) (*) indeks = OD / średnia R4 Wyniki dla PMR należy interpretować zgodnie z algorytmem poniżej: Oznaczenie indeksu PMR Indeks PMR < 0,50 Indeks PMR 0,50 PMR IgG ujemny Oznaczyć indeks surowicy Indeks surowicy < 0,50 Indeks surowicy 0,50 Indeks PMR< 0,80 Indeks PMR 0,80 Wzór Reibera Nie interpretować wyniku PMR PMR IgG dodatni Interpretacja indeksu przeciwciał IgG Algorytm oznaczania indeksu przeciwciał IgG za pomocą zestawu Platelia Lyme IgG Wewnątrzoponowa synteza IgG jest potwierdzona, kiedy indeks przeciwciał IgG jest wyższy niż 1,3. Brak wewnątrzoponowej syntezy IgG, jeśli indeks przeciwciał IgG jest wyższy niż 0,70, lecz niższy lub równy 1,30. Wynik nie powinien zostać uznany za prawidłowy, jeśli indeks przeciwciał IgG jest niższy lub równy 0,70 (błąd procedury, próbki surowicy i CSF pobrane innego dnia, skażenie CSF, itp.). Interpretacja AI IgG Dodatni AI IgG > 1,30 Ujemny 0,70 < AI IgG 1,30 Wynik nieprawidłowy AI IgG 0,70 7

8.7 Rozwiązywanie problemów Wyniki nie spełniające kryteriów walidacji lub niepowtarzalne mogą wynikać z następujących przyczyn: Niewłaściwe płukanie mikropłytki. Zanieczyszczenie próbek ujemnych przez surowicę lub osocze o wyższym mianie przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu wywołującego reakcję przez utleniające czynniki chemiczne (środek wybielający, jony metali...). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję. 8.8 Przykład obliczeń (surowica lub osocze) Uwaga: Poniższe dane stanowią przykład i nie powinny być stosowane zamiast wyników uzyskanych przez użytkownika. Kontrole i próbki pacjentów OD (450/620 nm) Współczynnik Wynik R3 0.144 0.29 Ujemny R4 0.502 / / R4 0.498 / / R5 1.440 2.88 Dodatni Próbka 1 1.650 3.30 Dodatni Próbka 2, itd... 0.120 0.24 Ujemny Wartość odcięcia: - CO = (0.502 + 0.498)/2 = 0.500 Wartości gęstości optycznej: - OD CO = 0.500 (N > 0.200) - OD R4 Powtórzenie 1 = 0.502 (0.80 x OD CO < OD R4 Powtórzenie 1 < 1.20 x OD CO) - OD R4 Powtórzenie 2 = 0.498 (0.80 x OD CO < OD R4 Powtórzenie 2 < 1.20 x OD CO) Indeks gęstości optycznej: - Indeks R3 = 0.29 (N < 0.5) - Indeks R5 = 2.88 (N > 2.0) Kontrola jakości: Zaakceptowana 9 CHARAKTERYSTYKA TESTU 9.1 Wartości spodziewane Wartości spodziewane dla oznaczenia poziomu przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato w surowicy ludzkiej wyznaczono wykorzystując panel 295 próbek pochodzących od dawców krwi z terenu Francji Północnej. Uzyskano następujące wyniki: 291 ujemnych, 1 niejednoznaczna, 3 surowice dodatnie. Prewalencja wyznaczona z wykorzystaniem testu Platelia Lyme IgG wynosi 1.02% (3/295). 9.2 Swoistość 9.2.1 Swoistość na terenach nie-endemicznych Swoistość oznaczono wykorzystując panel 279 surowic uzyskanych od zdrowych dawców krwi pochodzących z rejonów nieendemicznych na terenie północnej Francji. Próbki zostały wyselekcjonowane na podstawie ujemnego wyniku badania z użyciem komercyjnych testów EIA wykorzystywanych w Europie (oznakowanych znakiem CE) i uznanych za referencyjne. 9.2.2 Swoistość na terenach endemicznych Swoistość oznaczono także z wykorzystaniem panelu 193 surowic uzyskanych od zdrowych dawców krwi pochodzących z rejonów endemicznych na terenie wschodniej Francji, z których żaden nie spełniał kryteriów kwalifikujących w kierunku choroby z Lyme (brak objawów klinicznych boreliozy, ani też doniesień o ugryzieniu przez kleszcza). Próbki zostały wyselekcjonowane na podstawie ujemnego wyniku badania z użyciem komercyjnych testów EIA wykorzystywanych w Europie (oznakowanych znakiem CE) i uznanych za referencyjne. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli: Panel surowic Ujemny Niejednoznaczny (1) Dodatni (2) Swoistość Rejon nie-endemiczny (n=279) 278 1 0 (278/278) [98,9%-] Rejon endemiczny (n=193) 190 2 1 (1) Wyniki niejednoznaczne nie zostały uwzględnione w obliczeniach swoistości. (2) Próbki dodatnie w teście Platelia Lyme IgG były ujemne w teście Western-Blot. IC 95%: 95% przedział ufności. 99,5% (190/191) [97,1%-99,9%] 8

9.3 Czułość Czułość testu Platelia Lyme IgG wyznaczono z użyciem panelu 70 próbek pochodzących od pacjentów prezentującyh zróżnicowane objawy boreliozy z różnych etapów zakażenia i podano razem z wynikami czułości dla testu Platelia Lyme IgM (nr kat. 72951). Uzyskane wyniki przedstawiono w poniżej tabeli i porównano z wynikami czułości uzyskanymi dla komercyjnych testów EIA wykorzystywanych w Europie (oznakowanych znakiem CE) i uznanych za referencyjne: Stadium kliniczne Liczba surowic Platelia Lyme (1) Test ref. Europa (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM Erythema migrans (Stadium I) 17 66,7% [38,4%-88,2%] 58,8% [32,9%-81,6%] 82,4% [56,6%-96,2%] 93,3% [68,1%-99,8%] Neuroborelioza (Stadium II) 33 96,9% [83,4%-99,9%] 36,7% [19,9%-56,1%] 96,9% [83,4%-99,9%] 97,0% [84,2%-99,9%] Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadium III) 5 [54,9%-] 20,0% [0,05%-71,6%] [54,9%-] [54,9%-] Lyme Arthritis (Stadium III) 15 [81,9%-] (1) Wyniki niejednoznaczne nie zostały uwzględnione w obliczeniach czułości. IC 95%: 95% przedział ufności. 0,0% [0,0%-18,1%] [81,9%-] [81,9%-] Czułość testu Platelia Lyme IgG wyznaczono także z użyciem panelu udokumentowanych próbek z kolekcji CDC (Centre for Disease Control) i porównano z wynikami czułości uzyskanymi dla komercyjnych testów EIA wykorzystywanych w Europie (oznakowanych znakiem CE) oraz USA (zatwierdzonych przez FDA) i uznanych za referencyjne. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli: Stadium kliniczne Erythema migrans Liczba surowic 28 Test referencyjny Platelia Lyme (1) Europa (1) USA (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM IgG + IgM 38,5% [20,2%-59,5%] 73,7% [48,8%-90,9%] 86,4% [65,1%-97,1%] 70,4% [49,8%-86,3%] 87,0% [66,4%-97,2%] Arthritis / Arthralgia 6 [60,7%- ] 40,0% [5,3%-85,3%] [60,7%- ] [60,7%-] [60,7%-] Stadium nieznane 4 [36,8%- ] [0,05%- ] (1) Wyniki niejednoznaczne nie zostały uwzględnione w obliczeniach czułości. IC 95%: 95% przedział ufności. [47,3%- ] [19,4%-99,9%] [36,8%-] 9

9.4 Obliczanie indeksu przeciwciał IgG w celu oznaczenia syntezy wewnątrzoponowej Zewnętrzną ocenę przeprowadzono na 104 parach próbek od pacjentów bez neuroboreliozy (n=19), z podejrzeniem (n=29), prawdopodobną (n=36) lub zdiagnozowaną (n=20) neuroboreliozą. Szczegółowe wyniki dla każdej kategorii przedstawiono poniżej: Status Razem PMR nieinterpretacyjny PMR ujemny PMR dodatni Indeks AI IgG dodatni Indeks AI IgG ujemny Indeks AI IgG prawidłowy Brak LNB 19 0 18 1 0 0 0 Podejrzenie LNB 29 0 11 0 14 4 0 Prawdopodobieństwo LNB 36 1 6 2 22 4 1 Zdiagnozowana LNB 20 0 0 0 17 2 1 Status Razem Dodatni (indeks PMR lub AI IgG) Ujemny (indeks PMR lub AI IgG) Niemożliwy do interpretacji (indeks PMR lub AI IgG) Brak LNB 19 1 (5,3%) 18 (94,7%) 0 (0,0%) Podejrzenie LNB 29 14 (48,3%) 15 (51,7%) 0 (0,0%) Prawdopodobieństwo LNB 36 24 (66,7%) 10 (27,8%) 2 (5,5%) Zdiagnozowana LNB 20 17 (85,0%) 2 (10,0%) 1 (5,0%) 9.5 Dokładność Dokładność wewnątrz-testowa (powtarzalność): W celu oceny powtarzalności, jedną próbkę ujemną i trzy dodatnie przebadano 30 razy w ramach jednej serii. Dla każdej próbki określono współczynnik (OD próbki / CO). Średni współczynnik, odchylenie standardowe (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) dla każdej z czterech próbek podano w poniższej tabeli: Dokładność wewnątrz-testowa (powtarzalność) N=30 Próbka ujemna Próbka dodatnia o Próbka dodatnia o Próbka dodatnia niskim mianie wysokim mianie Indeks (OD próbki / wartość odcięcia) Średnia 0.10 0.95 1.38 6.31 SD 0.007 0.082 0.116 0.134 %CV 6.0% 8.6% 8.4% 2.1% Powtarzalność między-testowa (odtwarzalność): W celu oceny odtwarzalności, każdą z czterech próbek (jedna ujemna i trzy dodatnie) badano w duplikatach, w dwóch seriach dziennie, przez 20 dni. Dla każdej próbki określono współczynnik (OD próbki / CO). Średni współczynnik, odchylenie standardowe (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) dla każdej z czterech próbek podano w poniższej tabeli: Powtarzalność między-testowa (odtwarzalność) N=80 Próbka negatywna Próbka pozytywna o Próbka pozytywna o Próbka pozytywna niskim mianie wysokim mianie Indeks (OD próbki / wartość odcięcia) Średnia 0.19 0.85 3.92 6.67 SD 0.032 0.115 0.335 0.650 %CV 17.3% 14.8% 8.4% 9.7% 10

9.6 Reakcje krzyżowe Z użyciem testu Platelia Lyme IgG przebadano 384 próbki krwi, których charakter stwarza potencjalnie ryzyko wystąpienia reakcji niespecyficznych. Wyniki oznaczeń podano w poniższej tabeli: Panel Liczba próbek Niejednoznaczne (1) Dodatnie % reakcji krzyżowych Kiła 83 4 1 1.3% (2) CMV 50 1 1 2.0% (2) EBV 22 1 0 0.0% Leptospiroza 15 1 1 7.1% (2) Malaria 20 1 1 5.3% (2) Przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) Przeciwciała heterofline (HAMA) 22 0 0 0,0% 10 0 0 0.0% Czynnik reumatoidalny 44 1 1 2.3% (2) HSV 30 0 0 0.0% Toksoplazmoza 38 0 0 0.0% Różyczka 10 0 0 0.0% Odra 10 0 0 0.0% Świnka 10 0 0 0.0% HIV 10 0 0 0.0% VZV 10 0 0 0.0% RAZEM 384 9 5 1.33% (1) Wyniki niejednoznaczne wykluczono z obliczeń reaktywności krzyżowej. (2) Różnica nieistotna w porównaniu do wartości oczekiwanych w rejonach endemicznych (Test Fisher a, p>0.05). Dwie surowice z panelu CMV oraz malaria uznane za dodatnie w teście Platelia Lyme IgG, zostały uznane za dodatnie także w komercyjnym teście EIA wykorzystywanym w Europie (oznakowanym znakiem CE), ale nie zostały potwierdzone metodą western-blot. Surowice z czynnikiem reumatoidalnym uznane za dodatnie w teście Platelia Lyme IgG, zostały uznane za dodatnie także w komercyjnym teście EIA wykorzystywanym w Europie (oznakowanym znakiem CE), a także metodą western-blot. Surowice z panelu leptospiroz uznane za dodatnie w teście Platelia Lyme IgG, zostały uznane za niejednoznaczne w komercyjnym teście EIA wykorzystywanym w Europie (oznakowanym znakiem CE), ale nie zostały potwierdzone metodą western-blot. Surowice z panelu kiły uznane za dodatnie w teście Platelia Lyme IgG, zostały uznane za ujemne w komercyjnym teście EIA wykorzystywanym w Europie (oznakowanym znakiem CE) i nie zostały potwierdzone metodą western-blot 10 OGRANICZENIA PROCEDURY Rozpoznanie zakażenia wywołanego przez Borrelia burgdorferi można postawić wyłącznie na podstawie kombinacji danych klinicznych i biologicznych. Wynik pojedynczego oznaczenia w kierunku przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi nie stanowi wystarczającego dowodu do postawienia rozpoznania zakażenia wywołanego przez Borrelia burgdorferi sensu lato. Jeżeli wynik badania serologicznego jest dodatni lub niejednoznaczny, zaleca się przebadanie próbki za pomocą metody potwierdzającej takiej jak Western-Blot (9). Rozpoznanie neuroboreliozy można postawić wyłącznie na podstawie kombinacji danych klinicznych i biologicznych swoistych dla pacjenta. Wyników oznaczenia PMR oraz ich interpretacji uzyskanych za pomocą niniejszego protokołu nie należy analizować pojedynczo i uznawać ich za wystarczający dowód do postawienia diagnozy. Obliczenie indeksu IgG za pomocą wzoru Reibera w niniejszym protokole jest nieprawidłowe, jeśli nie uwzględniono wszystkich danych biologicznych (Albuminy surowica, Albuminy PMR, Całkowite IgG Surowica, Całkowite Ig PMR, OD IgG Surowica i OD IgG PMR). Ważne jest także zastosowanie odpowiednich jednostek, jak opisano we wzorze powyżej. Niniejszy protokół zaadaptowano wyłącznie dla przeciwciał IgG przeciwko Borrelia. Nie oceniano go dla przeciwciał IgM przeciwko Borrelia, ani innych przeciwciał IgG. Niniejszy protokół zaadaptowany jest wyłącznie do badania PMR. Żadne inne płyny biologiczne (maziowe,...) nie były ewaluowane. 11

11 KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie odczynniki są przygotowywane zgodnie z naszym systemem jakości, począwszy od materiału wyjściowego aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do użytku, jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii odczynników. 12 LITERATURA 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. 2005. Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: 484-509. 2. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P. 1982. Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: 1317-1319. 3. Center for Disease Control and Prevention. 2004. Lyme disease United States, 2001-2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: 365-369. 4. Hubalek, Z., Halouzka, J. 1997. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: 951-957. 5. Reed, K. D. 2002. Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: 319-324. 6. Stanek, G., Strle, F. 2003. Lyme borreliosis. Lancet. 362: 1639-1647. 7. Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J. 1999. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: 633-653. 8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L. 2011. Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): 123-128. 9. Wilske, B. 2003. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3: 215-227. 10. Bednarova, J. 2006. Cerebrospinal-Fluid profile in neuroborreliosis and its diagnosis significance. Folia Microbiol. 51: 599-603. 11. Deisenhammer F., Bartos A., Egg R., Gilhus N.E., Giovannoni G., Rauer S., Sellebjerg F. 2006. Guidelines on Routine Cerebrospinal Fluid Analysis. Report from EFNS Task Force. Europ. Journ. of Neurol.. 12. Reiber H., Lange P. 1991. Quantification of Virus-Specific Antibodies in Cerebrospinal Fluid and Serum: Sensitive and Specific Detection of Antibody Synthesis in Brain. Clin. Chem. 37: 1153-1160. 12

13

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2015/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 883689 www.bio-rad.com 14