Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 IDENTYFIKACJA I WYSTĘPOWANIE ODGLEBOWYCH WIRUSÓW BURAKA CUKROWEGO W POLSCE NATASZA BORODYNKO, HENRYK POSPIESZNY Instytut Ochrony Roślin Władysława Węgorka 20, 60-318 Poznań N.Borodynko@ior.poznan.pl I. WSTĘP Pierwszą opisaną chorobą wirusową buraka cukrowego powodowaną przez patogena odglebowego była rizomania, której czynnikiem sprawczym jest wirus nekrotycznego żółknięcia nerwów buraka (Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV). Rizomania po raz pierwszy została opisana w latach pięćdziesiątych XX wieku we Włoszech (Canova 1959), była stwierdzana następnie w wielu krajach Europy, a także w Stanach Zjednoczonych i Azji. W Polsce rizomanię wykryto w latach osiemdziesiątych, początkowo na pojedynczych polach, a z czasem rejestrowano jej występowanie w nowych rejonach kraju. W latach osiemdziesiątych ubiegłego wieku, po raz pierwszy w Anglii opisano nowego odglebowego wirusa buraka cukrowego (Beet soil-borne virus, BSBV). Następnie, w ciągu kilku lat zarejestrowano jego występowanie w Holandii, Belgii, Szwecji, Finlandii, Niemczech i Francji oraz w Stanach Zjednoczonych. W Polsce wirus ten po raz pierwszy stwierdzony został w roku 2005 (Borodynko i wsp. 2006), na polu, na którym wcześniej stwierdzano rizomanię. Pierwsze badania nad tym wirusem wykazały, że występuje on na 2 polach w Wielkopolsce. Pierwotnie wirus ten reprezentowany był przez dwa szczepy: Ahlum i Wierthe, przy czym szczep Wierthe występował tylko w Niemczech. W roku 1998 uwzględniając zróżnicowanie genetyczne obydwóch szczepów, szczep Wierthe został podniesiony do rangi nowego wirusa wirus Q buraka (Beet virus Q, BVQ) (Koenig i wsp. 1998), a jego występowanie stwierdzono w całej Europie. W Polsce wirus ten nie był rejestrowany. Dotychczas w Polsce badania prowadzone były wyłącznie pod kątem szkodliwości wirusa rizomanii, ponieważ inne wirusy odglebowe buraka cukrowego nie były zidentyfikowane. Badania szklarniowe prowadzone w Niemczech wykazały, że BSBV również może powodować znaczne straty w plonie. Odglebowe wirusy buraka cukrowego przenoszone są przez tego samego wektora pierwotniaka Polymyxa betae Keskin. Cząstki wszystkich wirusów odglebowych buraka cukrowego mają taki sam kształt (pałeczki różnej długości), co nie pozwala na jakiekolwiek ich rozróżnienie w mikroskopie elektronowym.
56 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 Objawy powodowane przez te wirusy to m. in. przejaśnienie i przewężenie blaszek liściowych, zahamowanie wzrostu całych roślin oraz sporadycznie nekrotyzacja wiązek przewodzących. Zahamowany we wzroście jest również korzeń buraka cukrowego, a nadmiernie rozwijają się korzenie włośnikowe, co prowadzi do powstania tzw. brody. Wynikiem tego jest utrudnione pobieranie wody i składników pokarmowych, co prowadzi do ograniczenia wzrostu chorych roślin. Efektem infekcji wirusowej jest znaczne ograniczenie plonu korzeni oraz pogorszenie wartości przetwórczej buraków, spowodowane spadkiem zawartości cukru. Uprawa buraków odmian standardowych, wrażliwych na wirusa powodującego rizomanię, na silnie zainfekowanym polu może być całkowicie nieopłacalna. Pamiętać jednak należy, że opisane wyżej objawy mogą być powodowane przez szereg innych czynników (niedożywienie, susza, inne patogeny grzyby czy mątwik) i dlatego nie ma możliwości jednoznacznego identyfikowania chorób wirusowych na podstawie samych objawów na roślinach. Celem niniejszej pracy była identyfikacja nowego wirusa odglebowego wirusa Q buraka oraz określenie, w jakich rejonach Polski i w jakim nasileniu występują odglebowe wirusy buraka cukrowego. II. MATERIAŁY I METODY W latach 2005 2006, uwzględniając obszary uprawy buraka cukrowego (rys. 1) wytypowano miejsca, skąd w sumie zebrano 70 prób buraków (każda próba składała się z 5 korzeni), z różnych rejonów Polski. Zbierano zarówno próby wykazujące objawy chorobowe, typu: przejaśnienie nerwów bądź całych blaszek liściowych, zahamowanie wzrostu rośliny w porównaniu z innymi rosnącymi w pobliżu, brodatość korzeni czy nekrotyzacja wiązek przewodzących, jak i rośliny, na których objawy nie były wyraźnie widoczne. A B Rys. 1. A Obszary uprawy buraka cukrowego w Polsce, B lokalizacja pobranych prób Fig. 1. A Location of sugar beet growing areas in Poland, B location of sugar beet sampling
Odglebowe wirusy buraka cukrowego w Polsce 57 Do wykrywania wirusa rizomanii (BNYVV) zastosowano test DAS-ELISA oraz TAS-ELISA do wykrywania odglebowego wirusa buraka (BSBV) i wirusa Q buraka (BVQ). Z prób, które dały wynik pozytywny w teście ELISA izolowano całkowite RNA, które w reakcji odwrotnej transkrypcji przepisywano na cdna. Do syntezy pierwszej nici DNA używano ~1 µg RNA i hybrydyzowano go ze starterem oligod T 22 przez 10 minut w 65ºC. Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono przez 50 minut w 42ºC przy zastosowaniu odczynników firmy Fermentas. Do wykrywania wirusów odglebowych buraka oraz różnicowania typów wirusa rizomanii, stosowano mrt-pcr ze starterami dostępnymi w literaturze: Wykrywanie BNYVV, BSBV i BVQ (Meunier i wsp. 2003). Wstępna denaturacja cdna przez 3 minuty w 94ºC i reakcja łańcuchowa polimerazy: 35 cykli (denaturacja: 1 minuta w 94ºC, hybrydyzacja starterów: 1 minuta w 63ºC, wydłużanie nici: 1 minuta 30 sekund w 70ºC). Reakcję kończono cyklem 7 minut w 70ºC, a otrzymane produkty PCR rozdzielano w 1% żelu agarozowym w obecności markera wielkości DNA. DNA wybarwiano bromkiem etydyny. Różnicowanie typów A i B wirusa BNYVV (Ratti i wsp. 2005). Wstępna denaturacja cdna przez 3 minuty w 94ºC, i reakcja łańcuchowa polimerazy: 35 cykli (denaturacja: 45 sekund w 94ºC, hybrydyzacja starterów: 45 sekund w 54ºC, wydłużanie nici: 45 sekund w 70ºC). Reakcję kończono cyklem 7 minut w 70ºC, a otrzymane produkty rozdzielano jak wyżej. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Zastosowanie mrt-pcr oraz odpowiednich par starterów, pozwoliło na identyfikację zarówno BNYVV i po raz pierwszy opisanego w ubiegłym roku BSBV, jak i nowego w warunkach polski wirusa Q buraka (Beet virus Q, BVQ) (Borodynko 2006a) (rys. 2). Otrzymano produkty o wielkościach: 545 bp, 399 bp i 291 bp odpowiednio dla BNYVV, BSBV i BVQ. Produkty z żelu oczyszczono przy użyciu kitu OIAEX II firmy Qiagen i zsekwencjonowano. Polski izolat BVQ (nr rejestracyjny: DQ309444) wykazał 97% homologii nukleotydowej i 94% aminokwasowej w porównaniu z izolatem niemieckim (nr rejestracyjny AJ223596), dostępnym w Banku Genów. Stosując mrt-pcr stwierdzono również bardzo częste występowanie BVQ zarówno w odmianach standardowych, podatnych na wirusa rizomanii, jak i w odmianach tolerancyjnych na tego wirusa. Ponadto ustalono, że zgodnie z tym, co podaje literatura, również w Polsce BVQ zawsze występuje w kompleksie z BSBV lub z BNYVV, a nigdy nie występuje samodzielnie. Dalsze badania prowadzone nad BSBV wykazały, że występuje on nie tylko na terenie Wielkopolski, co stwierdzono w roku 2005, ale także w innych częściach kraju. Praktycznie był on stwierdzany we wszystkich rejonach uprawy buraka cukrowego w Polsce (rys. 3). W ogromnym nasileniu występowanie tego wirusa stwierdzono na północy kraju. Spośród 70 zebranych prób w 20 stwierdzono obecność BNYVV i w 29 BSBV w kompleksie z BVQ (rys. 3). Wielokrotnie notowano występowanie trzech wirusów w kompleksie, co często stwierdzano również w świecie. W związku z tym, że na znacznej większości pól wirusy występują razem, objawy opisywane kiedyś jako objawy rizomanii, obecnie nazywa się objawami rizomaniopodobnymi (rhizomania-like).
58 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 M K K 1 2 3 4 5 6 7 8 BNYVV BVQ Rys. 2. Elektroforeza produktów mrt-pcr w 1% żelu agarozowym: M marker Hyperladder IV (Bioline), K kontrola negatywna, 1 3, 7, 8 BNYVV, 1 4, 7, 8 BVQ Fig. 2. Electrophoretic mobility of mrt-pcr products in 1% agarose gel: M marker Hyperladder IV (Bioline), K negative control, 1 3, 7, 8 BNYVV, 1 4, 7, 8 BVQ A B Rys. 3. Występowanie wirusów odglebowych w Polsce: A BNYVV, B BSBV i BVQ Fig. 3. Occurrence of soil-borne viruses in Poland: A BNYVV, B BSBV and BVQ Ze względu na masowe występowanie BNYVV na południu Polski oraz na problemy związane z uzyskaniem odpowiedniej wielkości plonów, w rejonie tym wysiano w roku 2006 około 80% odmian tolerancyjnych na BNYVV. Dlatego też ilość zebranych tam prób była stosunkowo niska. Dużo więcej prób zebrano w Polsce Centralnej i Północnej i stwierdzono, że zdecydowanie częściej niż BNYVV występują tam BSBV i BVQ
Odglebowe wirusy buraka cukrowego w Polsce 59 (rys. 3). Obecność BNYVV w niewielkim nasileniu stwierdzono w Polsce Centralnej, m.in. w Ośrodku Doradztwa Rolniczego w Płońsku oraz na Kujawach. Otrzymane sekwencje wykazały bardzo duże podobieństwo do izolatów pozyskanych wcześniej. M K 1 2 3 K 4 5 M typ A BNYVV typ B BNYVV Rys. 4. Elektroforeza produktów mrt-pcr w 1% żelu agarozowym: M marker Hyperladder IV (Bioline), K kontrole negatywne, 1 3 BNYVV typ A, 4 5 BNYVV typ B Fig. 4. Electrophoretic mobility of mrt-pcr in 1% agarose gel: M marker Hyperladder IV (Bioline), K negative controls, 1 3 BNYVV type A, 4 5 BNYVV type B A Typ (Europa) B Typ P Typ A Typ (Asien) China, Japan: USA: Kazakhstan: Iran, Turkey: Rys. 5. Występowanie typów wirusa rizomanii w Europie Fig. 5. Occurrence of types of BNYVV in Europe
60 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 Do roku 2005, w literaturze światowej istniała informacja, mówiąca, że w Polsce występuje typ A wirusa rizomanii (Ratti i wsp. 2005). W trakcie badań nad wirusami odglebowymi buraka cukrowego, prowadzono równolegle badania pozwalające na różnicowanie typów BNYVV. W większości testowanych prób, we wszystkich rejonach Polski stwierdzano obecność typu A (rys. 4). Spośród zebranych prób tylko na dwóch polach w okolicach Ostęcin (Kujawsko-Pomorskie) i w okolicach Wrocławia, stwierdzono występowanie typu B wirusa rizomanii (Borodynko 2006b). Otrzymane produkty PCR (wielkości: 178 bp dla typu A i 324 dla typu B) zsekwencjonowano, a wszystkie sekwencje wykazały 100% homologii z sekwencjami dostępnymi w GenBanku (odpowiednio typ A i B BNYVV). Występowanie w Polsce BNYVV typu A jest o tyle ciekawe, że dotychczas zakładano przedostanie się do Polski wirusów odglebowych m.in. z Niemiec, gdzie występuje jedynie rizomania typu B. Dane mówiące o dużym rozpowszechnieniu w Polsce rizomanii typu A każą się zastanowić, czy wirus ten nie trafił do Polski np. z Holandii wraz z sadzonkami, czy cebulami sprowadzanych roślin, skontaminowanych wektorem. Możliwe jest również, że wirus ten trafił do Polski od naszych południowych sąsiadów (rys. 5). Badania były częściowo finansowane przez KBN w ramach projektu badawczego N31001731. Autorzy niniejszej pracy serdecznie dziękują panu dr Wacławowi Wiśniewskiemu z firmy KWS Polska, za pomoc w zbiorze prób buraków cukrowych. IV. LITERATURA Borodynko N. 2006a. First report of Beet virus Q in Poland. Plant Dis. 90, s. 1363. Borodynko N. 2006b. Types A and B of Beet necrotic yellow vein virus occur in Poland. Plant Dis. 90, s. 1261. Borodynko N., Hasiów B., Pospieszny H. 2006. First Report of Beet soilborne virus in Poland. Plant Dis. 90, s. 112. Canova A. 1959. Appunti di patologie della barbietola. Inf. Fitopatol. 9: 390 396. Koenig R., Pleij C.W.A., Beier C., Commandeur U. 1998. Genome properties of beet virus Q, a New furo-like virus from sugarbeet, determined from unpurified virus. J. Gen. Virol. 79: 2027 2036. Meunier A., Schmit J.F., Stas A., Kutluk N., Bragard C. 2003. Multiplex Reverse Transcription- PCR for Simultaneous Detection of Beet necrotic yellow vein virus, beet soilborne virus, and Beet Virus Q and Their Vector Polymyxa betae KESKIN on sugar Beet. Appl. Environ. Microb. April 2003: 2356 2360. Ratti C., Clover G.R.G., Autonell C.R., Harju V.A., Henry Ch.M. 2005. A multiplex RT-PCR assay capable of distinguishing beet necrotic Yellow vein virus types A and B. J. Virol. Methods 124: 41 47. NATASZA BORODYNKO, HENRYK POSPIESZNY IDENTIFICATION AND OCCURRENCE OF SOIL-BORNE VIRUSES OF SUGAR BEET IN POLAND SUMMARY Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) is the casual agent of sugar beet rhizomania and is tramsmitted by Polymyxa betae Keskin. In 2005 we have found another soil-borne virus in Poland Beet soil-borne virus (BSBV), which is distributed in most sugar-beet-growing areas in Poland.
Odglebowe wirusy buraka cukrowego w Polsce 61 In 2006, using specific primers and mrt-pcr we have found another soil-borne virus Beet virus Q. We have identified this virus in the field where BSBV and BNYVV had been previously identified. BVQ is always found in fields where BSBV and BNYVV are present. Sequence analysis of the Polish of BVQ indicated 97% nucleotide and 94% amino acid sequence identity with previously published sequence of BVQ. During the summer of 2006, we have found numerous samples of BSBV associated with BVQ, in the Northern and Central part of Poland. Out of 70 beet samples analysed, 20 gave positive reactions for BNYVV and 29 for BSBV and BVQ. mrt-pcr with two sets of primers was used to distinguish A and B types of BNYVV. In Poland, we mainly have type A. Type B of BNYVV was found in samples from two fields (one in Northern an one in Southern Poland. A 178% bp of PCR product had 100% sequences identity with all BNYVV type B sequences. A 324 bp of PCR product had 100% sequences identity with all BNYVV type A sequence. Key word: Beet necrotic yellow vein virus, Beet soil-borne virus, Beet virus Q, types A and B of BNYVV, occurrence, identification, ELISA, mrt-pcr