KONSTRUKCJA EFEKTYWNYCH BIOCENOZ DEGRADUJĄCYCH FORMALDEHYD I JEGO POCHODNE W UCIĄśLIWYCH ŚCIEKACH PRZEMYSŁOWYCH*

Biotechnologia 2(1-2) 2003, 91-103 KONSTRUKCJA EFEKTYWNYCH BIOCENOZ DEGRADUJĄCYCH FORMALDEHYD I JEGO POCHODNE W UCIĄśLIWYCH ŚCIEKACH PRZEMYSŁOWYCH* Paweł Kaszycki, Kamila Czechowska, Przemysław Petryszak, Henryk Kołoczek Streszczenie. W pracy badano procesy biologicznej degradacji formaldehydu i jego pochodnych, obecnych w ściekach przemysłu meblarskiego. Skonstruowano biocenozę składającą się z bakteryjnych mikroorganizmów autochtonicznych oraz droŝdŝy metylotroficznych. Wykazano, Ŝe wprowadzenie metylotrofów do toksycznych ścieków stwarza warunki rozwoju Ŝycia biologicznego i efektywnej biodegradacji róŝnorodnych zanieczyszczeń organicznych. Zaproponowano koncepcję stworzenia aktywnego biopreparatu, przeznaczonego do oczyszczania ścieków przemysłowych zawierających letalne stęŝenia formaldehydu, w oparciu o mieszane biocenozy pro- i eukariotyczne. Słowa kluczowe: formaldehyd, ścieki przemysłowe, droŝdŝe metylotroficzne, biodegradacja WSTĘP SkaŜenie bio- i geosfery formaldehydem (Fd) oraz produktami jego połączeń chemicznych stanowi niezwykle powaŝne zagroŝenie ekologiczne pomimo prób opracowania i wdraŝania alternatywnych, bezodpadowych technologii syntez chemicznych. Związek ten zajmuje wysoką pozycję na liście substancji uciąŝliwych dla środowiska [Dz.Ustaw z 31 grudnia 1997], gdzie moŝna go zidentyfikować w ponad połowie z 20 głównych grup odpadów, w tym w szeregu grup odpadów niebezpiecznych. Spośród substancji organicznych obecnych w ściekach przemysłowych formaldehyd naleŝy do najbardziej toksycznych, co wiąŝe się z jego duŝą reaktywnością chemiczną, a zwłaszcza silnymi własnościami redukującymi [Walker 1964, Bardana i Montanaro 1991, Chang i Gershwin 1992, Karta charakterystyki 1993]. Fd w postaci monomerycznej tworzy trwałe połączenia z grupami aminowymi białek oraz kwasami nukleinowymi, a takŝe łatwo wchodzi w reakcję z naturalnymi składnikami występującymi w środowisku. Łączy się on równieŝ z wieloma substratami w procesach technologicznych róŝnych gałęzi przemysłu, powodując powstawanie uciąŝliwych produktów ubocznych, jak np. w syntezach chemicznych, petrochemii, produkcji nawozów, tworzyw sztucznych, * Praca finansowana z grantu KBN 3 P04G 058 23

92 P. Kaszycki i in. farb, lakierów, jak równieŝ płyt wiórowych, laminatów, Ŝywic syntetycznych oraz produkcji papierów i klejów. W szczególności, jako odpad pochodzący z produkcji płyt wiórowych i laminatów, formaldehyd moŝe występować zarówno w formie monomerycznej ( Fd wolny ), jak i w połączeniach ( Fd związany ), tworząc Ŝywice formaldehydowo-melaminowe, mocznikowe i fenolowe. StęŜenia Fd pojawiające się w ściekach wahają się w bardzo szerokich granicach: od ok. 100 mg/dm 3 aŝ do ok. 10000 mg/dm 3 i więcej, jak np. w przypadku produkcji Ŝywic syntetycznych oraz w przemyśle meblarskim [Biczysko 1969, BoŜko i Grabińska-Łoniewska 1973, Apolinarski 1990]. Do oczyszczania ścieków zawierających duŝe ładunki Fd i jego pochodnych stosuje się niekiedy metody fizykochemiczne, które jednakŝe są kosztowne, a często charakteryzują się niską wydajnością albo wręcz okazują się nieskuteczne. Obecnie, bardziej uzasadnione wydaje się być wykorzystanie nowoczesnych metod biotechnologii środowiskowej, tanich i wysoce efektywnych w biologicznym rozkładzie Fd przez drobnoustroje. W tym celu prowadzone są prace nad konstrukcją wyspecjalizowanych i adaptowanych biocenoz o aktywnościach ukierunkowanych pod kątem specyficznych zanieczyszczeń [Tyszka i in. 1998]. Biodegradacja egzogennego formaldehydu moŝliwa jest dzięki wykorzystaniu potencjału enzymatycznego mikroorganizmów metylotroficznych [BoŜko i Grabińska- -Łoniewska 1973], zdolnych do przyswajania prostych związków jednowęglowych, takich jak metanol, Fd, kwas mrówkowy [Michalik 1975]. DroŜdŜe metylotroficzne, wykorzystujące enzymy tzw. szlaku metylotroficznego [Gleeson i Sudbery 1988, Sibirny i in. 1988], wydają się być szczególnie przydatne do biologicznego oczyszczania ścieków zawierających formaldehyd [Tyszka i in. 1999, Malec i in. 1997, Kaszycki i Kołoczek 2000, 2002]. MoŜna je zastosować zarówno jako niezaleŝne elementy procesu oczyszczania (biologiczne filtry w oparciu o monokultury droŝdŝowe), jak i składniki złoŝonych, specjalnie skonstruowanych, aktywnych biocenoz drobnoustrojów. Celem niniejszej pracy było określenie moŝliwości efektywnej biodegradacji zanieczyszczeń formaldehydem i jego pochodnymi w ściekach przemysłowych, cechujących się szczególną uciąŝliwością, pochodzących z przemysłu meblarskiego znaczącego krajowego producenta mebli, płyt wiórowych i laminatów. MATERIAŁY I METODY Ścieki przeznaczone do badań, pochodzące z dwóch strumieni technologicznych zakładu produkcyjnego, charakteryzowały się duŝą zmiennością ładunku zanieczyszczeń oraz znaczną heterogenicznością składu chemicznego. W skład pierwszego (ściek nr 1) wchodziły komponenty celulozowo-papiernicze, pochodne klejów, melamina i odcieki z impregnarek. Próba oznaczana dalej jako ściek nr 2 była ściekiem pochodzącym z linii produkcji wydziału formaliny technicznej. Jego główne obciąŝenie stanowiła monomeryczna forma Fd, rozpuszczalniki, kleje oraz mocznik. Wybrane parametry charakteryzujące ścieki zostały podane w tabeli 1. Materiał biologiczny, warunki hodowli mikroorganizmów oraz warunki inkubacji z próbami ścieków Analizy toksyczności ścieków oraz badania biodegradacji zanieczyszczeń prowadzono z wykorzystaniem szczepów droŝdŝy metylotroficznych gatunku Hansenula Acta Sci. Pol.

Konstrukcja efektywnych biocenoz... 93 polymorpha, wchodzących w skład kolekcji drobnoustrojów Zakładu Biochemii AR w Krakowie. Ze szczepu wyjściowego (typ dziki), na drodze naturalnej selekcji oraz środowiskowej mutagenezy pozyskano szereg wyspecjalizowanych szczepów o zwiększonej oporności na formaldehyd i podwyŝszonym potencjale biodegradacji Fd oraz jego pochodnych, m.in. szczep H. polymorpha mutant D-14 [Tyszka i in. 1999]. Tabela 1. Ogólna charakterystyka badanych ścieków Table 1. General characteristics of the studied wastewaters Nr próby Sample No. Ściek nr 1 Wastewater#1 Ściek nr 2 Wastewater#2 Fd wolny Fd free [mg/l] FD CAŁK. Fd total [mg/l] ChZT-Mn COD-Mn [mg O 2/l] ph 891 2 419 5 600 4,31 Obecność bakterii Occurence of bacteria Ściek surowy: brak Ŝycia biologicznego* 9 977 15 081 24 400 9,45 rak *warunki rozwoju mikroorganizmów autochtonicznych opisano w Wynikach * growth conditions for autochthonous microorganisms have been described in the Results Opis Description Biała, lepka, bezwonna, szybko sedymentująca ciecz. Obecność substancji włóknistych. Brązowa ciecz o intensywnym zapachu mocznika i formaldehydu. Hodowle prowadzono w temp. 30 ºC, w objętościach 50 100 ml w kolbach o poj. 300 ml, przy ciągłym wytrząsaniu (150 250 rpm), bez dodatkowego napowietrzania, bez symulowanego przepływu ścieków. Próby ścieków w szeregu wariantach rozcieńczeń zaszczepiano czystymi kulturami droŝdŝy, znajdującymi się w fazie logarytmicznego wzrostu o gęstości ok. 8x10 7 komórek/ml. Kultury droŝdŝy metylotroficznych wykorzystywane w doświadczeniach hodowano jałowo w optymalnych podłoŝach wzrostowych, zawierających 0.2% pepton kazeinowy (ICN Biomedicals), 0.2% ekstrakt droŝdŝowy (ICN Biomedicals), roztwór soli mineralnych (3 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, 0.2 g/l CaCl 2. 5 H 2 O, 0.5 g/l KH 2 PO 4 i 0.3 g/l MgSO 4. 7H 2 O) oraz 2% (v/v) metanol jako jedyne źródło węgla. Ogólny poziom biomasy droŝdŝy oznaczano metodą turbidymetryczną poprzez pomiar gęstości optycznej zawiesin przy długości fali 540 nm. Testy toksyczności ścieków prowadzono ponadto z wykorzystaniem nieadaptowanej bakteryjnej biocenozy o wyjściowej gęstości ok. 10 9 komórek/ml, utworzonej z kilkudziesięciu gatunków i szczepów bakteryjnych [Kaszycki i in. 2001a]. Liczebność bakterii i droŝdŝy określano metodą płytkową, dokonując posiewów mikrobiologicznych odpowiednich rozcieńczeń zawiesiny drobnoustrojów na szalki Petri ego, zawierające optymalne podłoŝe hodowlane zestalone 2% agarem. Równolegle do testów ilościowych, prowadzono obserwacje mikroskopowe biocenoz. W eksperymentach sporządzano kaŝdorazowo odpowiednie próby kontrolne, obejmujące hodowle mikroorganizmów w nieobecności ścieków lub teŝ obserwacje ścieków niezaszczepionych. Pomiary stęŝeń formaldehydu i wartości ChZT Próby ścieków do analiz poddawano wirowaniu na wirówce laboratoryjnej MPW-2 (10000 rpm, 3 min) w celu oddzielenia biomasy oraz cząstek stałych. Biotechnologia 2(1-2) 2003

94 P. Kaszycki i in. Ze względu na obecność w ściekach formaldehydu w postaci wolnej (monomerycznej) oraz w postaci szeregu jego chemicznych połączeń, stęŝenie Fd oznaczano równolegle dwiema metodami: formaldehyd całkowity metodą z kwasem chromotropowym, według Polskiej Normy PN-76 Z-04045/04 [1985], bez uprzedniej destylacji próbek; absorbancję próbek określano przy długości fali 570 nm; formaldehyd wolny metodą z acetyloacetonem (metoda Nash'a [1953 ], według opisu American Society for Testing and Materials [1992]), bez uprzedniej destylacji próbek; absorbancję próbek określano przy długości fali 412 nm. Chemiczne zapotrzebowanie tlenu (ChZT) w próbach oznaczano w celu stwierdzenia ogólnego ładunku zanieczyszczeń oraz podatności skaŝeń na biodegradację. Ze względu na znaczną heterogeniczność chemiczną prób ścieków przeznaczonych do badań, wysoką zawartość formaldehydu i lotnych związków organicznych (w tym fenoli) zmiany ChZT mierzono metodą nadmanganianową (utlenialność, ChZT-Mn). Oznaczanie chemicznego zapotrzebowania tlenu (ChZT-Mn) metodą nadmanganianową wykonano zgodnie z Polską Normą PN-85/C-04578/02 [1986]. Do kolb stoŝkowych o pojemności 300 ml odmierzano 100 ml badanej próby, dodawano 10 ml kwasu siarkowego (1:3) i 10 ml nadmanganianu potasu (0,01N). Kolby umieszczano we wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Następnie dodawano 10 ml szczawianu sodowego (0,01N) i miareczkowano na gorąco nadmanganianem potasu. Identycznie postępowano z próbami ślepymi. WYNIKI I DYSKUSJA Testy przeŝywalności biocenoz bakteryjnych (początkowa gęstość biomasy: 10 9 komórek/ml) w obecności analizowanych ścieków wykazały toksyczny wpływ obu prób na drobnoustroje. Ściek nr 1 przejawiał silny efekt toksyczny w stęŝeniu 50%, powodując obniŝenie liczebności bakterii w stosunku do próby kontrolnej o ok. 6 rzędów wielkości w czasie 48 godzin. Ściek nr 2 był natomiast letalny dla bakterii juŝ w stęŝeniu 5%. W przypadku biocenozy droŝdŝowej H. polymorpha (początkowa gęstość zawiesiny: 8x10 7 komórek/ml, rys. 1) ściek nr 2 wywierał silny efekt toksyczny przy stęŝeniach znacznie wyŝszych, i tak np. w stęŝeniu wynoszącym 7% 24-godzinna inkubacja hodowli droŝdŝy nie prowadziła do znaczącego spadku przeŝywalności, a istotne, ok. 100-krotne obniŝenie liczebności Ŝywych komórek obserwowano dopiero po 72 godzinach. W ścieku nr 1 o stęŝeniu 50% liczebność Ŝywych komórek droŝdŝy utrzymywała się na początkowym poziomie; co więcej, juŝ po 24 godzinach odnotowano spontanicznie rozwijającą się autochtoniczną florę bakteryjną, osiągającą po 72 godz. gęstość przekraczającą 10 9 komórek/ml. Prawdopodobnie, rozwój tych autochtonicznych mikroorganizmów, występujących w surowym ścieku w formie przetrwalników, był moŝliwy w wyniku zmniejszenia się stęŝenia monomerycznego formaldehydu w środowisku hodowli na skutek jego biologicznego rozkładu przez droŝdŝe metylotroficzne (patrz: tekst poniŝej oraz rys. 3). PowyŜszą tezę potwierdzają obserwacje spontanicznego rozwoju mikroflory autochtonicznej w ścieku nr 1 rozcieńczonym 10-krotnie (rys. 2), w którym poziom formaldehydu spadał poniŝej progu toksyczności wobec bakterii (ok. 40 mg/l). Wynik ten jest zgodny z danymi innych autorów wskazujących na zahamowanie rozwoju flory bakte- Acta Sci. Pol.

Konstrukcja efektywnych biocenoz... 95 ryjnej i negatywny wpływ na osad czynny przy stęŝeniach Fd rzędu setek mg/l [Biczysko 1969, Sawiniak i Sikora 1978, Apolinarski 1990, Kaszycki i Kołoczek 2002, Karta charakterystyki 1993]. Dynamiczny rozwój autochtonicznej biocenozy bakteryjnej wskazuje równocześnie, Ŝe bakterie wykorzystywały do swojego wzrostu zanieczyszczenia obecne w ścieku, w tym równieŝ formaldehyd wolny. Znalazło to potwierdzenie w wynikach biodegradacji zaprezentowanych w zestawieniu w tabeli 2. NaleŜy jednak podkreślić, Ŝe proces biooczyszczania przebiegał w ścieku silnie (10-krotnie) rozcieńczonym i prowadzenie go w skali technicznej spowodowałoby znaczny wzrost nakładów ekonomicznych. Rys. 1. Testy toksyczności ścieków wykorzystanych w badaniach wobec hodowli droŝdŝy metylotroficznych H. polymorpha D14. Liczebność komórek: w próbie kontrolnej (słupki jasne), w ścieku nr 1 o stęŝeniu 50% (słupki ciemnoszare), w ścieku nr 2 o stęŝeniu 7% (słupki jasnoszare) Fig. 1. Wastewater toxicity tests over the culture of methylotrophic yeast H. polymorpha D14. Number of cells per ml: in the control sample (light bars), in the wastewater no.1. at 50% concentration (dark grey bars), and in the wastewater no.2. at 7% concentration (light grey bars) Analiza toksyczności ścieków pozwoliła na określenie optymalnych warunków rozcieńczeń prób w celu poddania ich biologicznemu oczyszczaniu z wykorzystaniem droŝdŝy metylotroficznych. I tak, stęŝenia ścieków w dalszych testach biodegradacji zanieczyszczeń ustalono na 50% i 7%, odpowiednio dla ścieku 1 oraz 2. Biotechnologia 2(1-2) 2003

96 P. Kaszycki i in. Rys. 2. Wzrost liczebności bakterii autochtonicznych w ścieku nr 1 (stęŝenie: 10%) Fig. 2. Growth of autochthonous bacteria number in wastewater no. 1 (concentration: 10%) Po zaszczepieniu ścieku nr 1 (stęŝenie 50%) hodowlą H. polymorpha D14 obserwowano dynamiczną, trwającą ok. 24 godziny, fazę zaniku Fd w postaci monomerycznej (rys. 3.A). NaleŜy nadmienić, Ŝe podobną kinetykę biodegradacji Fd wolnego stwierdzono we wcześniejszych pracach autorów, obejmujących badania biologicznego rozkładu Fd i jego połączeń chemicznych w ściekach modelowych i rzeczywistych [Kaszycki i Kołoczek 2000, 2002, Kaszycki i in. 2001]. W przypadku Fd całkowitego (Fd wolny + związany) kinetyka jego zaniku wykazuje charakterystyczny dwufazowy przebieg (rys. 3.A), który moŝna wyjaśnić szybką biodegradacją formy monomerycznej oraz następującym po niej długotrwałym i powolnym biologicznym utlenianiu połączeń chemicznych Fd. Pomimo znacznego wydłuŝenia tego drugiego procesu fakt, iŝ stosunkowo trudno degradowalne pochodne Fd podlegały rozkładowi przez mikroorganizmy w warunkach prowadzonego testu, ma doniosłe znaczenie z punktu widzenia moŝliwości poszukiwania rozwiązania problemu uciąŝliwych ścieków przemysłowych. Dotychczas, w szeregu pracach zwracano uwagę na trudności związane z przeprowadzeniem efektywnej biodegradacji Fd w postaci związanej chemicznie [Apolinarski 1990, Sosnowska 1996, Kaszycki i Kołoczek 2002]. Jak wspomniano wcześniej, spadek stęŝenia Fd wolnego w ścieku umoŝliwił proliferację bakterii autochtonicznych. W efekcie, róŝnorodne zanieczyszczenia obecne w ścieku 2 poddane były biooczyszczaniu przez nowo wytworzoną, złoŝoną biocenozę, utworzoną z bakterii autochtonicznych i droŝdŝy metylotroficznych. Taka mieszana biocenoza wykazywała stabilność składu w czasie trwania testów (do 200 godzin). Mikrofotografię biocenozy aktywnej w ścieku nr 1 przedstawiono na rysunku 4. Spadek ogólnego ładunku zanieczyszczeń w ścieku mierzony poziomem ChZT-Mn zilustrowano na rysunku 3B. Acta Sci. Pol.

Konstrukcja efektywnych biocenoz... 97 Tabela 2. Porównanie efektywności degradacji zanieczyszczeń w ściekach poddanych biooczyszczaniu Table 2. Comparison of contaminant degradation efficiency in biologically treated wastewater samples Ściek nr 1 / Wastewater # 1 StęŜenie: 10% / Concentration: 10% Biocenoza aktywna: mikroorganizmy autochtoniczne Active biocenosis: autochthonous microorganisms Czas [d] / Time [d] 0 8 Efektywność biodegradacji Biodegradation efficiency [%] Fd wolny / Fd free [mg/l] 40,5 4,5 88,9 Fd całkowity / Fd total [mg/l] 205 140,6 31,4 ChZT Mn / COD-Mn [mg O 2/l] 224 176 21,4 Ściek nr 1 / Wastewater # 1 StęŜenie: 50% / Concentration: 50% Biocenoza aktywna: mikroorganizmy autochtoniczne wzbogacone droŝdŝami metylotroficznymi H.polymorpha Active biocenosis: autochthonous microorganisms bioaugmented with methylotrophic yeasts H.polymorpha Fd wolny / Fd free [mg/l] 302 5 98,3 Fd całkowity / Fd total [mg/l] 1 209 480 60,3 ChZT Mn / COD-Mn [mg O 2/l] 1 208 688 43,0 Ściek nr 2 / Wastewater #2 StęŜenie: 7% / Concentration: 7% Biocenoza aktywna: droŝdŝe metylotroficzne H.polymorpha D14 / Active biocenosis: methylotrophic yeasts H. polymorpha D14 Fd wolny / Fd free [mg/l] 575 28 95,1 Fd całkowity / Fd total [mg/l] 999 264 73,6 ChZT Mn / COD-Mn [mg O 2/l] 1 248 720 42,3 Porównanie efektów biodegradacji w ścieku nr 1 w sumarycznym zestawieniu w tabeli 2. pokazuje spektakularny wzrost efektywności procesu w przypadku wykorzystania konsorcjum bakteryjno-droŝdŝowego, sugerując synergistyczne działanie kokultury mikroorganizmów pro- i eukariotycznych. We wcześniejszych pracach autorów wskazywano na korzyści wynikające z zastosowania biocenoz mieszanych, konstruowanych na bazie odpowiednio wyselekcjonowanych i adaptowanych drobnoustrojów, w celu optymalizacji i ukierunkowanego rozkładu szczególnie uciąŝliwych zanieczyszczeń [Kaszycki i in. 1997, Tyszka i in. 1998]. Wykazano równieŝ moŝliwość wytworzenia złoŝonych biocenoz aktywnych w środowisku ścieków przemysłowych, w oparciu o osad czynny oczyszczalni ścieków oraz zintegrowane z nim droŝdŝe metylotroficzne [Kaszycki i in. 1997, Kaszycki i Kołoczek 2002]. W przypadku ścieku nr 2, wobec jego silnie toksycznego oddziaływania na drobnoustroje oraz wobec stwierdzonego braku przejawów Ŝycia biologicznego, testy biodegradacji zanieczyszczeń prowadzono wyłącznie po zaszczepieniu rozcieńczonych prób Biotechnologia 2(1-2) 2003

98 P. Kaszycki i in. Rys. 3. Biodegradacja Fd oraz redukcja całkowitego ładunku zanieczyszczeń w ścieku nr 1 (stęŝenie: 50%) przez mieszaną biocenozę, utworzoną z drobnoustrojów autochtonicznych wzbogaconych kulturą droŝdŝy metylotroficznych H. polymorpha D14 Fig. 3. Formaldehyde biodegradation and total contaminant load reduction in wastewater sample no. 1 (concentration: 50%) by the mixed biocenosis of autochthonous microorganisms bioaugmented with methylotrophic yeast H. polymorpha D14 (stęŝenie 7%) hodowlą droŝdŝy H. polymorpha. Obserwacje kinetyczne spadku poziomu Fd wolnego, całkowitego oraz ChZT przedstawiono na rysunku 5, a zestawienie wyników oczyszczania ścieku w ciągu 8 dni inkubacji z droŝdŝami zamieszczono w tabeli 2. Przebieg procesu biologicznego utleniania zanieczyszczeń wykazuje szereg analogii do kinetyk uzyskanych w przypadku ścieku 1 (rys. 3). Zaobserwowane znaczące obniŝenie stęŝenia Fd oraz całkowitego ładunku zanieczyszczeń wskazują na duŝy Acta Sci. Pol.

Konstrukcja efektywnych biocenoz... 99 potencjał metaboliczny droŝdŝy metylotroficznych, zastosowanych w postaci monokultury, umoŝliwiający rozkład róŝnorodnych składników ścieku 2, w tym Fd wolnego oraz związanego. W kolejnym etapie badań przewiduje się test biologicznego rozkładu zanieczyszczeń za pomocą biocenozy utworzonej z wcześniej wyizolowanych autochtonów, obecnych w ścieku nr 1, wzbogaconych o metylotrofy eukariotyczne (H.polymorpha). Rys. 4. Mikroskopowy obraz mieszanej biocenozy utworzonej z bakterii autochtonicznych i droŝdŝy metylotroficznych H. polymorpha D14 podczas biooczyszczania ścieku nr 1 o stęŝeniu 50% (5. dzień trwania procesu) Fig. 4. Microscopic image of mixed biocenosis consisting of autochthonous bacteria bioaugmented with methylotrophic yeast H. polymorpha D14 (5 th day of treatment of wastewater no.1 at 50% concentration) Badane ścieki, a w szczególności próba nr 2, stanowią zagroŝenie dla osadów czynnych i nie nadają się do bezpośredniego oczyszczania w biologicznych oczyszczalniach ścieków. Uzyskane wyniki stwarzają moŝliwość rozwiązania problemu ścieków nr 1 i 2 metodą biologiczną, za pomocą wyspecjalizowanych osadów czynnych, pracujących jako niezaleŝny, wstępny etap oczyszczania. Ostatecznym celem prowadzonych prac jest rozwiązanie problemu ścieków o duŝej uciąŝliwości w taki sposób, aby strumienie ścieków poprodukcyjnych po wstępnym podczyszczeniu moŝna było odprowadzić do zbiorowej oczyszczalni komunalnej. W podsumowaniu naleŝy stwierdzić, Ŝe Fd w postaci wolnej (monomerycznej), aczkolwiek silnie trujący wobec organizmów Ŝywych, jest jednocześnie znacznie Biotechnologia 2(1-2) 2003

100 P. Kaszycki i in. łatwiej biologicznie rozkładalny. Z drugiej strony natomiast, pochodne Fd, choć zazwyczaj mniej toksyczne, trudniej podlegają biodegradacji i poprzez wydłuŝenie procesu biooczyszczania stanowią uciąŝliwe składniki ścieków poprodukcyjnych. Wyniki niniejszej pracy wskazują nie tylko na moŝliwość, ale i na konieczność tworzenia konsorcjów drobnoustrojów zawierających przedstawicieli róŝnych grup mikroorganizmów w celu zintensyfikowania redukcji ładunku zanieczyszczeń w ściekach zawierających uciąŝliwe i toksyczne odpady. Jednocześnie, wprowadzenie do toksycznych ścieków droŝdŝy metylotroficznych stwarza warunki rozwoju Ŝycia biologicznego, zapewniając powstanie biocenozy o duŝej bioróŝnorodności. Prowadzi to do zwiększenia potencjału biologicznego i wzrostu tolerancji wobec toksycznych i heterogenicznych ścieków przemysłowych. Rys. 5. Biodegradacja Fd oraz redukcja całkowitego ładunku zanieczyszczeń w ścieku nr 2 (stęŝenie: 7%), zaszczepionym kulturą droŝdŝy metylotroficznych H. polymorpha D14 Fig. 5. Formaldehyde biodegradation and total contaminant load reduction in wastewater sample no. 2 (concentration: 7%) inoculated with methylotrophic yeast H. polymorpha D14 Acta Sci. Pol.

Konstrukcja efektywnych biocenoz... 101 Obecność u droŝdŝy metylotroficznych aktywności biochemicznych ukierunkowanych na rozkład połączeń chemicznych Fd stwarza moŝliwość podjęcia prac nad intensyfikacją biodegradacji Fd związanego. Zaobserwowane w przypadku ścieku 1 współdziałanie mikroorganizmów autochtonicznych sugeruje perspektywę konstrukcji osadu czynnego zintegrowanego z mikroorganizmami droŝdŝowymi. Tak skonstruowany osad pozwoli wyeliminować zagroŝenie spowodowane obecnością toksycznych form Fd w ściekach i umoŝliwi doprowadzenie ich do komór napowietrzania oczyszczalni komunalnych. Opisane w niniejszej pracy wyniki dowodzą równieŝ, Ŝe moŝliwe będzie skonstruowanie nowego biopreparatu, efektywnie degradującego zanieczyszczenia formaldehydowe w ściekach przemysłowych pochodzących z róŝnorodnych źródeł. Biopreparat taki powstanie na bazie wyizolowanych i namnoŝonych autochtonów, wzbogaconych o kultury droŝdŝy metylotroficznych. WNIOSKI 1. Ścieki poprodukcyjne przemysłu meblarskiego, zawierające formaldehyd oraz jego chemiczne połączenia, wykazują toksyczny wpływ na biocenozy bakteryjne i stanowią istotne zagroŝenie dla osadów czynnych biologicznych oczyszczalni ścieków. Toksycznośćścieków wobec kultur droŝdŝy metylotroficznych jest znacznie mniejsza. 2. Badane ścieki, po ich odpowiednim rozcieńczeniu, mogą zostać poddane biologicznemu oczyszczaniu za pomocą monokultur droŝdŝy metylotroficznych lub teŝ mieszanych biocenoz bakteryjno-droŝdŝowych, wykorzystując synergistyczne działanie drobnoustrojów. 3. Wprowadzenie metylotrofów do środowiska ścieków stwarza warunki rozwoju Ŝycia biologicznego i efektywnej biodegradacji róŝnorodnych zanieczyszczeń organicznych. 4. Biodegradacja Fd całkowitego zawartego w ściekach ma charakter dwufazowy: po fazie szybkiego utlenienia formy monomerycznej Fd następuje wydłuŝony proces rozkładu połączeń chemicznych Fd. PIŚMIENNICTWO American Society for Testing and Materials; 1992. Proposed test method for formaldehyde in water; ASTM D-19 Proposal P 216. Apolinarski M., 1990. Badania procesu biologicznego oczyszczania ścieków toksycznych z produkcji płyt wiórowych laminowanych. Gaz, Woda i Technika Sanitarna 12, 254 257. Bardana E.J. Jr., Montanaro A., 1991. Formaldehyde: an analysis of its respiratory, cutaneous, and immunologic effects. Ann. Allergy 66, 441 452. Biczysko J., 1969. Badania nad oczyszczaniem ścieków z produkcji Ŝywic fenolowoformaldehydowych. Przemysł Chemiczny 48, 10, 614 617. BoŜko L., Grabińska-Łoniewska A., 1973. Biodegradacja formaldehydu. Postępy Mikrobiologii 12, 119 137. Chang C.C., Gershwin M.E., 1992. Perspectives on formaldehyde toxicity: separating fact from fantasy. Regul. Toxicol. Pharmacol. 16, 150 160. Biotechnologia 2(1-2) 2003

102 P. Kaszycki i in. Dziennik Ustaw z dn. 31 grudnia 1997. Rozporządzenie Ministra Ochrony Środowiska, Zasobów Naturalnych i Leśnictwa z dnia 24 grudnia 1997 r. w sprawie klasyfikacji odpadów. Gleeson M.A., Sudbery P.E., 1988. The methylotrophic yeasts. Yeast 4, 1 15. Karta charakterystyki substancji niebezpiecznych nr 0014, Centralny Instytut Ochrony Pracy, Warszawa 1993. Kaszycki P., Kołoczek H., Malec P., 1997. MoŜliwości zastosowania mikroorganizmów, wykorzystujących rzadko spotykane szlaki metaboliczne, w biodegradacji toksycznych składników ścieków przemysłowych. Mikrobiologia Medycyna 1: 3 8. Kaszycki P., Krzemińska H., Malec P., Kołoczek H., 1999. Metody współczesnej biotechnologii w procesach biodegradacji zanieczyszczeń. 3. Biologiczna utylizacja formaldehydu w ściekach przemysłowych przez droŝdŝe metylotroficzne. Ekologia i Technika 2, 35 38. Kaszycki P., Kołoczek H., 2000. Formaldehyde and methanol biodegradation with the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha in a model wastewater system. Microbiological Research 154, 289 296. Kaszycki P., Tyszka M., Malec P., Kołoczek H., 2001. Formaldehyde and methanol biodegradation with methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. An application to real wastewater treatment. Biodegradation 12, 169 177. Kaszycki P., Szumilas P., Kołoczek H., 2001a. Biopreparat przeznaczony do likwidacji środowiskowych skaŝeń węglowodorami i ich pochodnymi. InŜynieria Ekologiczna 4, Biopreparaty w ochronie i uŝytkowaniu środowiska, 15 22. Kaszycki P., Kołoczek H., 2002. Biodegradation of formaldehyde and its derivatives in industrial wastewater with methylotrophic yeast Hansenula polymorpha and with the yeastbioaugmented activated sludge. Biodegradation 13, 2, 91 99. Malec P., Kaszycki P., Kołoczek H., 1997. Biotechnologia osadu czynnego: wykorzystanie droŝdŝy metylotroficznych w procesie biologicznego utleniania związków jednowęglowych oraz niektórych ich połączeń. Mikrobiologia Medycyna 3: 17 21. Michalik J., 1975. Metanol w metaboliźmie drobnoustrjów. Post. Mikrobiologii 14, 93 109. Nash T., 1953. The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsch reaction. Biochemistry 55, 416 421. Polski Komitet Normalizacji i Miar, 1985. Oznaczanie formaldehydu na stanowiskach pracy metodą kolorymetryczną z kwasem chromotropowym. PN-76 Z-04045/04. Polski Komitet Normalizacji, Miar i Jakości, 1986. Badania zapotrzebowania tlenu i zawartości węgla organicznego. Oznaczanie chemicznego zapotrzebowania tlenu (ChZT) metodą nadmanganianową. PN-85/C-04578/02. Sawiniak W., Sikora J.; 1978. Badania nad oczyszczaniem ścieków z produkcji formaldehydu i ftalanów. Przemysł Chemiczny 57, 527 529. Sibirny A.A., Titorenko V.I., Gonchar M.V., Ubiyvovk V.M., Ksheminskaya G.P., Vitvitskaya O.P., 1988. Genetic control of methanol utilization in yeasts. J. Basic Microbiol. 28, 293 319. Sosnowska B., 1996. Formaldehyd i jego połączenia w ściekach zakładowych. Fundacja Ekologiczna Czysta Wisłoka z/s w Tarnowie. Fundacyjny Ośrodek Szkolenia i Informacji Technicznej. Warsztaty Ochrony Wód. Tyszka M., Kaszycki P., Kołoczek H., 1998. Metody współczesnej biotechnologii w procesach biodegradacji zanieczyszczeń. 1. Ukierunkowane modyfikacje biocenozy osadu czynnego z biologicznych oczyszczalni ścieków. Ekologia i Technika 6, 175 179. Tyszka M., Kaszycki P., Kołoczek H., 1999. Metody współczesnej biotechnologii w procesach biodegradacji zanieczyszczeń. 2. Drobnoustroje metylotroficzne oraz ich mutanty perspektywy wykorzystania w procesach biologicznego utleniania jednowęglowych ksenobiotyków. Ekologia i Technika 1, 15 19. Walker J.F., 1964. Formaldehyde. Reinhold Publ. Co., NY, London, 3rd Edn., series no. 159. Acta Sci. Pol.

Konstrukcja efektywnych biocenoz... 103 CONSTRUCTION OF EFFECTIVE BIOCENOSES ABLE TO DEGRADE FORMALDEHYDE AND ITS DERIVATIVES PRESENT IN HEAVY-LOADED INDUSTRIAL WASTEWATER Abstract. Biological process of degradation of formaldehyde and its derivatives present in furniture industry wastewater was studied. A biocenosis consisting of bacterial autochthonous microorganisms and methylotrophic yeast was constructed. It was shown that the introduction of methylotrophs into toxic wastewater enabled the development of organic life and the efficient biodegradation of various organic contaminants. The idea of generating active microbial community based on mixed pro- and eukaryotic biocenoses was proposed. Such a community could be applied to treat industrial wastewater containing lethal formaldehyde concentrations. Key words: formaldehyde, industrial wastewater, methylotrophic yeast, biodegradation Paweł Kaszycki (paw@ogr.ar.krakow.pl), Kamila Czechowska, Przemysław Petryszak, Henryk Kołoczek (koloczek@ogr.ar.krakow.pl), Zakład Biochemii, Akademia Rolnicza w Krakowie, Al. 29 Listopada 54, 31 425 Kraków. Biotechnologia 2(1-2) 2003