Porównanie trzech metod oceny wytwarzania śluzu przez Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 303-308 Joanna Wróblewska, Emilia Ciok Pater, Alicja Sękowska, Eugenia Gospodarek Porównanie trzech metod oceny wytwarzania śluzu przez Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK Oceniono zdolność wytwarzania śluzu przez 32 szczepy Staphylococcus aureus i 32 szczepy Staphylococcus epidermidis wykorzystując metody: ocenę morfologii kolonii na podłożu z czerwienią Kongo (CRA), z zastosowaniem roztworu safraniny (CT) i z użyciem metody spektrofotometrycznej z zastosowaniem czerwienieni Kongo (SC). Nie wykazano istotnych różnic w ocenie wytwarzania śluzu przez S. aureus i S. epidermidis przy wykorzystaniu metody CT i SC (p > 0,05), w przeciwieństwie do metody CRA (p < 0,0004 i p < 0,00001). Gronkowce są jednym z najczęstszych czynników etiologicznych zakażeń układowych, związanych z wprowadzeniem biomateriału do organizmu człowieka, i w wielu przypadkach, początek tych zakażeń związany jest z obecnością Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis na powierzchni skóry. Patogeneza zakażeń związanych z biomateriałami jest procesem złożonym, zależnym od wielu czynników, m. in.: fizykochemicznych właściwości biomateriałów, struktury powierzchni komórki bakteryjnej, bakteryjnych czynników wirulencji. Jednym z czynników wirulencji gronkowców jest zdolność wytwarzania śluzu, który ułatwia im adherencję do powierzchni ożywionej, jak i nieożywionej. W niniejszej pracy postanowiono porównać trzy metody oceny wytwarzania śluzu przez S. aureus i S. epidermidis. MATERIAŁ I METODY S z c z e p y b a k t e r i i. Do badań użyto 32 szczepów S. aureus i 32 szczepów S. epidermidis izolowanych od różnych pacjentów z miejsca operowanego (wymazy z ran) w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu i poradniach przyklinicznych tego szpitala. Przynależność do gatunku badanych szczepów określano za pomocą testów API STAPH (biomérieux). Wynik reakcji biochemicznych odczytywano wizualnie i analizowano w systemie komputerowym ATB Expression (biomérieux) z zastosowaniem bazy danych wersji V 2.8.8

304 J. Wróblewska i inni Nr 4 Wykrywanie wytwarzania śluzu z zastosowaniem podłoża z czerwienią Kongo. Badanie wykonano według metody Freeman i wsp. (7), polegającej na ocenie morfologii kolonii na podłożu z czerwienią Kongo (CRA, Congo Red Agar) o składzie: wyciąg mózgowo-sercowy (OXOID), sacharoza (SIGMA), agar Nr 1 (OXOID), czerwień Kongo (SIGMA) (metoda CRA, Congo Red Agar method). Jedną kolonię badanego izolatu z 18 godzinnej hodowli na agarowym podłożu tryptozowo-sojowym (TSB, Tryptic Soy Broth, BBL) z dodatkiem 5% krwi baraniej (AK) posiewano na CRA. Po 48. godzinie inkubacji w temperaturze 37 o C odczytywano wynik. Kolonie o suchej, krystalicznej powierzchni, barwy czarnej identyfikowano jako wytwarzające śluz. Wykrywanie wytwarzania śluzu z zastosowaniem roztworu safraniny i płytek wielodołkowych z polistyrenu. Badanie wykonano według metody Christensena i wsp. (5), polegającej na zastosowaniu safraniny (POCH) jako znacznika barwnego (metoda CT, Christensen s Tube method). Przygotowano z czystej linii bakteryjnej z 18 godzinnej hodowli na podłożu AK zawiesinę o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda. Po 50 µl zawiesiny bakteryjnej przenoszono do 96-dołkowych studzienek okrągłodennych sterylnych płytek z polistyrenu (Medlab). Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 o C zawartość studzienek wylewano, a do pustych studzienek wprowadzano 0,1% roztwór safraniny. Płytkę delikatnie wytrząsano, aby zapewnić jednolite wybarwienie materiału przylegającego do wewnętrznej powierzchni ściany studzienki. Obecność intensywnie wybarwionej na ciemnoróżowo warstwy na wewnętrznej ścianie studzienki płytki świadczyła o wytwarzaniu śluzu przez badane szczepy. Brak takiej warstwy przyjmowano za wynik ujemny. Wykrywanie wytwarzania śluzu z zastosowaniem roztworu czerwieni K ongo. Badanie wykonano według metody Ishiguro i wsp. (9), polegającej na zastosowaniu czerwieni Kongo (Congo Red, Sigma) jako znacznika barwnego (metoda SC). Po 24 godzinach hodowli badanych szczepów w TSB w temperaturze 37ºC przygotowywano w 5 ml PBS o ph 7,2 zawiesinę o gęstości 2 według skali MacFarlanda. Do probówek typu Eppendorf wprowadzano 500 μl uzyskanej zawiesiny i roztworu czerwieni Kongo (150 μg/ ml). Mieszaninę wytrząsano (1350 RPM, wytrząsarka Thermomixer Comfort, Eppendorf) przez 5 minut w temperaturze pokojowej i natychmiast wirowano (15000 RPM/10 minut, wirówka Laboratory Centrifuge typ 3K18, Sigma). Supernatant przenoszono do studzienek w płytkach wielodołkowych i mierzono gęstość optyczną (OD, Optical Density) w wielodetekcyjnym czytniku mikropłytek Synergy HT, przy długości fali λ=480 nm. Kontrolę stanowiła wprowadzana do studzienek płytek wielodołkowych mieszanina 500 µl PBS z 500 µl stosowanego roztworu czerwieni Kongo. Odczyt absorbancji dla każdego szczepu wykonywano w trzech powtórzeniach. Otrzymane wyniki uśredniano, przedstawiając wynik jako ubytek absorbancji w przeliczeniu na jedną jednostkę OD. Szczepy, dla których wartość OD wynosiła 0,156, zaliczano do grupy szczepów wytwarzających śluz (13). O b l i c z e n i a s t a t y s t y c z n e. Zastosowano test dwóch frakcji, w modyfikacji uwzględniającej próbki o niskiej liczebności. W celu weryfikacji hipotezy o równości frakcji obliczano wartość statystyki U opartej na przekształceniu arcus sinus. Funkcja arc sin x jest wyrażona w stopniach. Statystyka U ma w przybliżeniu rozkład normalny (Gaussa) (16).

Nr 4 Wytwarzanie śluzu przez S. aureus i S. epidermidis 305 WYNIKI W metodzie CRA 30 (93,7%) szczepów S. aureus oraz 29 (90,6%) szczepów S. epidermidis wzrastało w postaci ciemno-bordowych kolonii o suchej, krystalicznej powierzchni. Kolonie dwóch szczepów S. aureus oraz trzech szczepów S. epidermidis miały barwę różowo- -czerwoną. Nie uzyskano wzrostu badanych szczepów gronkowców w postaci czarnych, suchych, krystalicznych kolonii. W związku z powyższym, żaden szczep według przyjętych założeń, nie wytwarzał śluzu. Tabela I. Zdolność wytwarzania śluzu przez szczepy S. aureus i S. epidermidis Wytwarzanie śluzu Metoda Numer Metoda CRA Metoda CT spektrofotometryczna szczepu S. aureus S. epidermidis S. aureus S. epidermidis S. aureus S. epidermidis 1 - - - + - + 2 - - + + + + 3 - - + + - + 4 - - + - + - 5 - - - - - - 6 - - + - + - 7 - - - - - - 8 - - - + - - 9 - - - + - + 10 - - - + - - 11 - - - + - - 12 - - - + - - 13 - - + - - - 14 - - + - - - 15 - - - - - - 16 - - - - - - 17 - - - - - - 18 - - - + - - 19 - - - + - - 20 - - - + - + 21 - - + - + - 22 - - + - - - 23 - - + + - + 24 - - + + + + 25 - - - + - + 26 - - - + - - 27 - - - - - - 28 - - + - - - 29 - - + - + - 30 - - - + - - 31 - - - - - - 32 - - - - - -

306 J. Wróblewska i inni Nr 4 W metodzie CT 12 (37,5%) szczepów S. aureus i 16 (50,0%) szczepów S. epidermidis posiadało zdolność wytwarzania śluzu. W metodzie SC 6 (18,7%) szczepów S. aureus i 8 (25,0%) szczepów S. epidermidis zinterpretowano jako zdolne do wytwarzania śluzu. Nie wykazano różnic istotnych statystycznie porównując zdolność wytwarzania śluzu (dla wszystkich badanych szczepów gronkowców) stosując metodę CT i SC (p > 0,05). Zdolność wytwarzania śluzu przez poszczególne szczepy gronkowców w zależności od zastosowanej metody badawczej przedstawiono w tabeli I. Szczepy, które wzrastały na podłożu CRA w postaci kolonii o barwie różowo-czerwonej, zarówno w metodzie CT, jak i SC także nie wytwarzały śluzu. Spośród szczepów badanych metodą CT tylko nieliczne nie wytwarzały śluzu w metodzie SC. W oparciu o przyjęte założenia, różnica w liczbie szczepów S. aureus i S. epidermidis wytwarzających śluz jest istotna statystycznie dla szczepów ocenianych z użyciem metody CRA oraz dwóch pozostałych metod. DYSKUSJA Opinie badaczy dotyczące wpływu zdolności wytwarzania śluzu na patogenność szczepów gronkowców są podzielone. Jedni uważają, że wytwarzanie śluzu odgrywa znikomą rolę w procesie zakażenia (6, 19), przeciwnicy twierdzą, że zdolność wytwarzania śluzu to cecha pozwalająca odróżnić patogenne szczepy gronkowców od szczepów komensalnych (10). Wytwarzanie śluzu odgrywa jednak niezaprzeczalną rolę podczas kolonizacji powierzchni biomateriałów. Śluz umożliwia komórkom bakteryjnym tworzenie agregatów. Ułatwia bakteriom przyleganie do różnych powierzchni. Stanowi także ochronę dla drobnoustrojów przed fagocytozą czy też działaniem antybiotyków oraz enzymów gospodarza (8, 10, 18). Śluz jest znacznie częściej wytwarzany przez szczepy S. epidermidis niż S. aureus (1, 14). W obecnej pracy porównano trzy metody badania zdolności wytwarzania śluzu. Metoda CRA polega na interpretacji morfologii kolonii gronkowców. Przyjęto kryterium, że tylko szczepy rosnące w postaci czarnych kolonii są zdolne do wytwarzania śluzu. Jednak należy zwrócić uwagę, że niektórzy badacze różnicują szczepy na: intensywnie (kolonie barwy czarnej), umiarkowanie wytwarzające śluz (kolonie o barwie ciemno-różowej) i nie wytwarzające śluzu (kolonie barwy różowo-czerwonej lub blado-różowej) (11). Kolonie szczepów przez nas badanych posiadały suchą, krystaliczną powierzchnię i miały barwę ciemno-bordową, Pojawia się problem, czy szczepy o barwie kolonii ciemno-bordowej według powyższej klasyfikacji należałoby interpretować jako szczepy intensywnie czy umiarkowanie wytwarzające śluz, czy też, jak przyjęto w obecnej pracy jako szczepy nie wytwarzające śluzu. Według kryteriów oceny wytwarzania śluzu zastosowanych przez Korona-Głowniak i wsp. (11) interpretacja powyższych wyników byłaby odmienna: 30 (93,7%) szczepów S. aureus oraz 29 (90,6%) szczepów S. epidermidis uznano by jako wytwarzające śluz. Większość badaczy posługujących się tą metodą uzyskuje wyniki odmienne od wyników przedstawionych przez: Bozkurt i wsp. (4), Arslan i wsp. (2), Bartosiewicz i wsp. (3), Korona-Głowniak i wsp. (11), którzy stwierdzili odpowiednio zdolność wytwarzania śluzu u 51,9%, 44,1%, 18,0%, 9,0% szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych, Krukowski i wsp. (12) u 42,4% szczepów S. aureus. Metoda CRA jest metodą prostą w wykonaniu. Wymaga odpowiedniego

Nr 4 Wytwarzanie śluzu przez S. aureus i S. epidermidis 307 przygotowania pożywki. Jednak ocena barwy kolonii jest oceną subiektywną. Stąd, mogą wystąpić rozbieżności w otrzymanych wynikach. Jeżeli nawet w niniejszej pracy przyjętoby założenie, że szczepy, które tworzyły kolonie ciemno-bordowe, o suchej krystalicznej powierzchni były producentami śluzu, porównując tę metodę z metodą CT i SC stwierdzono by znaczące różnice w ocenie wytwarzania śluzu (p < 0,0004 i p < 0,00001). W metodzie CT zamiast probówek szklanych, do oznaczenia wytwarzania śluzu użyto studzienek płytek wielodołkowych z polistyrenu. W powyższej metodzie nie oceniono intensywności wytwarzania śluzu. W przeciwieństwie do oceny zdolności wytwarzania śluzu przy zastosowaniu metody CRA, w metodzie CT 37,5% szczepów S. aureus, 50,0% szczepów S. epidermidis wytwarzało śluz, co jest porównywalne z odsetkiem szczepów wytwarzających śluz według innych badaczy (2, 12). Oceniając zdolność do wytwarzania śluzu metodą SC wykazano, że mniej szczepów gronkowców wytwarzało śluz w porównaniu do metody CT. Uzyskane wyniki nie wskazywały na statystycznie istotne różnice (p > 0,05). Jednak opinie innych badaczy dotyczące korelacji między tymi dwoma metodami są podzielone (15, 17). Ocena spektrofotometryczna należy do metod ilościowych, jednak wymaga odpowiedniego sprzętu i jest pracochłonna. WNIOSKI Wykazano korelację pomiędzy wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu metod CT i S.C. do oceny wytwarzania śluzu przez szczepy S. aureus i S. epidermidis, w przeciwieństwie do wyników otrzymanych metodą CRA J. Wróblewska, E. Ciok Pater, A. Sękowska, E. Gospodarek Comparison of three methods detection of slime production by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis SUMMARY In this article, slime production of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis strains from infective skin lesions was evaluated by three different methods: Congo red agar method (CRA), Christensen tube method (CT) and spectrophotometric method (SC). All strains by CT method interpreted as negative (dark-claret or red colonies of the surface). 12 (37,5%) strains of S. aureus, 16 (50,0%) strains of S. epidermidis produced slime as shown by CT method, 6 (18,7%) strains of S. aureus, 8 ( 25,0%) strains of S. epidermidis by SC method. They also found a correlation of slime production by CT and SC method (p > 0,05). PIŚMIENNICTWO 1. Arciola CR, Campoccia D, Montanara L. Detection of biofilm-forming strains of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. Expert Rev Mol Diagn 2002; 2: 478-84.

308 J. Wróblewska i inni Nr 4 2. Arslan S, Özkarde F. Slime production and antibiotic susceptibility in staphylococci isolated from clinical samples. Memórias do Instituto Oswaldo Gruz 2007; 102: 29-33. 3. Bartosiewicz M, Nowicka J, Kostrzycki W i inni. Charakterystyka gronkowców koagulazoujemnych kolonizujących cewniki naczyniowe u pacjentów leczonych kardiochirurgicznie. Adv Clin Exp Med 2005; 14: 287 92. 4. Bozkurt H, Kurtogul MG, Bayram Y i inni. Correlation of slime production investigated via three different methods in coagulase-negative staphylococci with crystal violet reaction and antimicrobial resistance. J Int Med Res 2009; 37: 121-8. 5. Christensen GD, Simpson WA, Bisno AL i inni. Adherence of slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infect Immun 1982, 37: 318-26. 6. Davenport DS, Massanari RM, Pfaller MA i inni. Usefulness of a test for slime production as a marker for clinically significant infections with coagulase negative staphylococci. J Infect Dis 1986, 153: 332-9 7. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol 1989; 42: 872-4. 8. Gelosia A, Baldassarri L, Deighton M i inni. Phenotypic and genotypic markers of Staphylococcus epidermidis virulence. Clin Microbiol Infect 2001; 7: 193-9. 9. Ishiguro EE, Ainsworth T, Trust TJ i inni. Congo red agar, a differential medium for Aeromonas salmonicida, detects the presence of the cell surface protein array involved in virulence. J Bacteriol 1985; 164: 1233-7. 10. Jass J, Surman S, Walker J. Medical biofilms: detection, prevention and control. WILEY, Chichester, West Sussex, England 2003, 64-6. 11. Korona-Głowniak I, Łoś R, Malm A i inni. Fenotypowa charakterystyka gronkowców koagulazo- -ujemnych kolonizujących dreny po zabiegach torakochirurgicznych u pacjentów z rakiem płuc. Med Dośw Mikrobiol 2003; 55: 109-15. 12. Krukowski H, Szymankiewicz M, Lisowski A. Slime production by Staphylococcus aureus strains isolated from cases of bovine mastitis. PJM 2008; 57: 253-5. 13. Mateo M, Maestre JR, Aguilar L i inni. Strong slime production is a marker of clinical significance in Staphylococcus epidermidis isolated from intravascular catheters. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2008; 27: 311 4. 14. Montanaro L, Arciola CR, Baldassarri L i inni. Presence and expression of collagen adhesin gene (cna) and silme production in Staphylococcus aureus strains from orthopaedic prosthesis infection. Biomat 1999; 20: 1945-9. 15. Prasad SV, Ballal M, Shivananda PG. Slime production a virulence marker in Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinical and environmental specimens: A comparative study of two methods. Indian J Pathol Microbiol 2009; 52: 191-3. 16. Sachs L. Applied Statistics. Berlin Springer Verlg 1982. 17. Sánchez G, Pascual A, Martínez-Martínez L. Evaluation of 2 methods for studying slime production by coagulase-negative Staphylococcus strains. Enferm Infecc Microbiol Clin 1989; 7: 252-6. 18. von Eiff C, Peters G, Heilmann C. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. Lancet Infect Dis 2002; 2: 677-85. 19. West TE, Walshe JJ, Krol CP i inni. Staphylococcal peritonitis in patients on continuous peritoneal dialysis. J Clin Microbiol 1986; 23: 809-12. Otrzymano: 30 X 2010 r. Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medium im. Rydygiera w Bydgoszczy, UMK w Toruniu