CHARAKTERYSTYKA PIERWSZEGO IZOLOWANEGO W POLSCE FERMENTUJĄCEGO SORBITOL WEROTOKSYCZNEGO SZCZEPU ESCHERICHIA COLI O157

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 173-181 Aleksandra Jakubczak 1, Jolanta Szych 1, Kamil Januszkiewicz 2 CHARAKTERYSTYKA PIERWSZEGO IZOLOWANEGO W POLSCE FERMENTUJĄCEGO SORBITOL WEROTOKSYCZNEGO SZCZEPU ESCHERICHIA COLI O157 1 Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego -Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski 2 Pracownia Parazytologii Molekularnej Instytut Parazytologii PAN w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. H. Wędrychowicz Opisano fenotypowe i genotypowe właściwości pierwszego, izolowanego w Polsce fermentującego sorbitol werotoksycznego izolatu Escherichia coli O157 (SF VTEC O157:H-), pochodzącego od dziecka z zaburzeniami żołądkowo - jelitowymi. Badany szczep posiadał cechy charakterystyczne dla szczepów SF VTEC O157:H- izolowanych w innych krajach. Pojawienie się na terenie Polski pierwszego udokumentowanego przypadku zachorowania wywołanego przez fermentujący sorbitol werotoksyczny szczep E. coli O157: H- wskazuje na konieczność wprowadzenia zmian w procedurach badań w tym kierunku szczególnie przy poszukiwaniu szczepów VTEC O157 w próbkach materiału klinicznego. Zakażenia układu pokarmowego wywoływane przez werotoksyczne szczepy E. coli (VTEC) stanowią istotny problem tak z klinicznego jak i epidemiologicznego punktu widzenia (14). Jak wynika z raportów Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) (http://www.efsa.eu.int/efsa/efsa_locale- 178620753812_home.htm) spośród szczepów zaliczanych do VTEC najczęściej z zakażeń od ludzi izolowane są werotoksyczne pałeczki E. coli O157. Biorąc pod uwagę jedną z istotnych pod względem diagnostyki cech jaką jest zdolność do fermentacji sorbitolu pałeczki E. coli O157 podzielić można na dwie grupy. Pierwszą z nich stanowią najczęściej izolowane od ludzi niefermentujące sorbitolu pałeczki tzw. NSF (Non - Sorbitol - Fermenting) VTEC O157:H7, lub ich wariant niewykazujący zdolności ruchu NSF VTEC O157:H-. Drugą grupę stanowią pałeczki szybko fermentujące sorbitol tzw. SF (Sorbitol - Fermenting) VTEC O157:H-, które w ostatnich latach zaczęły odgrywać istotną rolę jako etiologiczny czynnik zakażeń wywoływanych przez VTEC O157 w wielu krajach świata (14,15,16). Fermentujące sorbitol pałeczki VTEC O157:H- po raz pierwszy zostały wyizolowane w 1988 roku od chorych w ognisku zatrucia pokarmowego w Niemczech (16). Obecnie drobnoustroje te są odpowiedzialne za ponad dwadzieścia procent zakażeń wywołanych

174 A. Jakubczak, J. Szych, K. Januszkiewicz Nr 3 werotoksycznymi pałeczkami E. coli O157 w tym kraju (14). Jak wynika z danych piśmiennictwa SF VTEC O157:H- są izolowane zarówno z przypadków sporadycznych zachorowań jak i ognisk zatrucia pokarmowego (1,14). Stwierdzono, że zakażenie u dzieci SF VTEC O157:H- stanowi bardzo istotny prognostyk wystąpienia zespołu hemolityczno - mocznicowego (Hemolytic Uremic Syndrome - HUS), ciężkiego powikłania w postaci ostrej niewydolności nerek i niedokrwistości hemolitycznej, w 5 15% przypadków prowadzącego do zgonu pacjenta (14). Wyniki badań przeprowadzonych w Niemczech w latach 1994-2000 wykazały, że SF VTEC O157:H- stanowiły od 13,3% do 40,5% wśród wszystkich VTEC O157 wyizolowanych od pacjentów z HUS (14). Badania nad epidemiologią zakażeń wywoływanych przez NSF VTEC O157 i SF VTEC O157 wskazują na istotne różnice między tymi dwoma typami VTEC. O ile wielokrotnie dowiedziono, że w przypadku NSF VTEC O157 głównym rezerwuarem zarazka jest bydło oraz inne zwierzęta gospodarskie i domowe (15), o tyle w przypadku zakażeń wywoływanych przez SF VTEC O157 rezerwuar zarazka nie został jednoznacznie określony. Nieliczne badania również wskazują na bydło jako potencjalne źródło zakażenia dla ludzi (17), ale jedynie w pojedynczych przypadkach można było udokumentować źródło zakażenia szczepem SF VTEC O157, w jednym przypadku było nim bydło, w drugim kucyk (cyt. za 14). Dotychczas nie zostały również jednoznacznie rozpoznane drogi przenoszenia się zakażeń SF VTEC O157. Autorzy doniesienia opisującego ognisko zatrucia pokarmowego o etiologii SF VTEC O157:H w Bawarii w latach 1995-1996 wskazali na spożycie skażonej żywności jako potencjalną drogę transmisji tych szczepów (1). Różnice występują także w sezonowości zakażeń wywoływanych przez te dwa typy VTEC O157. Szczyt zachorowań wywołanych przez SF VTEC O157 przypada na okres od września do kwietnia, w przeciwieństwie do zachorowań wywołanych przez NSF VTEC O157, których najwięcej notuje się między czerwcem a sierpniem (14). W Polsce laboratoryjna diagnostyka zakażeń w kierunku VTEC O157 prowadzona jest przez NIZP - PZH oraz stacje sanitarno epidemiologiczne od roku 1994. Począwszy od 2003 roku w naszym kraju obowiązuje także rejestracja zakażeń wywołanych przez werotoksyczne pałeczki E. coli (w meldunkach nazywane enterokrwotocznymi). Każdy zgłoszony przypadek zakażenia jest weryfikowany przez Zakład Bakteriologii we współpracy z Zakładem Epidemiologii NIZP PZH. Jak wynika z danych zgromadzonych przez NIZP PZH rocznie notuje się od jednego do kilku laboratoryjnie potwierdzonych przypadków zachorowań. W porównaniu do innych krajów takich jak: Wielka Brytania (1294 przypadków zakażenia VTEC w roku, w tym 1275 przypadków VTEC O157), Czechy (odpowiednio 1561/52), Niemcy (odpowiednio 1183/79) czy Irlandia (odpowiednio 158/119) zakażenia układu pokarmowego wywoływane przez werotoksyczne pałeczki E. coli O157 występują w Polsce sporadycznie (patrz raport EFSA za rok 2006 http://www.efsa.eu.int/efsa/efsa_locale-1178620753812_home.htm). Począwszy od 1994 r. wszystkie wyizolowane w Polsce od ludzi szczepy VTEC O157 (20 izolatów), potwierdzone w NIZP PZH izolowane były z przypadków sporadycznych zachorowań. Szczepy scharakteryzowano jako NSF VTEC O157:H-, z wyjątkiem jednego szczepu wykazującego zdolność ruchu, określonego jako NSF VTEC O157:H7. Do stycznia 2008 w Polsce nie udokumentowano przypadku izolacji fermentującego sorbitolu werotoksycznego szczepu E. coli O157.

Nr 3 E. coli O157 fermentujące sorbitol 175 Celem niniejszej pracy było określenie fenotypowych i genotypowych właściwości pierwszego szczepu SF VTEC O157, wyizolowanego w Polsce od dziecka z zaburzeniami żołądkowo - jelitowymi. MATERIAŁ I METODY S zczepy bakteryjne. Przedmiot badań stanowił szczep E. coli O157 o numerze 9/08, który został wyizolowany w Łodzi od 9 letniego pacjenta z objawami nieżytu żołądkowo-jelitowego a następnie przesłany do NIZP PZH w celu jego reidentyfikacji i dalszej charakterystyki. Jako kontroli użyto referencyjnego, werotoksycznego szczepu E. coli O157: H7 EDL 933. Określenie biochemicznych właściwości badanego szczepu. Reidentyfikacja szczepu przeprowadzona została zgodnie z zaleceniami NIZP-PZH zawartymi w procedurze badawczej PB-01-LEB/ZP. Zdolność badanego szczepu do fermentacji sorbitolu określono podczas 18 godzinnej inkubacji na podłożu Mac Conkey a z sorbitolem (SMAC) (18) oraz w klasycznym teście probówkowym (24). Zdolność do wytwarzania enzymu β- D-glukuronidazy oznaczono w teście z 4-metyloumbelliferyl-β-D-glukuronidem (MUG), wykorzystując krążki diagnostyczne wykonane we własnym zakresie (13), używając jako dodatniej i ujemnej kontroli odpowiednio szczepów E. coli ATCC 25922 oraz E. coli O157: H7 EDL 933. Aktywność enterohemolizyny wykrywano na podłożu agarowym z dodatkiem CaCl 2 i 5% płukanych krwinek baranich (21). Przynależność badanego szczepu do grupy antygenowej O157 potwierdzono przy zastosowaniu testu lateksowego firmy Biomex, zgodnie z instrukcją producenta. Test na wytwarzanie werotoksyn. Do wykrywania produkcji werotoksyny I (VT 1) oraz werotoksyny II (VT 2) zastosowano test odwróconej biernej aglutynacji lateksowej firmy OXOID (VTEC RPLA). Test ten wykonano zgodnie z zaleceniami producenta. Wykrywanie fragmentów genów charakterystycznych dla VTEC O157 przy użyciu metody PCR. Izolacje chromosomalnego DNA prowadzono wg. procedury opisanej przez Gierczyńskiego i wsp. (12). Metodą PCR poszukiwano fragmentów genów kodujących werotoksyny I i II (stx1 i stx2) (18,21), intyminę (eae) (11), enterohemolizynę (Ehly) (23), katalazę peroksydazę (katp) (7) oraz proteinazę serynową (espp) (6). Produkty reakcji amplifikacji analizowano elektroforetycznie w 2% żelu agarozowym oraz wizualizowano przy użyciu bromku etydyny. Analiza sekwencji genu sfpa charakterystycznego dla szczepów SF EHEC O157. W celu określenia obecności charakterystycznego dla SF EHEC O157 fragmentu genu operonu kodującego mannozooporne fimbrie, metodą PCR amplifikowano gen sfpa przy użyciu starterów w warunkach reakcji podanych w pracy Friedrich i wsp. (10). Produkt reakcji PCR klonowano przy użyciu zestawu pgem - T Easy Vector (PROMEGA). Uzyskany konstrukt poddano następnie reakcji sekwencjonowania w Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów IBB PAN. Analiza homologii sekwencji przeprowadzona została przy użyciu programu GeneBlast w National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi).

176 A. Jakubczak, J. Szych, K. Januszkiewicz Nr 3 Analiza sekwencji genu flic przy użyciu metody RFLP-PCR. Analiza restrykcyjna fragmentu sekwencji genu flic przeprowadzona została zgodnie z procedurą opisaną przez Field i wsp. (9). Gen flic został amplifikowany przy użyciu starterów F-FLIC1 i R-FLIC2 (9) a następnie poddany analizie restrykcyjnej przy użyciu enzymu RsaI (Fermentas). Produkty analizy restrykcyjnej analizowano elektroforetycznie w 2% żelu agarozowym oraz wizualizowano przy użyciu bromku etydyny. Analiza plazmidowego DNA. W celu stwierdzenia obecności plazmidowego DNA w badanym szczepie zastosowano metodę lizy alkalicznej według Sambrook i Maniatis (20). Izolacji plazmidowego DNA dokonywano korzystając z 18 godzinnej, płynnej hodowli szczepu w podłożu TSB przeprowadzonej w 37 C. Wielkość plazmidu porównywano z plazmidem o znanej wielkości molekularnej, pochodzącym ze szczepu referencyjnego EDL933. Plazmidowe DNA analizowano elektroforetycznie w 0,6% żelu agarozowym oraz wizualizowano przy użyciu bromku etydyny. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Potwierdzono identyfikację szczepu 9/08 jako nieruchliwą pałeczkę E. coli O157:H-. Dalsza fenotypowa i genotypowa charakterystyka szczepu przedstawiona została w Tabeli II, dla porównania scharakteryzowano również referencyjny szczep NSF VTEC O157:H7 EDL 933. Badany szczep 9/08 wykazywał zdolność do fermentacji sorbitolu, wykazywał dodatni wynik teście na MUG oraz nie wykazywał zdolności do ruchu. Ponadto wykazywał aktywność enterohemolizyny, co potwierdzone zostało w reakcji PCR na obecność kodowanego plazmidowo genu enterohemolizyny Ehly. Szczep wytwarzał werotoksynę 2, co zostało określone przy zastosowaniu testu VTEC RPLA a następnie potwierdzone w reakcji PCR. Typowanie genu kodującego intyminę eae (25) wykazało, że szczep wytwarza intyminę typu γ (dane niepublikowane). Jednak w przeciwieństwie do referencyjnego szczepu NSF VTEC O157:H7 u fermentującej sorbitol pałeczki E. coli O157:H- 9/08 nie stwierdzono obecności Tabela I. Numer szczepu/ Serotyp EDL933/ NSF VTEC O157:H7 9/08/ SF VTEC O157: H- Fenotypowe i genotypowe właściwości szczepu 9/08 / SF VTEC O157:H- i kontrolnego szczepu EDL933 NFS VTEC O157:H7. Geny Geny plazmidowe chromosomalne 3 Obecność 2 plazmidu VT EHly stx eae/ typ Ehly katp espp sfpa po157 Cechy fenotypowe 1 SF/ MUG -/- VT1, VT2 + stx1, stx2 +/γ + + + - + +/+ VT2 + stx 2 +/γ + - - + + 1 SF fermentacja sorbitolu, MUG aktywność β-d- glukuronidazy, VT wytwarzanie werotoksyn, EHly produkcja enterohemolizyny, + wynik dodatni, - wynik ujemny 2 Obecność genów chromosomalnych: stx1- werotoksyna 1, stx2 - werotoksyna 2, eae - intymina 3 Obecność genów plazmidowych: Ehly enterohemolizyna, katp katalaza- peroksydaza, espp proteaza serynowa, sfpa gen strukturalny mannozo-opornych fimbrii, + wynik dodatni, - wynik ujemny

Nr 3 E. coli O157 fermentujące sorbitol 177 kodowanych plazmidowo genów: katp - kodującego bifunkcjonalny enzym katalazę - peroksydazę oraz espp - kodującego proteinazę serynową. Opisana powyżej charakterystyka fenotypowych jak i genotypowych właściwości badanego szczepu wykazała, iż posiadał on cechy charakterystyczne dla opisywanych w piśmiennictwie fermentujących sorbitol werotoksycznych pałeczek E. coli O157:H- (2,5,10,14). Jak wynika z opublikowanych danych fermentujące sorbitol VTEC O157 cechuje obecność na plazmidzie psfo157 operonu sfp, kodującego nowy typ mannozo opornych fimbrii (5). Friedrich i wsp. zaproponowali aby jeden z genów operonu sfp, gen strukturalny sfpa, służył jako marker genetyczny do identyfikacji szczepów SF VTEC O157: H- (10). Badany szczep 9/08 SF VTEC O157:H- posiadał gen sfpa. Wynik sekwencjonowania tego genu wykazał 100% homologię sekwencji nukleotydowej do sekwencji genu sfpa (Accession Number NC_009602) zawartego w GenBanku (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/genbank/index.html). W celu określenia genetycznie uwarunkowanej zdolności do wytwarzania antygenu rzęskowego H7 szczepu E. coli O157 wykonana została analiza restrykcyjna fragmentu genu flic wg. Fields i wsp. (9). Uzyskany wzór restrykcyjny trawienia produktu amplifikacji fragmentu genu kodującego flagellinę był identyczny z wzorem restrykcyjnym uzyskanym w wyniku trawienia fragmentu genu flic pochodzącego ze szczepu NSF VTEC O157:H7 (EDL 933) (Ryc. 1). Pozwala to stwierdzić, iż badany szczep mimo braku fenotypowo wyrażonej zdolności ruchu, był genetycznie kompetentny do wytwarzania antygenu rzęskowego typu H7, co jest cechą charakterystyczną szczepów SF VTEC O157: H- (14). Ryc. 1. Rozdział elektroforetyczny produktów cięcia enzymem RsaI (RFLP-PCR) zamplifikowanego fragmentu genu flic. Ścieżka 1- EDL 933 / NSF VTEC O157:H7, Ścieżka 2-9/08 / SF VTEC O157:H-, M- marker wielkości 100 pz (Fermentas)

178 A. Jakubczak, J. Szych, K. Januszkiewicz Nr 3 Ryc. 2. Rozdział elektroforetyczny plazmidowego DNA szczepów EDL 933 oraz 9/08. Ścieżka 1- EDL 933 / NSF VTEC O157:H7, Ścieżka 2-9/08 / SF VTEC O157:H-. Analiza plazmidowego profilu badanego szczepu wykazała, iż posiadał on jeden plazmid znacznie większy od plazmidu po157 o wielkości 92 kpz pochodzącego ze szczepu referencyjnego EDL933 (Ryc. 2.) (8). Dane z piśmiennictwa wskazują, iż wielkość molekularna jedynego zsekwencjonowanego do tej pory plazmidu pochodzącego ze szczepu 3072/96 SF VTEC O157:H- (4) wynosi ok. 120 kpz, co odpowiadałoby uzyskanemu przez nas wynikowi. DYSKUSJA Fermentujące sorbitol werotoksyczne pałeczki E. coli O157 - SF VTEC O157:H- wyizolowane zostały po raz pierwszy w 1988 roku z ogniska zatrucia pokarmowego w Bawarii (16). Obecnie stanowią one obok niefermentujących sorbitolu werotoksycznych pałeczek E. coli O157:H7 jedną z głównych przyczyn występowania zespołu hemolityczno - mocznicowego (HUS) u dzieci (14). W toku rutynowej diagnostyki zakażeń w wielu krajach na świecie i w Polsce wstępna identyfikacja VTEC O157:H7 opiera się głównie na wykorzystaniu fenotypowych właściwości szczepu takich jak brak zdolności do fermentacji sorbitolu i MUG. Powszechnie wykorzystywanym podłożem do posiewu kału jest podłoże Mc Conkey a z sorbitolem określane jako SMAC (18). Procedury diagnostyczne opierające się głównie na izolacji NSF VTEC O157:H7 sprawiają, że podczas rutynowej diagnostyki pomijane zostają sorbitolododatnie werotoksyczne szczepy tego serotypu. Dodatkowo

Nr 3 E. coli O157 fermentujące sorbitol 179 w laboratoriach diagnostycznych używane jest często podłoże SMAC zawierające suplement w postaci dodatku cefiksimu oraz tellurynu potasu (SMAC CT), co dodatkowo zwiększa wybiórcze właściwości tego podłoża w stosunku do NFS VTEC O157:H7. Wykazano jednak, iż fermentujące sorbitol VTEC O157:H- są wrażliwe na stężenie tellurynu zawarte w podłożach SMAC CT, co wyklucza możliwość ich izolacji z takiego podłoża (3). W Polsce od chwili wprowadzenia mikrobiologicznej diagnostyki zakażeń w kierunku VTEC O157 w 1994 roku do stycznia 2008 roku wszystkie, z jednym wyjątkiem, wyizolowane od ludzi szczepy E. coli O157 przysłane do NIZP PZH w celu przeprowadzenia dalszych badań i określenia chorobotwórczości stanowiły nieruchliwe warianty NSF VTEC O157:H-. W niniejszej pracy według wiedzy autorów został scharakteryzowany pierwszy wyizolowany w Polsce, z kału dziecka z biegunką, werotoksyczny szczep E. coli O157: H- fermentujący sorbitol. Badany szczep posiadał cechy charakterystyczne dla izolowanych w innych krajach fermentujących sorbitol werotoksycznych pałeczek E. coli O157: H-. Analiza pokrewieństwa genetycznego badanego szczepu SF VTEC O157:H- i innych werotoksycznych szczepów E. coli O157 izolowanych na terenie Polski przeprowadzona metodą PFGE wykazała, iż badany szczep charakteryzował się niskim stopniem pokrewieństwa genetycznego w stosunku do izolowanych w kraju szczepów NSF VTEC O157: H- (dane nieopublikowane). Podsumowując, pojawienie się na terenie Polski pierwszego fermentującego sorbitol werotoksycznego szczepu E. coli O157:H- wskazuje na konieczność wprowadzenia zasadniczych zmian w procedurach badań w tym kierunku, szczególnie przy poszukiwaniu szczepów VTEC O157 w próbkach materiału klinicznego. Wskazane byłoby, aby wzorem niektórych innych krajów takich jak Dania czy Holandia, w Polsce, w miarę modernizacji i rozwoju zaplecza laboratoryjnego wprowadzić nowoczesne metody biologii molekularnej do rutynowej diagnostyki w kierunku VTEC. Pozwoliło by to w przypadku badania kału w kierunku werotoksycznych pałeczek E. coli wykrywać szczepy VTEC niezależnie od ich fenotypowych właściwości. Zanim to jednak nastąpi wskazana jest bardziej wnikliwa niż dotychczas analiza izolowanych kolonii E. coli zarówno tych niefermentujących sorbitolu jaki i fermentujących ten substrat na podłożu SMAC zwłaszcza w sytuacji gdy obraz kliniczny zakażenia wskazuje na podejrzenie zakażenia werotoksycznymi szczepami E. coli O157. Podziękowania: Autorzy pracy dziękują paniom Marioli Pyziak z Powiatowej Stacji Sanitarno-Epidemiologicznej w Tomaszowie Mazowieckim i Barbarze Jaroszewskiej-Wachowiak z Prywatnego Gabinetu Lekarskiego Centrum Diagnostyki Laboratoryjnej w Łodzi za przekazanie szczepu E.coli O157 oraz pani Anecie R. Mamos z Oddziału Nadzoru Epidemiologii WSSE w Łodzi za udostępnienie danych epidemiologicznych.

180 A. Jakubczak, J. Szych, K. Januszkiewicz Nr 3 Jakubczak A, Szych J, Januszkiewicz K CHARACTERIZATION OF FIRST SORBITOL-FERMENTING SHIGA TOXIN-PRODUCING ESCHERICHIA COLI O157:H- STRAIN ISOLATED IN POLAND SUMMARY Sorbitol-fermenting shiga toxin-producing E. coli O157:H- strains have emerged as a cause of human disease in many European and non-european countries. The role of SF VTEC O157:H- in the etiology of pediatric HUS and diarrhea is significant. We characterized the first SF VTEC O157: H- strain isolated from 9 year old patient in Poland. Strain possessed many traits characteristics for SF VTEC O157:H-. It fermented sorbitol after overnight incubation and produced β glucuronidase. It possessed the stx2, eae-γ, EhlyA and sfpa genes and did not harbour plasmid - encoded katp and espp genes. Motility was not expressed but the strain possessed the chromosomal flic locus for H7 antigen. The spread of SF VTEC O157:H- strains demonstrates the need for appropriate procedures for their microbiological diagnosis in Poland. PIŚMIENNICTWO 1. Ammon A, Petersen LR, Karch H. A large outbreak of hemolytic uremic syndrome caused by an unusual sorbitol-fermenting strain of Escherichia coli O157:H-. J Infect Dis 1999; 179: 1274-7. 2. Bielaszewska M, Schmidt H, Liesegang A i inni. Cattle Can Be a Reservoir of Sorbitol-Fermenting Shiga Toxin-Producing Escherichia coli O157:H Strains and a Source of Human Diseases. J Clin Microbiol 2000; 38: 3470 3. 3. Bielaszewska M, Tarr PI, Karch H i inni. Phenotypic and molecular analysis of tellurite resistance among enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and sorbitol-fermenting O157:NM clinical isolates. J Clin Microbiol 2005; 43: 452-4. 4. Brunder W, Karch H, Schmidt H. Complete sequence of the large virulence plasmid psfo157 of the sorbitol-fermenting enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H strain 3072/96. Int J Med Microbiol 2006; 296: 467-74. 5. Brunder W, Salam Khan A, Hacker J, Karch H. Novel Type of Fimbriae Encoded by the Large Plasmid of Sorbitol-Fermenting Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H2. Infect Immun. 2001; 69: 4447 57. 6. Brunder W, Schmidt H, Frosch M i inni. The large plasmids of Shiga-toxin-producing Escherichia coli (STEC) are highly variable genetic elements. Microbiology 1999; 145: 1005-14. 7. Brunder W, Schmidt H, Karch H. KatP, a novel catalase-peroxidase encoded by the large plasmid of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Microbiology 1996; 142: 3305-15. 8. Burland V, ShaoY, Perna NT i inni. The complete DNA sequence and analysis of the large virulence plasmid of Escherichia coli O157:H7. Nucleic Acids Res 1998; 26: 4196-204. 9. Fiedls PI, Blom K, Hughes HJ, Helsel LO, Feng P, Swaminathan B. Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J Clin Microbiol. 1997; 35: 1066-70. 10. Friedrich W, Nierhoff KV, Bielaszewska M i inni. Phylogeny, clinical associations, and diagnostic utility of the pilin subunit gene (sfpa) of sorbitol-fermenting, enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H-. J Clin Microbiol. 2004; 42: 4697-701.

Nr 3 E. coli O157 fermentujące sorbitol 181 11. Gannon VPJ, Rashed M, King RK i inni. Detection and characterization of the eae gene of Shigalike toxin-producing Escherichia coli using polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1993; 31: 1268-74. 12. Gierczyński R, Kałużewski S, Rakin A i inni. Intriguing diversity of Bacillus anthracis in eastern Poland - the molecular echoes of the past outbreaks. FEMS Microbiol Lett 2004; 239: 235-40. 13. KałużewskiS, Tomczuk D. Ocena przydatności testów na wytwarzanie β-d- glukuronidazy i rozkładanie glikolu propylenowego do różnicowania pałeczek Enterobacteriaceae. Med. Dośw Mikrobiol 1995; 47:155-68. 14. Karch H, Bielaszewska M. Sorbitol-fermenting Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H(-) strains: epidemiology, phenotypic and molecular characteristics, and microbiological diagnosis. J Clin Microbiol. 2001; 39: 2043-9. 15. Karch H, Bielaszewska M, Bitzan M i inni. Epidemiology and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections Diagn Microbiol Infect Dis. 1999; 34: 229-43. 16. Karch H, Wiss R, Glonning H i inni. Hämolytisch-urämisches Syndrom bei Kleinkindern durch Verotoxin-produzierende Escherichia coli. Dtsch Med Wochenschr 1990; 115: 485-95. 17. Lee JH, Choi SJ. Isolation and characteristics of sorbitol-fermenting Escherichia coli O157 strains from cattle. Microbes Infect. 2006;8: 2021-6. 18. March SB, Ratnam S. Sorbitol-MacConkey medium for detection of Escherichia coli O157:H7 associated with hemorrhagic colitis. J Clin Microbiol 1986; 23: 869-72. 19. Russmann H, Schmidt H, Heesemann J i inni. Variants of shiga-like toxin II constitute a major toxin component in Escherichia coli O157 strains from patients with haemolytic uraemic syndrome. J Med Microbial 1994; 40: 338-343 20. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Third Edition. New York 2001 21. Schmidt H, Karch H, Beutin L. The large-sized plasmids of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains encode hemolysins which are presumably members of the α- hemolysin family. FEMS Microbiol Lett 1994; 117:189-96. 22. Schmidt H, Montag M, Bockemuhl J i inni. Shiga-like toxin II-related cytotoxins in Citrobacter freundii strains from human and beef samples. Infect Immun 1993; 61: 534-43. 23. Wieler LH, Tigges M, Ebel F i inni. The enterohemolysin phenotype of bovine Shiga-like toxinproducing Escherichia coli (SLTEC) is encoded by the EHEC-hemolysin gene. Vet Microbiol 1996; 52:153-64. 24. Załęska H, Teisseyre T, Janczura E. Pożywki bakteriologiczne. Wydawnictwa metodyczne PZH, Warszawa 1973. 25. Zhang WL, Köhler B, Oswald E, Beutin L, Karch H, Morabito S, Caprioli A, Suerbaum S, Schmidt H. Genetic diversity of intimin genes of attaching and effacing Escherichia coli strains. J Clin Microbiol. 2002 ; 40:4486-92. Otrzymano: 16 IX 2008 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH