Werotoksyczne pałeczki Escherichia coli epidemiologia, chorobotwórczość, lekooporność

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: Werotoksyczne pałeczki Escherichia coli epidemiologia, chorobotwórczość, lekooporność Verocytotoxigenic Escherichia coli - epidemiology, pathogenicity and antimicrobial resistance Aleksandra Januszkiewicz Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny Werotoksyczne pałeczki E. coli (VTEC) stanowią ważny czynnik bakteryjnych zatruć pokarmowych u ludzi na całym świecie. Wysoki potencjał chorobotwórczy tych drobnoustrojów sprawia, iż stanowią one często przyczynę ognisk epidemicznych, nawet o zasięgu międzynarodowym, z licznymi przypadkami śmiertelnymi. Przedstawiony artykuł poglądowy prezentuje aktualną wiedzę na temat werotoksycznych pałeczek E. coli omawiając ich chorobotwórczość oraz lekooporność a także epidemiologię zakażeń przez nie wywoływanych. Słowa kluczowe: werotoksyczne pałeczki Escherichia coli, enterokrwotoczne pałeczki Escherichia coli, epidemiologia, chorobotwórczość, lekooporność ABSTRACT Verocytotoxigenic E. coli (VTEC) are one of the most common foodborne pathogen in human worldwide. High pathogenic potential of these organisms makes it often the cause of international outbreaks with numerous fatalities. This study presents the current knowledge on verocytotoxigenic E. coli: pathogenicity, drug resistance as well as the epidemiology of infections. Key words: Verocytotoxigenic Escherichia coli, enterohemorrhagic Escherichia coli, epidemiology, pathogenicity, antimicrobial resistence

2 316 A. Januszkiewicz Nr 4 WPROWADZENIE Werotoksyczne pałeczki E. coli (VTEC) stanowią ważny czynnik bakteryjnych zatruć pokarmowych u ludzi na całym świecie. Według raportu ECDC z 2009 roku (European Centre for Disease Prevention and Control) werotoksyczne pałeczki E. coli (VTEC) są czwartym w kolejności, zaraz po pałeczkach Campylobacter, Salmonella i Yersinia, etiologicznym czynnikiem bakteryjnych zakażeń pokarmowych u ludzi w Europie (65). Pomimo tego, iż zakażenia pałeczkami VTEC występują u ludzi odpowiednio ok. 50 i 35 razy rzadziej niż zakażenia pałeczkami Campylobacter czy Salmonella, budzą ogromny niepokój i są uważane są za jedno z najważniejszych zagrożeń dla zdrowia publicznego (65). Jak wskazują dane epidemiologiczne, zakażenia pałeczkami VTEC były przyczyną wielu ognisk epidemicznych, niekiedy nawet o zasięgu międzynarodowym, z licznymi przypadkami śmiertelnymi (96). Szczególnie istotny w przypadku zakażeń VTEC-u ludzi jest także fakt, że do wywołania pełnoobjawowego zakażenia, w odróżnieniu od pałeczek Campylobacter czy Salmonella, wystarczy już kilka komórek bakteryjnych (109). Problem zakażeń pałeczkami VTEC u ludzi jest szczególnie ważny, ponieważ często wiąże się z nim duże ryzyko wystąpienia bardzo groźnych powikłań, w postaci zespołu hemolityczno mocznicowego czy małopłytkowej plamicy zakrzepowej (24). Warto podkreślić, że powikłania te występują nie tylko u osób z obniżoną odpornością, u małych dzieci czy starszych osób, ale również u osób dorosłych bez deficytów odporności (24). Powikłania u osób dorosłych szczególnie często odnotowywano podczas trwającego od maja do lipca 2011 roku, największego jak do tej pory na świecie ogniska HUS, wywołanego przez pałeczki VTEC O104:H4 (94). Prezentowana praca jest fragmentem rozprawy doktorskiej autorki pt; Analiza zróżnicowania chorobotwórczego potencjału, profili lekooporności oraz polimorfizmu genetycznego werotoksycznych pałeczek Escherichia coli izolowanych na terenie Polski. FILOGENEZA WEROTOKSYCZNYCH PAŁECZEK ESCHERICHIA COLI Pierwsze naukowe doniesienie wskazujące na istnienie pałeczek okrężnicy wytwarzających cytotoksynę, która jest neutralizowana przez przeciwciała dla toksyny Shigella dysenteriae typu 1 pojawiło się w 1977 roku (62). Konowalchuk i wsp. (62) wykazali wówczas, iż niektóre biegunkotwórcze pałeczki E. coli wytwarzają toksynę wywołującą efekt cytopatyczny na linii komórek Vero, którą nazwano werotoksyną. W 1983 roku O Brien i wsp. (82) opisali pierwsze ognisko epidemiczne wystąpienia krwawej biegunki po spożyciu hamburgerów w Stanach Zjednoczonych, wywołane przez pałeczki E. coli O157:H7 produkujące werotoksynę. W tym samym roku Johnson i wsp. (52) donieśli o zbiorowym zatruciu pokarmowym, z objawami krwotocznego zapalenia okrężnicy u ludzi w Kanadzie, które było wynikiem zakażenia werotoksycznymi pałeczkami E. coli O157:H7. Uważa się, iż głównym ewolucyjnym przodkiem werotoksycznych pałeczek E. coli O157:H7 były enteropatogenne pałeczki E. coli O55:H7, które w drodze ewolucji nabyły kolejno bakteriofaga posiadającego geny kodujące werotoksyny, klaster genów O157 rfb odpowiedzialnych za strukturę O-antygenu O157, plazmid wirulencji po157 i jednocześnie straciły zdolność do fermentacji D-sorbitolu i wytwarzania β-glukuronidazy (13, 117).

3 Nr 4 Werotoksyczne pałeczki E. coli 317 Analiza sekwencji genomu werotoksycznych pałeczek E. coli O157:H7 EDL933 (Numer GenBank AE ) wykazała, iż jego wielkość wynosi 5,5 Mb, z czego 4,1 Mb stanowią sekwencje konserwatywne, charakterystyczne dla niechorobotwórczych (fizjologicznych) pałeczek okrężnicy. Pozostała część to sekwencje specyficzne dla E. coli O157:H7 (87). Wśród nich większość stanowi obcy DNA nabyty na drodze horyzontalnego transferu. W jego skład wchodzi profag i elementy profag-like, których u E. coli O157:H7 jest aż 16 razy więcej w porównaniu z DNA pałeczek E. coli K-12 (117). Tym niemniej genom E. coli O157:H7 w porównaniu z genomem E. coli K-12 jest mniejszy o 0,53 Mb, co może świadczyć o tym, iż w ewolucji E. coli O157:H7 zaszła również redukcja genomu (87). Wśród werotoksycznych pałeczek E. coli wyróżnia się ponad 400 serotypów (35). Od osób z biegunką najczęściej izoluje się pałeczki VTEC należące do grupy serologicznej O157, nieco rzadziej O26, O103, O91, O145, O146, O128, O111, O113 (26). GŁÓWNE CZYNNIKI ZJADLIWOŚCI WEROTOKSYCZNYCH PAŁECZEK ESCHERICHIA COLI Głównymi czynnikami chorobotwórczości szczepów VTEC są dwie werotoksyny: werotoksyna I (VT I) i werotoksyna II (VT II). Geny kodujące werotoksyny (stx1 i stx2) zlokalizowane są w obrębie genomu różnych λ-like bakteriofagów zintegrowanych z chromosomem enterokrwotocznych bakterii w ściśle określonych miejscach insercyjnych (2, 24). W chromosomie pałeczek VTEC O157:H7 jak do tej pory opisano pięć sekwencji insercyjnych rozpoznawanych przez bakteriofagi kodujące werotoksyny (Stx-profagi). Wśród nich najczęściej wykorzystywane są sekwencje wrba i yehv (101). Geny kodujące podjednostki werotoksyny znajdują się w obrębie późnego operonu Stx-profaga. Geny stxa i stxb posiadają swój odrębny promotor oraz terminator, jednak wykazano, że są one również pod kontrolą promotorów P R i P R odpowiedzialnych za cykl replikacji profaga oraz cykl lityczny (112). VT I wykazuje prawie 100% homologię sekwencji aminokwasowej do toksyny Shiga, wytwarzanej przez szczepy Shigella dysenteriae typu 1. Ze względu na to podobieństwo werotoksyny określa się również mianem Shiga toxin (Stx) lub Shiga - like toxin (Slt). VT I wykazuje homologię sekwencji aminokwasowej do VT II na poziomie 56%. Werotoksyny te różnią się również właściwościami immunogennymi (24). Aktywność werotoksyn względem linii Vero nie jest krzyżowo neutralizowana przez przeciwciała dla heterologicznej toksyny (24). Wykazano, że werotoksyny występują w wielu różniących się sekwencją nukleotydową wariantach, które wykazują między sobą odmienną aktywność biologiczną (35). Struktura przestrzenna werotoksyn jest typowa dla toksyn typu AB 5 (81). Są one zbudowane z podjednostki A oraz 5 podjednostek B. Podjednostka A o masie molekularnej 23 kda składa się z podjednostki A1 o aktywności enzymatycznej oraz podjednostki A2, która pełni funkcje łącznika A1 z pentamerem podjednostek B. Pentamer białkowych podjednostek B (StxB) odpowiedzialny jest za wiązanie się werotoksyny ze specyficznym receptorem glikolipidowym Gb3 (globotriaosylceramid) znanym jako CD77 lub antygen P k ludzkich erytrocytów (w przypadku Stx2e Gb4). Receptor ten występuje na powierzchni błony komórkowej komórek jelita, nerek oraz śródbłonka naczyń. Po połączeniu z receptorem toksyna ulega endocytozie i trafia przez aparat Golgiego do retikulum endoplazmatycznego, skąd następnie podjednostka A1 jest przemieszczana do cytoplazmy. Tam podjednostka A1,

4 318 A. Januszkiewicz Nr 4 jako N - glikozydaza RNA, usuwa adeninę w pozycji 224 rybosomalnego RNA (rrna), w podjednostce 28S rybosomów. Prowadzi to do zablokowania syntezy białek i śmierci komórki eukariotycznej (79). WYSPA PATOGENNOŚCI LEE Większość werotoksycznych pałeczek E.coli wywołujących zakażenia u ludzi posiada mechanizm, dzięki któremu bakterie kolonizują nabłonek jelitowy i wpływają na istotne zmiany w funkcjonowaniu enterocytów. Powoduje to wystąpienie w enterocytach charakterystycznego efektu określanego jako A/E (attaching and effacing). Efekt ten polega na zaniku mikrokosmków jelitowych i ścisłej adhezji bakterii do komórek nabłonka jelita oraz na zmianie cytoszkieletu komórki nabłonka przez akumulację polimerów aktyny (24). Wystąpienie efektu A/E podczas zakażenia szczepami VTEC jest wynikiem ekspresji szeregu determinant genetycznych występujących na kodowanej chromosomalnie wyspie patogenności LEE (The Locus of Enterocyte Effacement) o wielkości 43 kb. Wyspa występuje zarówno u werotoksycznych jak i u enteropatogennych pałeczek E. coli (EPEC). W skład LEE wchodzi 41 genów zorganizowanych w trzy regiony. Pierwszy region skupia geny kodujące system sekrecji typu III, który odpowiada za translokację białek efektorowych. Drugi moduł koduje wytwarzanie białek sekrecyjnych EspA, B i D, które wchodzą w skład aparatu sekrecyjnego typu III. W ostatnim z modułów znajdują się geny kodujące intyminę - Eae oraz jej receptor Tir (24). Intymina jest białkiem o funkcji adhezyny, która umożliwia ścisły kontakt komórki bakteryjnej z komórką gospodarza, występującym zarówno u enteropatogennych szczepów E. coli (EPEC) jak i u szczepów VTEC (53). Intymina kodowana jest przez gen eae. Koniec 5 sekwencji kodującej intyminę jest wysoce konserwatywny, podczas gdy koniec 3 kodujący ostatnich 288 aminokwasów znajdujących się na C - końcu białka wykazuje znaczną heterogenność. Zmienny koniec 3 sekwencji eae odpowiada za wytwarzanie fragmentu intyminy związanego z łączeniem się białka z receptorem Tir a tym samym z enterocytami (24). W związku ze zmienną strukturą C - końca białka wyróżnia się różne typy intyminy określane jako α, β, ε, γ (53). Intymina typu α występuje najczęściej u szczepów EPEC, typu ε i γ najczęściej u VTEC. Intymina typu β występuje natomiast zarówno u EPEC i VTEC. Aby jednak mogło dojść do ścisłego kontaktu komórki bakteryjnej z komórką gospodarza niezbędny jest produkt genu tir, kodujący receptor dla intyminy. Receptor Tir dzięki systemowi sekrecji typu III ulega translokacji do błony komórkowej gospodarza, gdzie pełni główną rolę w procesie przylegania (24). PLAZMID WIRULENCJI PO157 Werotoksyczne pałeczki E. coli O157 zawierają wysoce konserwatywny plazmid nazywany po157. Jak do tej pory opublikowano kompletne sekwencje dwóch plazmidów po157 (15, 67). Plazmid po157 to niekoniugacyjny F-like plazmid o wielkości wahającej się między 94 kpz a 104 kpz. DNA plazmidu po157 zawiera różne mobilne elementy genetyczne, takie jak: transpozony, profagi, sekwencje insercyjne (IS) oraz fragmenty innych plazmidów, dlatego uważa się, iż powstał on w wyniku integracji ewolucyjnie niespokrewnionych

5 Nr 4 Werotoksyczne pałeczki E. coli 319 elementów genetycznych pochodzących od różnych organizmów (15, 67). W obrębie sekwencji nukleotydowej DNA plazmidu po157 stwierdzono obecność 100 otwartych ramek odczytu (ORF), z czego 35 jest potencjalnie związanych z patogenezą infekcji pałeczkami E. coli O157:H7. Jak do tej pory scharakteryzowanych zostało 19 z nich, wśród których do najlepiej opisanych należą: enterohemolizyna (ehx), katalaza-peroksydaza (katp), aparat sekrecji typu II (etp), proteinaza serynowa (espp), adhezyna (toxb), metaloproteaza cynkowa (efc). Biologiczne znaczenie plazmidu po157 w patogenezie zakażeń pałeczkami VTEC nie zostało do końca wyjaśnione. Werotoksyczne pałeczki E. coli non-o157 zawierają także duże plazmidy wielkości od 70 do 200 kpz nazywane po157-like, posiadające zazwyczaj operon ehx jednak inne spośród ww. genów występują na tych plazmidach nieregularnie (53). ENTEROHEMOLIZYNA (Ehx) Enterohemolizyna jest pierwszym z opisanych czynników zjadliwości obecnym na plazmidzie po157 (53). Fragment DNA kodujący geny odpowiedzialne za jej syntezę oraz transport (ehxcabd) obejmuje 3,4 kpz oraz wykazuje ponad 60% homologię sekwencji nukleotydowej do alfa-hemolizyny E. coli (98). Enterohemolizyna, podobnie jak alfa hemolizyna zaliczana jest do cytolizyn z rodziny RTX, do której należą ciepłochwiejne, wapniozależne, sekrecyjne cytotoksyny produkowane przez szereg bakterii Gram-ujemnych. Ehx prezentuje aktywność zarówno hemolizyny jak też leukotoksyny. Cytolizyna ta, nie tylko posiada właściwości hemolizowania ludzkich i bydlęcych erytrocytów, ale także jest swoiście aktywna w stosunku do leukocytów bydlęcych (5). Jej znaczenie w patogenezie VTEC nie zostało jednak jak dotąd szczegółowo poznane. Wykazano natomiast, że w surowicy pacjentów z zespołem hemolityczno mocznicowym wywołanym przez werotoksyczne pałeczki E. coli, obecne były przeciwciała klasy IgG swoiste dla enterohemolizyny (97). KATALAZA-PEROKSYDAZA (KatP) Enzym katalaza-peroksydaza (KatP) wykazuje wysoką homologię sekwencji do bifunkcjonalnych enzymów katalaza-peroksydaza występujących u innych bakterii (66). Enzym ten jest aktywny zarówno w cytoplaźmie jaki i peryplaźmie komórki bakteryjnej. Uważa się, że KatP bierze udział w redukcji reaktywnych form tlenu, które są przejawem aktywności lokalnej odpowiedzi immunologicznej. Nie stwierdzono obecności tego genu u innych pałeczek E. coli, takich jak: EPEC, ETEC, EIEC czy EAEC (66). SYSTEM SEKRECJI TYPU II (T2SS) System sekrecji typu II jest kodowany przez 13 genów nazywanych etpc-o (od etpc do etpo) zlokalizowanych na plazmidzie po157, w sąsiedztwie genów odpowiedzialnych za wytwarzanie enterohemolizyny. Geny etpc-o wykazują wysokie podobieństwo sekwencji nukleotydowej do systemu sekrecji typu II (T2SS) Gram-ujemnych bakterii, odpowiadając za wydzielanie egzoenzymów, toksyn oraz komponentów warstwy S (95). T2SS występuje u wszystkich szczepów VTEC O157:H7 oraz VTEC O157:H- oraz u wielu VTEC non-o157.

6 320 A. Januszkiewicz Nr 4 Jak do tej pory nie stwierdzono obecności tych genów u innych pałeczek E. coli, takich jak: EPEC, ETEC, EIEC czy EAEC (66). PROTEINAZA SERYNOWA (EspP) Zewnątrzkomórkowa proteinaza serynowa EspP kodowana przez plazmid po157 jest białkiem o niepoznanej jak dotąd funkcji. Jako proteinaza serynowa typu V, EspP jest zdolna do cięcia wielu substratów białkowych, między innymi pepsyny A oraz ludzkiego czynnika koagulacji typu V (12). Uważa się, iż lokalna degradacja czynnika V wewnątrz jelita przez proteazę EspP hamuje procesy krzepnięcia krwi, co skutkuje zwiększeniem krwawienia wewnątrz jelita grubego (12). W wielu badaniach wykazano jednak, że szczepy VTEC O157 fermentujące sorbitol (SF), które często stanowią przyczynę krwotocznych biegunek oraz zespołu hemolityczno-mocznicowego, nie posiadają na plazmidzie genu espp (3, 11, 28), co wskazuje na wątpliwą rolę tego białka w patogenezie VTEC. ADHEZYNA (ToxB) Adhezyna ToxB kodowana jest przez 9,5 kpz odcinek DNA, której produkt białkowy wykazuje 20% podobieństwo sekwencji do toksyny B Clostridium difficile (67). Ostatnie badania wykazały, że białko ToxB bierze udział w adhezji pałeczek E. coli O157:H7 do komórek Caco-2 (108). ToxB wykazuje także 47% podobieństwo sekwencji aminokwasowej do Efa-1/LifA, potencjalnego czynnika wirulencji obecnego w chromosomie pałeczek w grupy EPEC oraz non-o157 VTEC. Ponieważ wykazano, iż Efa-1 hamuje aktywację ludzkich i mysich leukocytów przypuszcza się, że również ToxB może pełnić podobne funkcje w organizmie człowieka (59). INNE CZYNNIKI CHOROBOTWÓRCZOŚCI WYSPA PATOGENNOŚCI O-122 Wyspa patogenności (PAI) O-122 występująca w szczepie EDL933 pałeczek E. coli O157:H7 to obszar 23 kpz składający się z 3 modułów oddzielonych od siebie mobilnymi elementami genetycznymi. Pierwszy moduł zawiera locus Z4321, którego produkt wykazuje 46% homologię sekwencji aminokwasowej do białka PagC, umożliwiającego pałeczkom Salmonella Typhimurium przetrwanie w makrofagach. Moduł 2 zawiera gen sen, którego produkt wykazuje 39% homologię sekwencji aminokwasowej do enterotoksyny Shigella oraz geny kodujące białka NleB i NleE o odpowiednio 89% i 86% homologii sekwencji aminokwasowej do niekodowanych przez wyspę LEE białek efektorowych Nle u Citrobacter rodentium. Trzeci moduł zawiera dwa geny efa1 i efa2, których produkty - białka Efa (tzw. EHEC factors of adherence) pełnią funkcję adhezyn odpowiedzialnych za przyleganie VTEC do komórek nabłonkowych jelita. Jak wynika z danych piśmiennictwa, moduły występujące w obrębie PAI O-122 mogą występować w różnorodnej konformacji względem siebie i PAI LEE. Wyspy O-122 i LEE są względem siebie funkcjonalnie zależne ponieważ system sekrecji typu III kodowany przez PAI-LEE odpowiada za sekrecję białek efektorowych z modułu 2 PAI-O122 (61).

7 Nr 4 Werotoksyczne pałeczki E. coli 321 ADHEZYNA AUTOAGLUTYNUJĄCA (Saa) Autoaglutynina Saa została opisana na początku lat dziewięćdziesiątych (86). Białko to kodowane jest przez gen saa, który jest zlokalizowany na plazmidzie po157. Adhezyna Saa występuje najczęściej u szczepów LEE negative (niewytwarzających intyminy) i jak się uważa, białko to odgrywa rolę w wywoływaniu zakażenia ludzi tymi szczepami. SUBTILAZA (SubAB) Werotoksyczne pałeczki E. coli oprócz werotoksyn mogą posiadać także inne cytotoksyny. Jedną z nich jest toksyna typu AB 5 nazywana subtilazą. Została ona po raz pierwszy opisana w 2004 roku przez Patona i wsp. (85), jako nowa toksyna wytwarzana przez izolat VTEC O113:H21, który był odpowiedzialny za wystąpienie ogniska HUS w Australii. Geny kodujące subtilazę (suba i subb) są zlokalizowane na dużym, koniugacyjnym plazmidzie po113. Podobnie do Stx, także SubAB wykazuje in vitro aktywność cytotoksyczną względem linii komórkowej Vero, przy czym powstanie efektu cytopatyczego nie jest neutralizowane przez surowicę anty-stx. Subtilaza obecna jest zwykle u werotoksycznych pałeczek E.coli LEE - negative jednak, jak wynika z badań przeprowadzonych przez Tazzoli (110), Buvens (16), Irino (43), szczepy produkujące SubAB najczęściej należą do grupy VTEC non O157. MIESZANE PATOTYPY E. COLI W ostatnich latach pojawiło się wiele doniesień naukowych opisujących występowanie wśród pałeczek okrężnicy izolowanych od ludzi, zwierząt i środowiska, szczepów posiadających równocześnie determinanty chorobotwórczości charakterystyczne dla różnych patotypów E. coli (6, 74, 89). Prager i wsp. (89) dokonując molekularnej charakterystyki 24 izolatów VTEC wytwarzających werotoksynę Stx2g, pochodzących z materiału klinicznego, od zwierząt oraz ze środowiska, wykryli, iż wszystkie badane izolaty, oprócz genu stx2a, posiadały także gen st1a. Co więcej, jak wykazano w teście immunoenzymatycznym ST EIA, badane szczepy aktywnie wytwarzały ciepłostabilną enterotoksynę STIa (89). Pojawianie się przypadków zakażeń u ludzi szczepami wykazującymi cechy zarówno werotoksycznych jak i enterotoksycznych pałeczek E. coli, które dotychczas izolowane były wyłącznie od zwierząt lub ze środowiska, może wskazywać na rozprzestrzenianie się w środowisku nowego, stanowiącego zagrożenie dla zdrowia człowieka patotypu E. coli (89). Niepokojącym jest fakt, iż występowanie wspomnianych mieszanych patotypów może być przyczyną szerzenia się nowych szczepów o zwiększonej zjadliwości (6, 74, 89). Zjawisko takie obserwowano w bieżącym roku, podczas jednego z największych jak do tej pory ognisk HUS w Europie, które wywołał epidemiczny szczep E. coli O104:H4. Szczep ten wykazywał cechy dwóch patotypów pałeczek okrężnicy: enteroagregacyjnego i werotoksycznego (6). Wyniki sekwencjonowania genomu epidemicznego szczepu E. coli O104:H4, które pojawiły się niespełna miesiąc po ogłoszeniu epidemii, wykazały, iż badany szczep posiadał strukturę genomu charakterystyczną dla enteroagregacyjnych pałeczek E. coli, oraz dodatkowo, posiadał Stx-profaga kodującego werotoksynę Stx2a (68). Zdaniem tych autorów wystąpienie patotypu mieszanego (VTEC, EAEC) zdecydowanie wpłynęło

8 322 A. Januszkiewicz Nr 4 na zwiększenie zjadliwości szczepu, czego odzwierciedleniem był wspomniany już wcześniej wysoki odsetek występowania HUS wśród zakażonych osób (6, 14, 68). Epidemiczny szczep VTEC O104:H4, poza obecnością werotoksyny II, nie posiadał innych markerów charakterystycznych dla pałeczek VTEC jak intymina (eae) oraz enterohemolizyna (ehx). ZAKAŻENIA WEROTOKSYCZNYMI PAŁECZKAMI E. COLI Werotoksyny odgrywają kluczową rolę w patogenezie zakażeń wywołanych przez werotoksyczne szczepy E. coli u ludzi. Szczepy VTEC wywołują u ludzi krwotoczne zapalenie okrężnicy lub rzadziej bezkrwawą biegunkę. W kilkunastu procentach przypadków konsekwencje zakażenia pałeczkami VTEC mogą być znacznie cięższe, ponieważ prowadzą do wystąpienia u chorego różnych powikłań, takich jak zespół hemolityczno - mocznicowy (haemolytic ureamic syndrome - HUS) czy małopłytkowa plamica zakrzepowa (thrombotic thrombocytopenic purpura TTP) znana jako choroba Moschcowitza. Zakażenie szczepami VTEC u większości pacjentów zaczyna się od skurczowych bólów brzucha, nieznacznego podniesienia ciepłoty ciała oraz wystąpienia bezkrwawej biegunki trwającej 1-3 dni. Następnie, w większości przypadków, bezkrwawa biegunka przechodzi w postać z domieszką krwi. W tym okresie biegunki, trwającym od 2 do 8 dni, chory rzadko gorączkuje natomiast zazwyczaj narzeka na ból brzucha. Czas trwania choroby bez powikłań wynosi 1-12 dni, średnio 6-8 dni. Jednak w niektórych przypadkach, zwłaszcza u dzieci i u osób starszych, może nastąpić pogorszenie stanu zdrowia wynikające z rozwinięcia się zespołu hemolityczno - mocznicowego czy małopłytkowej plamicy zakrzepowej. Zespół hemolityczno mocznicowy (Haemolytic ureamic syndrome - HUS) został po raz pierwszy opisany w 1955 roku przez Gassera i wsp. (36). Zespół ten jest definiowany jako triada objawów klinicznych, takich jak: niedokrwistość hemolityczna z fragmentacją krwinek czerwonych, małopłytkowość i ostra niewydolność nerek (103). Wystąpienie choroby warunkowanie jest współdziałaniem wielu czynników etiologicznych: infekcyjnych, genetycznych, immunologicznych oraz fizyko-chemicznych, które łączy zdolność do uszkadzania śródbłonka naczyń z miejscowym wykrzepianiem śródnaczyniowym, aktywacją płytek krwi i uszkodzeniem krwinek czerwonych (103). Różna etiopatogeneza stanowi podstawę klasyfikacji zespołu na trzy postaci: D+HUS - typowa postać z biegunką poprzedzającą, atypowa postać D-HUS bez poprzedzającej biegunki oraz wtórna postać HUS (103). Typowa, poprzedzona biegunką postać zespołu hemolityczno mocznicowego (D+HUS) występuje w około 90% przypadków u dzieci poniżej 10 roku życia, notuje się również przypadki jej wystąpienia u osób starszych, powyżej 60 roku życia. D+HUS najczęściej stanowi powikłanie zakażenia VTEC. Śmiertelność u dzieci z D+HUS wynosi około 5% i jest głównie konsekwencją przewlekłej niewydolności nerek. Atypowa postać D-HUS nie jest poprzedzona biegunką i występuje u osób w każdym wieku, jednak również najczęściej u dzieci. Przebieg choroby bywa mniej ostry niż D+HUS jednak występuje wysokie ryzyko wielokrotnych nawrotów choroby (103). Opisano także wtórne postaci HUS występujące po lekoterapii, u kobiet w ciąży, u osób z chorobą nowotworową czy chorobami układowymi, a także w toku infekcji górnych dróg oddechowych (1). Dane piśmiennictwa wskazują, iż powikłania w postaci HUS występują znacznie częściej w wyniku zakażenia szczepami E. coli wytwarzającymi werotoksynę II niż szczepami

9 Nr 4 Werotoksyczne pałeczki E. coli 323 wytwarzającymi VT I (32, 37, 53). Analiza występowania D+HUS o etiologii VTEC wśród dzieci przeprowadzona na przełomie lat w Niemczech i Austrii wykazała, iż w 52% (n=92) próbek kału pobranych od pacjentów występowała werotoksyna typu II (37). Friedrich i wsp. stwierdzili, że wśród 626 szczepów VTEC izolowanych od pacjentów z D+HUS, 323 szczepy (51,6%) wytwarzały różne warianty werotoksyny II (32). Większa zdolność do wywoływania HUS przez szczepy wytwarzające VT II może wynikać z większej toksyczności tej werotoksyny, co zostało dowiedzione na licznych modelach zwierzęcych oraz w teście cytotoksyczności in vivo (17). Małopłytkowa plamica zakrzepowa (thrombotic thrombocytopenic purpura TTP) po raz pierwszy została opisana przez Moschcowitza w 1925 roku (76). Jest to zakrzepowe zapalenie naczyń włosowatych przypominające pod względem histopatologicznym HUS. Choroba występuje głównie u osób dorosłych i towarzyszą jej widoczne zaburzenia neurologiczne takie jak zamroczenie, niedowłady lub porażenia, zaburzenia mowy i połykania, drgawki toniczne, zaburzenia psychiczne, śpiączka. REZERWUAR WEROTOKSYCZNYCH PAŁECZEK E. COLI Naturalnym rezerwuarem werotoksycznych szczepów E. coli jest przewód pokarmowy przeżuwaczy. Wykazano, iż na całym świecie szczepy VTEC stanowią mikroflorę układu pokarmowego zwierząt gospodarskich, takich jak: bydło, owce, świnie oraz kozy (7, 10, 17, 18, 21, 56, 64, 88, 114). Wielu autorów wskazuje bydło domowe jako najbardziej istotne źródło werotoksycznych pałeczek E. coli i dotyczy to zarówno osobników zdrowych jak również zwierząt z objawami biegunki (17). Badania przeprowadzone w Australii metodami biologii molekularnej wykazały obecność genów kodujących werotoksyny w 16,7% próbek kału pobranych od zdrowych cieląt (21). Podobne badania przeprowadzone w Brazylii wykazały, że geny kodujące VT były obecne aż w 82% próbek kału pobranych od mlecznych krów oraz w 53% próbek pochodzących od rzeźnych krów (18). Z kolei odsetek izolacji pałeczek VTEC O157 z próbek kału pobranych od zdrowych krów we Włoszech wynosił 13,1% (10), w Hiszpanii odsetek ten wynosił odpowiednio 20% u zdrowych krów i 26% u zdrowych cieląt (7), a we Francji VTEC O157 wyhodowano z kału 34% zdrowych krów (88). Jak wynika z badań przeprowadzonych w kilku krajach europejskich, Japonii oraz Stanach Zjednoczonych częstość występowania pałeczek VTEC O157 w odchodach świń jest znacznie niższa i waha się od 0,2% do 2% (9, 41, 50, 78). Jak wynika z badań Oseka i Winiarczyka (83) oraz Sobieszczańskiej i wsp. (105) werotoksyczne pałeczki E.coli występują u zdrowego bydła również w Polsce. Badania prowadzone przez Oseka i Winiarczyka (83). wykazały, iż wśród szczepów E.coli wyizolowanych od 132 zdrowych, 4-8 tygodniowych cieląt, 5,4% stanowiły szczepy werotoksyczne. Sobieszczańska wsp. (105) na podstawie badań przeprowadzonych w 2005 roku wykazali, że u 21,4% przebadanych zdrowych cieląt oraz u 8,1% zdrowych krów były obecne werotoksyczne pałeczki E. coli. Zwierzęta są jednocześnie nosicielami jak i siewcami patogennych bakterii, dlatego pałeczki VTEC mogą być izolowane z gleby lub wody, gdzie trafiają wraz z odchodami (56, 114). Bakterie mogą utrzymywać się w środowisku od kilku tygodni do kilkunastu miesięcy, co stanowi potencjalne zagrożenie dla zdrowia człowieka (17, 79, 84). Badania przeprowadzone przez Bolton i wsp. (8) wykazały, iż pałeczki VTEC wydalone przez zwierzęta

10 324 A. Januszkiewicz Nr 4 mogą przeżywać w środowisku nawet do 99 dni. Wydalanie pałeczek VTEC przez zwierzęta związane jest bezpośrednio z ich wiekiem (40). Liczne badania wskazują na większe wydalanie pałeczek VTEC przez cielęta bezpośrednio po odstawieniu od matki niż w przypadku starszych cieląt czy dorosłego bydła (80, 102). Dodatkowo stwierdzono, że wzmożone wydalanie pałeczek VTEC przez zdrowe bydło przypada na okres letni i jesienny, co odpowiada okresowi zwiększonej zachorowalności u ludzi (20, 25, 49). Spożywanie surowych, niedomytych warzyw uprawianych w glebie, z dodatkiem obornika zawierającego pałeczki VTEC, stanowi potencjalne źródło zakażenia człowieka tymi drobnoustrojami. Szybkiemu rozprzestrzenianiu się zakażeń sprzyja bardzo niska dawka zakażająca, szacowana na ok. 50 komórek bakteryjnych, wystarczających do wywołania pełnoobjawowego zakażenia u człowieka (109). W Wielkiej Brytanii, od 1992 do 2009 roku, odnotowano wystąpienie 30 epidemicznych ognisk zakażenia werotoksycznymi szczepami E. coli O157 u dzieci odwiedzających tzw. mini zoo, wynikających z kontaktu dzieci ze zwierzętami jak również z bezpośredniego kontaktu z odchodami zwierząt, będących nosicielami VTEC O157 (39). Rezerwuarem VTEC są także zwierzęta wolnożyjące, takie jak: jelenie, zające czy ptaki, a także zwierzęta towarzyszące człowiekowi: psy i konie (17, 111). Badania przeprowadzone przez Renter i wsp. (93) wykazały obecność pałeczek VTEC O157 w kale dzikich jeleni w Nebrasce. Pritchard i wsp. (90) donieśli o występowaniu pałeczek VTEC O157 u dzikich królików, natomiast Schmidt i wsp. (99) wykazali, że u gołębi występują werotoksyczne pałeczki E. coli wytwarzające wariant genu stx2f. Wstępne badania własne wykazały również obecność pałeczek VTEC O157 u żubrów występujących na terenie Białowieskiego Parku Narodowego. Niewątpliwie najczęstszą drogą zakażenia się człowieka pałeczkami VTEC jest spożycie skażonego produktu żywnościowego pochodzenia zwierzęcego. W 2003 roku Scientific Committee on Vetrinary Relating to Public Health on verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) in foodstuffs określił rodzaje żywności, które mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia ludzi spowodowane ich potencjalnym skażeniem pałeczkami VTEC. Są to przede wszystkim: surowa i niedogotowana wołowina oraz mięso innych przeżuwaczy, mięso mielone i surowe przetwory fermentowane, niepasteryzowane mleko i jego przetwory, kiełki, niepasteryzowane soki owocowe i warzywne oraz woda. ( Każdego roku na świecie opisywane są przypadki zakażenia ludzi pałeczkami VTEC w wyniku spożycia skażonych nimi produktów żywnościowych (CDC). Na przełomie maja i sierpnia 2008 w Stanach Zjednoczonych odnotowano dwa ogniska epidemiczne zakażenia tym samym szczepem VTEC O157 (pierwsze liczące 64 osób, drugie 35 osób), będące wynikiem spożycia przetworów wołowiny pochodzących z jednego źródła (72). De Schrijver i wsp. (23) opisali ognisko epidemiczne zakażenia werotoksycznymi szczepami E. coli O145:H28 i O26:H11 u 12 osób w Belgii po spożyciu skażonych lodów produkowanych na terenie miejscowej farmy. Istnieje także szereg doniesień dotyczących wystąpienia ognisk epidemicznych zakażeń pałeczkami VTEC u ludzi po spożyciu warzyw, takich jak: szpinak (115), sałata (33) kiełki białej rzodkwi (70) czy kiełki kozieradki (27). Również w Polsce badania przeprowadzone przez Oseka w 2008 wykazały obecność genów kodujących werotoksyny w 13 z 221 (5,9%) próbek mięsa wołowego pochodzącego od bydła z 4 województw w Polsce. Ponadto w 2011 roku Wieczorek i wsp. (118) wykazali obecność szczepów VTEC w 20 z 406 (4,9%) wołowych skór oraz w 12 z 406 (3%) wołowych tusz pochodzących z trzech wschodnich województw w Polsce. Co więcej wyodrębnione przez

11 Nr 4 Werotoksyczne pałeczki E. coli 325 autorów szczepy VTEC należały do bardzo rzadko występujących serotypów. Zdaniem autorów mięso mogło stanowić potencjalne źródło zakażenia ludzi (118). Natomiast inne badanie, przeprowadzone przez Szpakowską i wsp. (107), nie wykazały obecności pałeczek VTEC w próbkach surowego mięsa wykorzystywanego do obróbki w punktach zbiorowego żywienia jednostek wojskowych. Badania przeprowadzone przez Chapmana i wsp. (19) wskazują na znaczną częstość (2,9%) izolacji pałeczek VTEC z produktów pochodzenia owczego, co również stwarza potencjalne zagrożenie dla człowieka. Znacznie rzadziej do zakażenia werotoksycznymi pałeczkami E. coli może dojść na drodze bezpośredniego kontaktu z chorym człowiekiem. Wykazano, że człowiek może wydalać pałeczki VTEC z kałem nawet do 3 tygodni (53). W warunkach domowych do zakażenia może dojść także przez kontakt z posoką pochodzącą z surowego, skażonego mięsa, zwłaszcza wołowego, po przeniesieniu bakterii z rąk osoby przygotowującej potrawę na inne osoby, na sprzęt kuchenny lub przygotowywane potrawy niepoddawane dalszej obróbce cieplnej. EPIDEMIOLOGIA ZAKAŻEŃ WYWOŁANYCH PRZEZ WEROTOKSYCZNE PAŁECZKI ESCHERICHIA COLI W POLSCE I NA ŚWIECIE Definicja zakażenia shigatoksycznym szczepem Escherichia coli (STEC/VTEC) stosowana w krajowym nadzorze epidemiologicznym jest zgodna z definicją obowiązującą w krajach Unii Europejskiej podaną w Dyrektywie 2002/253/EC. Kryteria kliniczne to wystąpienie biegunki i/lub bólów brzucha, natomiast dla HUS to wystąpienie ostrej niewydolności nerek z mikroangiopatyczną niedokrwistością hemolityczną i/lub trombocytopenią. Do kryteriów laboratoryjnych zalicza się wystąpienie jednego z trzech kryteriów: izolacja szczepu E. coli wytwarzającego shiga- lub werotoksynę, wykrycie DNA genów kodujących shiga- lub werotoksynę bądź też wykrycie wolnych shigatoksyn. Przypadki zakażenia shigatoksycznym szczepem Escherichia coli podlegają w Polsce obowiązkowej rejestracji, na mocy ustawy o chorobach zakaźnych i zakażeniach, (Dz. U Nr 234, poz.1570). Przypadki wystąpienie zakażeń pałeczkami VTEC w Polsce opracowywane i publikowane są przez Zakład Epidemiologii NIZP-PZH w postaci dwutygodniowych, kwartalnych i rocznych raportów dostępnych na stronie internetowej /epimeld/index_p.html pod postacią meldunków o zachorowaniach na choroby zakaźne i zatrucia w Polsce oraz w postaci biuletynów rocznych. Począwszy od 2003 roku obowiązuje w Polsce rejestracja zakażeń wywołanych przez werotoksyczne pałeczki E. coli (w meldunkach nazywane enterokrwotocznymi). Każdy zgłoszony przypadek zakażenia jest weryfikowany przez Zakład Bakteriologii we współpracy z Zakładem Epidemiologii NIZP PZH. Jak wynika z danych zgromadzonych przez NIZP PZH w latach notowano w Polsce od 2 do 6 laboratoryjnie potwierdzonych przypadków zachorowań rocznie, za wyjątkiem roku 2009, w którym nie stwierdzono wystąpienia żadnego przypadku zakażenia szczepami VTEC (meldunki o chorobach zakaźnych: W porównaniu z innymi krajami europejskimi, takimi jak: Wielka Brytania (1339 przypadków zakażenia VTEC w roku), Niemcy (878) czy Holandia (313) zakażenia układu pokarmowego wywoływane przez werotoksyczne pałeczki E. coli występują w Polsce sporadycznie (patrz raport EFSA za rok 2009 ) Począwszy od 1994 r. do

12 326 A. Januszkiewicz Nr roku wszystkie wyizolowane w Polsce od ludzi szczepy VTEC O157 (31 izolatów), nadesłane ze stacji sanitarno epidemiologicznych, potwierdzone w NIZP PZH, izolowane były z przypadków sporadycznych zachorowań. Jak wynika z raportu Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) (26), w Europie w 2009 roku najwyższą zapadalność na biegunki o etiologii VTEC (liczba zachorowań przypadająca na osób) zanotowano w Irlandii (5,33) oraz w Danii (2,9), kolejno w Szwecji (2,46), Islandii (2,5), Norwegii (2,25) oraz Wielkiej Brytanii (2,19). Najniższą zapadalność mieszczącą się w granicach < 0,1, stwierdzono w Bułgarii, Węgrach, Litwie, Łotwie, Polsce, Rumunii oraz na Cyprze. Dane dotyczące zakażeń pałeczkami VTEC na kontynencie amerykańskim przedstawiają się podobnie jak w Europie. Jak wynika z raportów sieci FoodNet (Foodborne Diseases Active Surveillance Network) (71) monitorującej zakażenia bakteryjne przenoszone przez żywność (tzw. foodborn disesases) w 10 stanach w USA, w 2009 roku odnotowano 459 przypadków zakażenia pałeczkami VTEC O157 (zapadalność wynosiła 0,99 na mieszkańców) oraz 264 przypadków zakażenia pałeczkami VTEC non - O157 (zapadalność 0,57). Ogółem zapadalność na biegunkę o etiologii VTEC w Stanach Zjednoczonych w 2009 roku wynosiła 1,56. W 2009 roku w Europie wśród potwierdzonych przypadków zakażeń szczepami VTEC u ludzi stwierdzono 242 przypadków zespołu hemolityczno mocznicowego ( efsa.europa.eu/en/scdocs/doc/1496.pdf). Większość zgłoszonych przypadków D+HUS (47%) związana była z zakażeniem werotoksycznymi pałeczkami E. coli O157. Pozostałe przypadki dotyczyły zakażeń wywołanych przez szczepy należące do takich grup serologicznych jak: O26, O103, O111, O145 oraz innych niewymienionych szczegółowo w raporcie. Pięćdziesiąt procent zgłoszonych przypadków HUS dotyczyło dzieci do 4. roku życia. Do roku 2011 w Polsce zgłoszono pięć przypadków wystąpienia zespołu hemolityczno mocznicowego o potwierdzonej etiologii VTEC. Pierwszy przypadek wystąpienia zespołu hemolityczno mocznicowego zgłoszono w 2008 roku u dziecka zakażonego VTEC O157. Kolejny przypadek wystąpił u 18 miesięcznego dziecka po zakażeniu pałeczką VTEC O111 (46). Ostatnie trzy przypadki wystapienia HUS odnotowano u osób zakażonych epidemicznym szczepem VTEC O104:H4 (47). W Stanach Zjednoczonych liczba zgłoszonych przypadków HUS wśród dzieci i młodzieży poniżej 18 roku życia wynosiła 64, z czego 52 przypadki dotyczyły dzieci poniżej 5 roku życia (72). Zdaniem wielu autorów zakażenia wywołane werotoksycznymi pałeczkami E. coli występują równie często w postaci sporadycznych zachorowań jak i ognisk epidemicznych (23, 27, 92). Duże ogniska zakażeń pałeczkami VTEC były zazwyczaj powodowane spożyciem skażonej bakteriami niedogotowanej wołowiny, mleka lub surowych warzyw. W ostatnich latach w Europie odnotowano kilka dużych ognisk zakażeń po spożyciu żywności skażonej werotoksycznymi pałeczkami E. coli (27, 96). W Danii w 2007 roku miało miejsce zakażenie spowodowane spożyciem skażonych pałeczkami VTEC wołowych kiełbasek (30). Ognisko objęło 20 osób z objawami zapalenia żołądkowo-jelitowego i potwierdzonym laboratoryjnie zakażeniem VTEC. Jednocześnie autorzy pracy donoszą, że liczba zakażonych osób prawdopodobnie była większa. W Belgii w 2007 roku odnotowano wystąpienie ogniska zakażenia pokarmowego po spożyciu lodów skażonych pałeczkami VTEC (23). Na początku maja 2011 roku w Niemczech zarejestrowano wystąpienie ogniska pokarmowego wywołanego przez werotoksyczne pałeczki E. coli O104:H4. Ognisko trwa-

13 Nr 4 Werotoksyczne pałeczki E. coli 327 jące ponad trzy miesiące objęło swym zasięgiem 14 państw Europy, w tym Polskę (48), jak również odnotowano przypadki zachorowań w Stanach Zjednoczonych i Kanadzie (94). Ogółem zakażeniu uległo ponad 4000 osób, wśród których aż u ponad 900 rozwinął się zespół hemolityczno mocznicowy. W wyniku zakażenia doszło do zgonu 51 osób. Szczepem, który wywołał epidemię była pałeczka E. coli z grupy serologicznej O104:H4, posiadająca markery zjadliwości charakterystyczne dla dwóch grup patogennych E. coli: enteroagregacyjnych i werotoksycznych (14, 68). Źródłem zakażenia były kiełki nasion kozieradki importowanej do Europy z Egiptu (27). Jak do tej pory było to największe ognisko krwotocznego zapalenia okrężnicy w Europie i HUS na świecie. W ostatnich latach istotnym etiologicznym czynnikiem zakażeń wywoływanych przez VTEC O157 są pałeczki szybko fermentujące sorbitol tzw. SF (Sorbitol - Fermenting) VTEC O157:H-, (54, 55). Fermentujące sorbitol pałeczki VTEC O157:H- po raz pierwszy zostały wyizolowane w 1988 roku od chorych w ognisku zatrucia pokarmowego w Niemczech (55). Obecnie drobnoustroje te są odpowiedzialne za ponad dwadzieścia procent zakażeń wywołanych werotoksycznymi pałeczkami E. coli O157 w tym kraju (54). Pałeczki SF VTEC O157:H- izolowane były w wielu krajach Europy i świata (4). W Polsce dotychczas wyizolowano dwa szczepy pałeczek SF VTEC O157:H- w 2007 i 2008 roku. Pierwszy szczep izolowany był od dziecka z biegunką a drugi od dorosłej osoby (45). Jak wynika z danych piśmiennictwa SF VTEC O157:H- izolowane są zarówno z przypadków sporadycznych zachorowań jak i ognisk zatrucia pokarmowego (4, 54). Szczyt zachorowań wywołanych przez szczepy SF VTEC O157 przypada na okres od września do kwietnia, w przeciwieństwie do zachorowań wywołanych przez szczepy NSF VTEC O157, których najwięcej notuje się między czerwcem a sierpniem (54). Ponadto stwierdzono, że zakażenie dzieci szczepami SF VTEC O157:H- stanowi bardzo istotny prognostyk wystąpienia zespołu hemolityczno mocznicowego (54). Wyniki badań przeprowadzonych w Niemczech w latach wykazały, że szczepy SF VTEC O157:H- stanowiły od 13,3% do 40,5% wśród wszystkich VTEC O157 wyizolowanych od pacjentów z HUS (54). MECHANIZMY OPORNOŚCI WEROTOKSYCZNYCH PAŁECZEK ESCHERICHIA COLI NA WYBRANE ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI Wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki werotoksycznych szczepów E. coli na przestrzeni 20 lat uległa zauważalnym zmianom. W latach osiemdziesiątych XX wieku szczepy VTEC uważano za wrażliwe na niemal wszystkie stosowane w lecznictwie antybiotyki i chemioterapeutyki (91). Jednak dane piśmiennictwa z ostatnich dwóch dekad wskazują, że wśród pałeczek VTEC wzrasta liczba szczepów opornych na leki, szczególnie należących do innych niż O157 grup serologicznych (31, 34, 57, 69, 106, 120). Jak wynika z prac Kim i wsp. (58) 7% spośród 176 szczepów wyizolowanych z próbek kału od pacjentów w jednym ze szpitali w Waszyngtonie w latach było opornych na streptomycynę, sulfonamidy i tetracyklinę, podczas gdy wyniki takich samych badań przeprowadzonych wcześniej, to jest w latach , wskazywały na pełną wrażliwość wszystkich badanych szczepów VTEC (n = 56). W latach w Anglii i Walii około 20% wśród 3429 szczepów VTEC O157 izolowanych od ludzi było opornych na antybiotyki, głównie na streptomycynę oraz tetracyklinę (119). Dane piśmiennictwa dotyczące lekowrażliwości

14 328 A. Januszkiewicz Nr 4 szczepów VTEC izolowanych od ludzi w 1996 roku w Niemczech wskazują, że jedynie 1 (1,3%) szczep z 78 szczepów VTEC O157 wykazywał oporność na antybiotyki, podczas gdy w grupie VTEC non-o157 aż 18 (23,1%) było opornych na leki (100). Ponadto wśród szczepów VTEC non O157 izolowanych od ludzi i bydła w Indiach na przełomie lat aż 49% wykazywało oporność na jeden lub więcej antybiotyków (57). Podobne dane dotyczyły lekooporności szczepów VTEC non O157 izolowanych od ludzi Finlandii w latach dziewięćdziesiątych i wynosiły 21% (n=56) (29). Werotoksyczne pałeczki E. coli wykazują głównie oporność na chemioteraupeutyki z grupy aminoglikozydów, sulfonamidów i tetracyklin (38, 73, 121). Zhao i wsp. (121) stwierdzili, że badane werotoksyczne szczepy E.coli O157:H7 pochodzące z różnych źródeł były najczęściej oporne na takie leki jak: sulfametoksazol (93%) tetracyklina (93%) i streptomycyna (76%). Giammanco i wsp. (38) wykazali, iż 13 (61,9%) na 21 szczepów VTEC izolowanych w północnych Włoszech od dzieci, bydła i z żywności było opornych na przynajmniej jeden chemioteraupeutyk, w tym oporność dotyczyła najczęściej sulfonamidów, streptomycyny, tetracykliny lub trimetoprimu. Analiza lekooporności szczepów VTEC izolowanych z różnych źródeł w latach od 1992 do 1999 w Hiszpanii wykazała, iż 41% z pośród 722 badanych szczepów wykazywało oporność na przynajmniej jeden antybiotyk (73). Wśród badanych pałeczek VTEC O157 największy odsetek opornych szczepów w grupie izolatów pochodzących od bydła (53%), izolowanych z mięsa wołowego (57%) oraz od ludzi (23%) i od owiec (20%). Wśród pałeczek VTEC non-o157 najwyższy odsetek opornych szczepów izolowano z mięsa wołowego (55%) oraz od ludzi (47%). Szczepy te były najczęściej oporne na sulfametoksazol (36%), tetracykliny (32%), streptomycynę (29%), ampicylinę (10%), trimetoprim (8%), kotrimoksazol (8%), chloramfenikol (7%) oraz kanamycynę (7%) (73). Mechanizm oporności na antybiotyki beta-laktamowe związany z wytwarzaniem β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) jest szeroko rozpowszechniony u bakterii Gram ujemnych występujących w środowisku szpitalnym (22). Bakterie z rodziny Enterobacteriacae wytwarzające enzymy ESBL (ESBL+) zaliczane są do patogenów alarmowych, stanowiących bardzo poważny problem w chemioterapii zakażeń. Geny kodujące β-laktamazy typu ESBL występują na plazmidach koniugacyjnych co powoduje, że łatwo ulegają przenoszeniu do innych bakterii na drodze horyzontalnego transferu genów. Dodatkowo szczepy ESBL+ wykazują często fenotyp MDR, co prowadzi do ograniczenia możliwości doboru skutecznej antybiotykoterapii (22). Wśród szczepów VTEC stanowiących materiał badań prezentowanej rozprawy, nie stwierdzono zdolności ESBL+. Uzyskane wyniki potwierdzają spostrzeżenia autorów z innych krajów, którzy w swoich badaniach nie wykazali obecności szczepów o fenotypie ESBL+ wśród izolatów VTEC wyodrębnionych z różnych źródeł (38, 73, 100, 121). Jednakże w dostępnym piśmiennictwie istnieją doniesienia opisujące przypadki wystąpienia szczepu VTEC ESBL+. Jedno z pierwszych doniesień, opublikowane w 2005 roku przez Ishii i wsp. (44) dotyczyło szczepu VTEC O26:H11 wyizolowanego w Tokio z kału 9 letniego dziecka wytwarzającego enzym ESBL CTX-M-18. W tym samym roku w Japonii opisano drugi przypadek wystąpienia biegunki spowodowanej zakażeniem szczepem VTEC O26, który wytwarzał enzym ESBL CTX-M-3 (60). O tym, że zjawisko wytwarzania enzymów ESBL przez pałeczki VTEC staje się coraz bardziej powszechne, dobitnie wykazało ognisko HUS wywołane przez pałeczki VTEC O104:H4 w maju 2011 roku (6). Szczep, który wywołał zakażenie u ponad 4 tysięcy osób, wytwarzał

15 Nr 4 Werotoksyczne pałeczki E. coli 329 β-laktamazę ESBL CTX-M-15, wykazując oporność na szereg leków przeciwbakteryjnych (6). Wielolekooporność szczepu epidemicznego, jak sugerują eksperci, stanowiła między innymi przyczynę nietypowego przebiegu ogniska, jego szerokiego zasięgu oraz dużego odsetka występowania powikłań w postaci HUS (25%). Rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki w wyniku horyzontalnego transferu genów stanowi niewątpliwie istotny problem szerzenia się lekooporności wśród klinicznych izolatów bakteryjnych. Proces ten zachodzi łatwiej gdy geny warunkujące oporność znajdują się w obrębie mobilnych kaset genomowych. Kasety te lokalizują się często w obrębie większych mobilnych elementów genetycznych takich jak integrony (116). Jak do tej pory opisano cztery klasy integronów, związanych ściśle z odpowiednimi dla siebie integrazami: integrazą 1- Int1, integrazą - Int2, integrazą - Int3, integrazą - Int4. Wszystkie integrony, z wyjątkiem integronu klasy 4, występującego u Vibrio cholerae związane są z kasetami genomowymi warunkującymi oporność na leki. Wielu badaczy wykryło u pałeczek VTEC obecność genów warunkujących oporność na leki w obrębie mobilnych elementów genetycznych, takich jak integrony. Opisano także transfer in vitro tych genów do innych rodzajów bakterii. Zhao i wsp. (121) u 9 (18,0%) spośród 50 lekoopornych izolatów VTEC pochodzących od ludzi, bydła i z mięsa zidentyfikowali i opisali geny oporności na antybiotyki zlokalizowane w obrębie integronu klasy 1. Autorzy ci wykazali, iż integrony te obecne były na plazmidach oraz mogły być przenoszone drogą koniugacji do innych bakterii (121). Walsh i wsp. (113) wśród 38 opornych na leki szczepów VTEC u dwóch z nich wykazali obecność integronu klasy 1, zawierającego kasetę genomową warunkującą oporność na antybiotyki beta-laktamowe (gen tem-1). W przypadku jednego ze szczepów wykazano in vitro transfer ww. oporności w następstwie koniugacji i transformacji. Drugi ze szczepów w warunkach laboratoryjnych nie wykazał zdolności do przenoszenia zlokalizowanych w obrębie integronu genów warunkujących oporność na leki (113). Integron klasy 1 jest najczęściej spotykany wśród klinicznych izolatów pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae od ludzi, w tym także u VTEC, jak również u pałeczek E. coli izolowanych od zwierząt (75, 77, 104, 121). Singh i wsp. (104) wykazali obecność integronu klasy 1 u 43 (15,7%) spośród 274 izolatów VTEC pochodzących od chorych ludzi oraz zwierząt. Wśród 39 pałeczek VTEC wykazujących oporność na dwie lub więcej klas antybiotyków, u 9 (23,1%) szczepów VTEC wykazano obecność integronu klasy 1, zdolnego do transferu między bakteriami na drodze koniugacji in vitro (121). Jak wynika z wyników najnowszych badań, u werotoksycznych pałeczek E. coli obok integronu klasy 1 występować może także integron klasy 2. Doświadczenia przeprowadzone przez Nagachinta i Chen (77) wykazały obecność integronu klasy 1 u 14 spośród 177 szczepów VTEC izolowanych zarówno od ludzi jak i od zwierząt oraz u jednego obecność integronu klasy 2. Ponadto wykazano, że u 13 spośród tych 14 szczepów integron klasy 1 był zlokalizowany na plazmidzie koniugacyjnym a więc był zdolny do przenoszenia się do innych bakterii drogą koniugacji in vitro (77). PODSUMOWANIE Wysoki potencjał chorobotwórczy werotoksycznych pałeczek E. coli sprawia, iż stanowią one ogromne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Olbrzymia plastyczność genomu

16 330 A. Januszkiewicz Nr 4 pałeczek okrężnicy powoduje, iż mogą one z dużą łatwością zmieniać swoje właściwości chorobotwórcze wskutek nabywania lub wymiany na drodze horyzontalnego transferu, materiału genetycznego z innymi drobnoustrojami ze środowiska. Przyczynia się to do powstawania szczepów o unikatowych właściwościach, które mogą wywoływać u ludzi zakażenia pokarmowe o poważnych konsekwencjach zdrowotnych włącznie ze śmiercią, czego przykładem jest zeszłoroczne ognisko HUS w Europie wywołane szczepem VTEC O104:H4. Wysoki potencjał chorobotwórczości połączony często z nabytą opornością na leki sprawia, iż werotoksyczne pałeczki E. coli stanowią narastający problem zarówno diagnostyczny jak i terapeutyczny. PIŚMIENNICTWO 1. Adamczuk D, Bieroza I, Roszkowska-Blaim M. Zespół hemolityczno-mocznicowy. Nowa Pediatria 2009; 2: Allison HE. Stx-phages: drivers and mediators of the evolution of STEC and STEC-like pathogens. Future Microbiol. 2007;2: Alpers K, Werber D, Frank C i inni. Sorbitol-fermenting enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H- causes another outbreak of haemolytic uraemic syndrome in children. Epidemiol Infect. 2009;137: Ammon A, Petersen LR, Karch H. A large outbreak of hemolytic uremic syndrome caused by an unusual sorbitol-fermenting strain of Escherichia coli O157:H-. J Infect Dis. 1999;179: Bauer ME, Welch RA. Characterization of an RTX toxin from enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Infect Immun. 1996;64: Bielaszewska M, Mellmann A, Zhang W i inni. Characterisation of the Escherichia coli strain associated with an outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, 2011: a microbiological study. Lancet Infect Dis. 2011;11: Blanco M, Blanco JE, Blanco J i inni. Prevalence and characteristics of Escherichia coli serotype O157:H7 and other verotoxin-producing E. coli in healthy cattle. Epidemiol Infect. 1996;117: Bolton DJ, Byrne CM, Sheridan JJ i inni.the survival characteristics of a non-toxigenic strain of Escherichia coli O157:H7. J Appl Microbiol. 1999; 86: Bonardi S, Brindani F, Pizzin G i inni. Yersinia enterocolitica and verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in pigs at slaughter in Italy. Int J Food Microbiol. 2003;85: Bonardi S, Maggi E, Bottarelli A i inni. Isolation of Verocytotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 from cattle at slaughter in Italy. Vet Microbiol. 1999;67: Brunder W, Schmidt H, Frosch M, Karch H. The large plasmids of Shiga-toxin-producing Escherichia coli (STEC) are highly variable genetic elements. Microbiology. 1999;145: Brunder W, Schmidt H, Karch H. EspP, a novel extracellular serine protease of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 cleaves human coagulation factor V.Mol Microbiol. 1997;24: Brüssow H, Canchaya C, Hardt WD. Phages and the evolution of bacterial pathogens: from genomic rearrangements to lysogenic conversion. Microbiol Mol Biol Rev. 2004; 68: Brzuszkiewicz E, Thürmer A, Schuldes J i inni. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero- Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Arch Microbiol. 2011;193: Burland V, Shao Y, Perna NT i inni. The complete DNA sequence and analysis of the large virulence plasmid of Escherichia coli O157:H7. Nucleic Acids Res. 1998; 26: Buvens G, Lauwers S, Piérard D. Prevalence of subtilase cytotoxin in verocytotoxin-producing Escherichia coli isolated from humans and raw meats in Belgium. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010;29: