Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse

Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Nr kat. K5001 Wydanie 6. Do uŝytku z automatami firmy Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych. Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 500 testów. (129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 1/9

(129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 2/9

Spis treści Strona Przeznaczenie... 4 Streszczenie i informacje ogólne... 4 Odczynniki... 5 A. Dostarczane materiały... 5 B. Materiały wymagane, ale niedostarczane... 5 Środki ostroŝności... 6 Przechowywanie... 7 Przygotowanie odczynników... 7 Pobieranie i przygotowanie próbek... 7 Procedura... 7 Kontrola jakości... 8 Interpretacja wyników... 9 Objaśnienie symboli... 9 (129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 3/9

Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. System Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse jest przeznaczony do stosowania w immunohistochemii, w automatach firmy Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych. Zestaw działa w oparciu o metodę LSAB (znakowanie streptawidynąbiotyną) rozpisaną na trzy etapy. Pierwszym etapem jest inkubacja tkanki z optymalnie rozcieńczonymi pierwotnymi przeciwciałami króliczymi lub mysimi, drugim etapem jest inkubacja z odczynnikiem Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), a trzecim etapem jest inkubacja z odczynnikiem Dako REAL Streptavidin Peroxidase (HRP). Reakcja obrazowana jest przy pomocy chromogenu Dako REAL DAB+, równieŝ załączonego w zestawie. W celu uzyskania prawidłowego odczynu zaleca się stosowanie zestawu łącznie z innymi zalecanymi odczynnikami, wymienionymi w punkcie Materiały wymagane, ale niedostarczane". Streszczenie i informacje ogólne Zestaw Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse opracowano z myślą o optymalnym przebiegu barwienia w automatach Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych, gdy uŝywane są szablony/protokoły wymienione w niniejszej ulotce. Przed przystąpieniem do wykonywania odczynu niektóre standardowo utrwalone i zatopione w parafinie skrawki tkankowe muszą zostać poddane procedurze cieplnego odmaskowania epitopu (HIER) przy uŝyciu roztworu do odmaskowania epitopu wskazanego w ulotce dołączonej do opakowania przeciwciał pierwotnych. W przypadku niektórych pierwotnych przeciwciał zamiast cieplnego odmaskowania epitopu naleŝy przeprowadzić trawienie enzymatyczne. NaleŜy pamiętać, Ŝe odczynnik Dako REAL Proteinase K, nr kat. S2019, został opracowany z myślą o procedurach z cieplnym odmaskowaniem epitopu w celu usprawnienia wsadowego przetwarzania preparatów. Do blokowania aktywności endogennej peroksydazy naleŝy uŝywać odczynnika Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution, nr kat. S2023, lub Dako Dual Endogenous Enzyme Block, nr kat. S2003. Z uwagi na zastosowanie wysoce skutecznej procedury płukania i obecność białek stabilizujących w składzie odczynników Dako nie jest konieczne wykonywanie dodatkowych procedur blokujących w celu osłabienia nieswoistego odczynu tła. Zaleca się stosowanie buforu płuczącego Dako właściwego dla konkretnego aparatu Dako. Zestaw nie zawiera przeciwciał pierwotnych. Zalecamy stosowanie przeciwciał z serii Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies lub stęŝonych przeciwciał pierwotnych Dako. System Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse działa w oparciu o metodę pośredniego wykorzystania streptawidyny-biotyny. Wykazano, Ŝe metoda ta zapewnia większą czułość niŝ inne analogiczne metody. Odczynnik będący biotynylowanym przeciwciałem wtórnym reaguje tak samo zarówno z immunoglobulinami króliczymi, jak i mysimi, a zatem z pierwotnymi przeciwciałami króliczymi i mysimi moŝna stosować ten sam odczynnik wtórny. Przeciwciała wtórne zostały optymalnie oznakowane biotyną przy uŝyciu 7-atomowego spacera. Pozwala to na wejście kaŝdego biotynylowanego przeciwciała w reakcję z kilkoma cząsteczkami streptawidyny skoniugowanymi z peroksydazą, a tym samym poprawia czułość systemu wykrywania. Wchodząca w skład zestawu streptawidyna skoniugowana z peroksydazą została sporządzona ze streptawidyny wyizolowanej z Streptomyces avidinii oraz wysoce oczyszczonej peroksydazy chrzanowej. Koniugacja przeprowadzana jest udoskonaloną dwustopniową metodą glutaraldehydową. PoniewaŜ punkt izoelektryczny streptawidyny jest bliski ph obojętnemu, moŝliwe jest uniknięcie nieswoistych interakcji jonowych ze składnikami badanego preparatu. Odczynnik zawierający biotynylowane przeciwciała wtórne oraz streptawidyna skoniugowana z peroksydazą dostarczane są w zestawie jako gotowe do uŝycia odczynniki w butelkach z zakraplaczem. Przed uŝyciem naleŝy je wlać do odpowiednich zbiorników aparatu. System substratu składa się z dwóch składników, DAB+ Chromogen, stęŝonego roztworu diaminobenzydyny (DAB), oraz HRP Substrate Buffer zawierającego nadtlenek wodoru. Przed uŝyciem DAB+ Chromogen naleŝy rozcieńczyć w buforze HRP Substrate Buffer. Produkt reakcji (129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 4/9

systemu substratu ma kolor intensywnie brązowy i zlokalizowany jest w miejscu występowania antygenu. Zalecanymi barwnikami kontrastowymi są odczynniki Dako REAL Hematoxylin, nr kat. S2020, lub Hematoxylin for the Dako Autostainer, nr kat. S3301, które zapewniają wyrazisty niebieski odczyn jądrowy. Wybarwione skrawki tkankowe moŝna zatopić w środku wodnym lub opartym na rozpuszczalniku organicznym. Odczynniki A. Dostarczane materiały Butelka A Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) 100 ml, gotowy do uŝycia Biotynylowane kozie immunoglobuliny przeciwko antygenom mysim i króliczym. W buforowanym roztworze zawierającym białko stabilizujące i azydek sodu. Odczynnik ten moŝe mieć róŝny kolor, od wyraźnie Ŝółtego do bezbarwnego, nie ma to jednak wpływu na działanie zestawu. Butelka B Butelka C Butelka D Dako REAL Streptavidin Peroxidase (HRP) 100 ml, gotowy do uŝycia Streptawidyna skoniugowana z peroksydazą chrzanową. W buforowanym roztworze zawierającym białko stabilizujące i środek konserwujący. Dako REAL DAB+ Chromogen 5 ml, koncentrat 50x Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny w rozpuszczalniku organicznym. Odczynnik ten moŝe mieć róŝny kolor, od wyraźnie fioletowego do bezbarwnego, nie ma to jednak wpływu na działanie zestawu. Dako REAL HRP Substrate Buffer 250 ml, gotowy do uŝycia Buforowany roztwór zawierający nadtlenek wodoru i środek konserwujący. B. Materiały wymagane, ale niedostarczane Automaty Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych Bufor płuczący Dako właściwy dla konkretnego aparatu Dako Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution, nr kat. S2023, lub Dual Endogenous Enzyme Block, nr kat. S2003 Dako REAL Proteinase K, nr kat. S2019, rozcieńczony w Dako REAL Proteinase K Diluent, nr kat. S2032, lub Proteinase K (Ready-to-Use), lub S3020 (w razie potrzeby) Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies lub inne stęŝone pierwotne przeciwciała królicze lub mysie dostarczone przez firmę Dako (129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 5/9

N-Series Ready-to-Use Rabbit or Mouse Universal Negative Control lub inny stosowny odczynnik kontroli ujemnej dla przeciwciał pierwotnych Dako REAL Antibody Diluent, nr kat. S2022 (do rozcieńczania stęŝonych przeciwciał) Dako REAL Hematoxylin, nr kat. S2020 lub Hematoxylin for the Dako Autostainer, nr kat. S3301 Roztwór do odmaskowania antygenu. Zob. ulotka dołączona do opakowania przeciwciał pierwotnych. Dako REAL Incubation Container, nr kat. S2030 (opcjonalnie) Dako REAL Slide Holder, nr kat. S2029 (opcjonalnie) Przybory do aparatu Dako Szkiełka mikroskopowe Odczynniki laboratoryjne ogólnego zastosowania do usuwania wosku z preparatów zatopionych w parafinie Środek do zatapiania (wodny lub oparty na rozpuszczalniku organicznym) i szkiełka nakrywkowe Środki ostroŝności 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. 2. Butelka A, Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), zawiera materiał pochodzący od ssaków. Podobnie jak w przypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury postępowania. 3. Butelka A, Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), zawiera silnie toksyczny związek czysty azydek sodu (NaN 3 ). StęŜenie NaN 3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŝywać duŝych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 4. Nie wystawiać butelki C, Dako REAL DAB+ Chromogen ani roztworu roboczego substratów (CHROM) na działanie intensywnego światła. 5. Butelka C, Dako REAL DAB+ Chromogen, zawiera 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'- tetrayltetraammonium tetrachloride i jest oznaczona: Niebezpieczeństwo H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. Jako zasadę naleŝy przyjąć zakaz pracy z produktem osobom w wieku poniŝej 18 lat. UŜytkowników naleŝy starannie poinstruować co do właściwych procedur pracy, niebezpiecznych własności produktu i środków ostroŝności. Dodatkowe informacje zawiera Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej. 6. NaleŜy stosować właściwe wyposaŝenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. 7. Niewykorzystany odczynnik naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. (129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 6/9

Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie stosować po upływie terminu waŝności podanego na opakowaniu. Nie łączyć elementów zestawów z róŝnych partii. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane w ulotce dołączonej do opakowania, UŜytkownik powinien je zweryfikować. Przygotowany bufor roboczy substratów (CHROM) powinien być przechowywany w ciemności, w temperaturze 2 8 C, i zuŝyty w ciągu 5 dni. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z produktem, naleŝy się skontaktować z naszym działem wsparcia technicznego. Przygotowanie odczynników Roztwór roboczy substratów (CHROM) Roztwór roboczy substratów (CHROM) zawierający DAB przygotowuje się, dokładnie mieszając 20 µl odczynnika DAB+ Chromogen (butelka C) z 1 ml buforu HRP Substrate Buffer (butelka D). Przygotować tylko objętość wymaganą dla liczby barwionych próbek. Roztwór CHROM naleŝy zuŝyć w ciągu 5 dni (przechowywać w ciemności, w temperaturze 2 8 C). Instrukcje przygotowywania odczynników niewchodzących w skład zestawu podano w dokumentacji dołączonej do tych odczynników. Pobieranie i przygotowanie próbek Zestaw moŝe być uŝywany do wykonywania odczynów na standardowo utrwalonych, zatopionych w parafinie skrawkach tkankowych i skrawkach mroŝakowych. Do konserwacji próbek moŝna uŝyć róŝnych utrwalaczy. Próbek nie naleŝy utrwalać w obojętnej zbuforowanej formalinie przez czas przekraczający 24 godziny, a w miarę moŝliwości czas utrwalania powinien być jak najkrótszy. Optymalna grubość skrawków zatopionych w parafinie wynosi około 4 µm. Optymalna grubość skrawków mroŝakowych wynosi 4 6 µm. Próbki naleŝy zatapiać na szkiełkach mikroskopowych. Próbki powinny być umieszczone na szkiełkach maksymalnie płasko i bez fałdowania. Zbyt duŝe pofałdowanie będzie miało wpływ na wynik odczynu. UWAGA: NaleŜy uŝywać szkiełek mikroskopowych o szerokości odpowiedniej dla aparatu Dako. Informacje na temat wymaganych parametrów szkiełek mikroskopowych moŝna znaleźć w instrukcji obsługi uŝywanego aparatu Dako. Skrawki parafinowe naleŝy zatapiać z podgrzanej łaźni wodnej z wodą destylowaną lub dejonizowaną. Łaźnia wodna nie powinna zawierać Ŝadnych dodatków (takich jak Ŝelatyna, poli-l-lizyna itp.). Skrawki powinny być suszone przez ogrzewanie, zasadniczo w temperaturze nieprzekraczającej 60 C przez co najmniej 60 minut (np. przez noc). Aby zapewnić właściwe przyleganie skrawków do szkiełek, waŝne jest osuszenie wody spod skrawków przed rozpoczęciem suszenia. Procedura W automatach Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych stosowane są róŝne techniki umoŝliwiające uzyskanie optymalnych wyników barwienia. Przed uŝyciem wybranego protokołu w automatach Dako naleŝy dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi odpowiedniego automatu Dako. Po odparafinowaniu i nawodnieniu buforem (wodą) większość skrawków tkankowych wymagać będzie cieplnego odmaskowania epitopu. Zaleca się przyjęcie i stosowanie standardowej procedury cieplnego odmaskowania epitopu, tak aby dawała ona powtarzalne wyniki. Zaleca się zapełnianie zawsze wszystkich pozycji podajnika na szkiełka, nawet jeśli tylko na jednym szkiełku znajduje się preparat; dzięki temu w kaŝdej serii odczynów skrawki będą tak samo ogrzewane, a tym samym obróbka wstępna będzie przebiegała zawsze w tych samych warunkach. Po zakończeniu etapu odmaskowania epitopu skrawki naleŝy pozostawić w buforze na co najmniej 20 minut w (129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 7/9

temperaturze pokojowej. W tym czasie, przeznaczonym na schłodzenie, automat Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych moŝna przygotować do serii odczynów. Niektóre, nieliczne epitopy nie są odporne na cieplne odmaskowanie. Odpowiednie instrukcje obróbki wstępnej moŝna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania uŝywanych przeciwciał pierwotnych Dako. Inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi Przeciwciała pierwotne Dako N-series, Ready-to-Use Primary Antibodies mogą być uŝywane z systemem Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse do skrawków utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie. W ulotkach dołączanych do opakowań poszczególnych stęŝonych przeciwciał pierwotnych Dako podane są wytyczne dotyczące rozcieńczania stęŝonych przeciwciał Dako i obróbki wstępnej proteinazą K, gdy przeciwciała te uŝywane są razem z systemem Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse do skrawków utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie. StęŜone przeciwciała pierwotne moŝna rozcieńczać w odczynniku Dako REAL Antibody Diluent, nr kat. S2022. Szkiełka umieszczane są w aparacie Dako i barwione przy uŝyciu szablonu/protokołu przeznaczonego specjalnie dla systemu Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, nr kat. K5001. Jeśli odpowiedni szablon/protokół nie jest zdefiniowany w uŝywanym aparacie Dako, naleŝy skontaktować się z naszym działem wsparcia technicznego. Przed pierwszym uŝyciem systemu detekcji Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse w aparacie Dako Autostainer naleŝy dodać odczynniki wymienione w tabeli 1 do listy odczynników aparatu. Tabela 1. Konieczne uzupełnienia listy odczynników i optymalne czasy inkubacji Odczynnik Nr kat. Sugerowana nazwa skrócona Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution lub Dual Endogenous Enzyme Block Dako REAL Proteinase K Solution lub Dako Proteinase K S2023 lub S2003 S2019 + S2032 S2030 HP Block Pro K Etap szablonu Blokada enzymów endogennych Obróbka wstępna przed zastosowaniem przeciwciała Czas inkubacji 5 minut 10 minut Przeciwciała pierwotne Indywidualne - Przeciwciało 10* 25 minut Dako REAL Detection System Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) Dako REAL Detection System, Streptavidin Peroxidase (HRP) K5001 K5001LIN Drugi odczynnik 15 minut K5001 K5001HRP Trzeci odczynnik 15 minut Dako REAL Detection System (DAB+) K5001 K5001DAB Substrat 3 minuty (2 razy) Dako REAL Hematoxylin S2020 Pomocniczy 1 2 minut lub - Dako Hematoxylin for the Dako Autostainer S3301 1 5 minut Blueing Buffer (= bufor automatu Autostainer) S3006 - Pomocniczy 5 minut * N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies W przypadku pozostałych aparatów Dako nazwy odczynników i czasy inkubacji są wstępnie zaprogramowane w szablonach/protokołach. Kontrola jakości W kaŝdej serii odczynów naleŝy uwzględnić jedną dodatnią próbkę kontrolną, co pozwoli potwierdzić prawidłowe działanie wszystkich zastosowanych odczynników. JeŜeli za pomocą kontroli (129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 8/9

dodatniej nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu, naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów badanych są niewaŝne. Do kaŝdej próbki naleŝy zastosować odczynnik kontroli ujemnej w celu wykrycia ewentualnego odczynu nieswoistego. Jeśli nie jest moŝliwe jednoznaczne odróŝnienie odczynu nieswoistego od swoistego, naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów badanych są niewaŝne. Zalecane odczynniki do kontroli ujemnej to Negative Control for N-Series Rabbit Primary Antibodies, nr kat. N1699, lub Negative Control for N-Series Mouse Primary Antibodies, nr kat. N1698. Interpretacja wyników Roztwór roboczy substratów (CHROM) zawierający diaminobenzydynę powoduje brązowe zabarwienie w miejscach występowania antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała pierwotne. Brązowe zabarwienie powinno być widoczne w dodatniej próbce kontrolnej w oczekiwanych miejscach występowania antygenu. Jeśli dojdzie do powstania odczynu nieswoistego, moŝna będzie go rozpoznać jako rozmyte, brązowe odczyny na szkiełkach poddanych działaniu odczynnika kontroli ujemnej. Jądra komórkowe w barwieniu kontrastowym hematoksyliną barwią się na niebiesko. Objaśnienie symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania ZuŜyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Zawartość wystarcza na <n> testów Producent Sprawdzić w instrukcji stosowania Numer serii Harmful (środek szkodliwy) Producent: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dania Tel. +45 44 85 95 00 Faks +45 44 85 95 95 (129662-001) P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 9/9