Małgorzata Mironiuk *, Katarzyna Chojnacka, Helena Górecka Politechnika Wrocławska Use of certified reference materials in the validation of methods in multielemental analysis Zastosowanie certyfikowanych materiałów odniesienia w walidacji metod analizy wielopierwiastkowej DOI: dx.medra.org/10.12916/przemchem.2014.578 Certified ref. materials were successfully used at various stages of validation of multielemental anal. procedures at detn. of Pb content in sediments samples. Inductively coupled plasma optical emission spectrometry was used as anal. method. Omówiono wykorzystanie certyfikowanych materiałów odniesienia na kolejnych etapach walidacji metod analizy wielopierwiastkowej, na przykładzie oznaczania zawartości Pb w próbkach osadów metodą optycznej spektrometrii emisyjnej ICP. Wykazano zasadność stosowania certyfikowanych materiałów odniesienia na każdym z etapów walidacji. Akredytowane laboratorium chemiczne powinno mieć opracowane metody, które są wiarygodne i odpowiednie do przewidzianego zastosowania oraz spełniają oczekiwania klienta. Mogą to być metody znormalizowane lub też opracowane przez laboratorium 1). Laboratorium jest zobowiązane do zapewnienia wiarygodności wyników badań. Jednym z podstawowych elementów zapewnienia jakości wyników jest walidacja metody analitycznej 2). Walidacja procedury analitycznej jest jednym z głównych elementów systemu kontroli i zapewnienia jakości wyników pomiarów w każdym laboratorium 3). Polega na potwierdzeniu, że wybrane metody spełniają wymagania dotyczące ich zastosowania oraz są w stanie wykryć badaną cechę z odpowiednią precyzją i dokładnością. Obejmuje wyznaczenie parametrów analitycznych, w których spójność pomiarowa oraz niepewność wyniku pomiaru determinują wiarygodność wyników 4). Kluczowe do oceny metody analitycznej są takie parametry, jak selektywność/specyficzność, granica wykrywalności LOD (limit of detection), granica oznaczalności LOQ (limit of quantification), odzysk, zakres roboczy i liniowość, poprawność, precyzja oraz odporność. Kryteria, które uwzględnia się w procesie walidacji zależą od specyfiki danej metody i celu jej stosowania 5). Obecne podejście do walidacji zakłada rozróżnienie metod wymagających pełnej walidacji (metody nowe opracowane przez laboratorium) oraz metod, dla których wystarczające jest przeprowadzenie walidacji częściowej i sprawdzenia (metody znormalizowane). Każda modyfikacja istniejącej metody znormalizowanej lub zwalidowanej wcześniej metody własnej powoduje konieczność rewalidacji. Zakres walidacji powinien być ustalany indywidualnie dla każdej z wdrażanych metod. Przykładowe zakresy walidacyjne sugerowane przez holenderską jednostkę akredytującą Dutch Board przedstawiono w tabeli 1. Walidację czy weryfikację metody pomiarowej można prowadzić, stosując certyfikowane materiały odniesienia. W takim przypadku materiał odniesienia jest traktowany jako próbka, dla której prowadzi się pomiary w danych warunkach laboratoryjnych 6). Matrycowy certyfikowany materiał odniesienia, który zostanie wykorzystany w procesie walidacji powinien składem chemicznym i formą możliwie jak najbardziej przypominać skład próbki rzeczywistej. Zwalidowanie Prof. dr hab. inż. Katarzyna CHOJNACKA notkę biograficzną i fotografię Autorki drukujemy w bieżącym numerze na str. 590. Mgr inż. Małgorzata MIRONIUK w roku 2009 ukończyła studia na Wydziale Chemicznym Politechniki Wrocławskiej. Jest zatrudniona w Instytucie Technologii Nieorganicznej i Nawozów Mineralnych Politechniki Wrocławskiej. Specjalność chemia techniczna i systemy jakości w technologii chemicznej. * Autor do korespondencji: Instytut Technologii Nieorganicznej i Nawozów Mineralnych, Politechnika Wrocławska, ul. Smoluchowskiego 25, 50-372 Wrocław, tel.: (71) 320-24-86, fax: (71) 320-34-69, malgorzata.mironiuk@pwr.wroc.pl Dr Helena GÓRECKA w roku 1969 ukończyła studia na Wydziale Farmaceutycznym Akademii Medycznej we Wrocławiu. Jest adiunktem w Instytucie Technologii Nieorganicznej i Nawozów Mineralnych Politechniki Wrocławskiej i zastępcą kierownika Laboratorium Chemicznego Analizy Wielopierwiastkowej w Zakładzie Chemii dla Rolnictwa tego instytutu. Specjalność chemia analityczna. 578 93/4(2014)
Table 1. The scope of validation required by the Dutch Board 5) Tabela 1. Zakres walidacji wymagany przez holenderską jednostkę akredytującą Dutch Board 5) Badany parametr metody analitycznej przeznaczonej do konkretnego zastosowania jest niezbędne do wykonywania danego oznaczenia. Jako przykład zastosowania certyfikowanych materiałów odniesienia w walidacji metod analizy wielopierwiastkowej w pracy przedstawiono przykład oznaczania ołowiu w próbkach osadów. Zawartość Pb w osadach może się wahać w granicach od kilkunastu do nawet tysiąca mg/kg. Sprawdzono walidację procedury oznaczania metali ciężkich w osadach metodą optycznej spektrometrii emisyjnej ICP z użyciem matrycowych i bezmatrycowych certyfikowanych materiałów odniesienia na przykładzie oznaczania zawartości ołowiu za pomocą spektrometrów plazmowych serii 6500 firmy Thermo Scientific (USA). Część doświadczalna Materiały Jako odczynniki stosowano kwas azotowy 69%, Tracepur, Merck, i kwas chlorowodorowy 36%, Tracepur, Merck. Stosowano też czyste roztwory wzorcowe: Arsenic ICP Standard, ULTRAgradeTM Solution, Ultra Scientific (1±2 ), Manganese ICP Standard, ULTRAgradeTM Solution, Ultra Scientific (2±2 ) oraz Lead ICP Standard, ULTRAgradeTM Solution, Ultra Scientific (1±2 ). Jako matrycowe certyfikowane materiały odniesienia stosowano: Industrial Sludge (National Institute of Standards & Technology, USA), Stream Sediment NCS DC 73371(GSD-1a) (China National Analysis Center for Iron and Steel, China), Sewage Sludge CRM031-040, (RT-Corp, USA) oraz Sewage Sludge 2 CRM029-050 (RT-Corp, USA). Certyfikowane materiały odniesienia w postaci czystych roztworów wzorcowych oraz matrycowych materiałów odniesienia wykorzystywano na każdym z etapów walidacji. Metodyka badań Metoda nowa Metoda znormalizowana Metoda modyfikowana Poprawność Powtarzalność Precyzja Granica wykrywalności (LOD) Granica oznaczalności (LOQ) Liniowość Specyficzność Odporność zawsze jeśli istotne nie konieczne Do walidacji metody oznaczania Pb w próbkach osadów wybrano 8 linii spektralnych o zróżnicowanej czułości i wpływie efektów matrycowych (tabela 2). W tabeli 3 zestawiono oznaczenia materiałów CRM wraz z certyfikowaną zawartością ołowiu, a także zawartość składników matrycowych i pierwiastków (interferentów), których linie mogą całkowicie lub częściowo nakładać się na linie spektralne ołowiu, wywołując w ten sposób interferencje spektralne. Certyfikowane materiały odniesienia przygotowano zgodnie z zaleceniami zawartymi w certyfikatach. Do analizy ICP materiały odniesienia zostały przygotowane zgodnie z procedurą rozkładu próbek rzeczywistych, opracowaną w laboratorium próbki roztwarzano w mieszaninie kwasów azotowego i solnego w piecu mikrofalowym ETHOS ONE, firmy Milestone (Włochy) 7). Tak przygotowane próbki po rozcieńczeniu analizowano metodą ICP-OES, stosując spektrometr plazmowy optyczny 6500 (z plazmą pionową), Thermo Scientific (USA), oraz Spektrometr plazmowy optyczny 6500 Duo (z plazmą pionową i poziomą), Thermo Scientific (USA). Zawartość ołowiu w materiałach CRM oznaczono na podstawie krzywej kalibracji wykonanej na matrycy kwasowej, bez odtwarzania składu matrycowego próbek. W celu dokonania wyboru nebulizatora do walidacji sprawdzono czułość nebulizatorów przeznaczonych dla spektrometrów serii 6500. Do spektrometru przypisano nebulizatory typu conical, a do v-groove. Sprawdzenie polegało na pomiarze intensywności (zliczeń) pochodzącej od wzorca As o stężeniu 1 w czasie (Ct/s). Wybór As wynikał z faktu, że spośród pierwiastków o działaniu toksycznym ujętych w walidowanej procedurze jest on pierwiastkiem najbardziej problematycznym w oznaczaniu. Sygnał dla każdego z nebulizatorów mierzono 3-krotnie. Spośród sprawdzonych nebulizatorów typu v-groove wyeliminowano v-groove 5 z powodu znacząco niższej czułości. Do walidacji wybrano nebulizatory, dla których otrzymana wartość sygnału była najmniejsza (słupki koloru czerwonego na rys. 1 i 2). Dzięki temu wyeliminowano efekt spadku czułości metody związany z gorszymi parametrami nebulizatora w przypadku jego wymiany w okresie użytkowania danego spektrometru. Dla wybranych do walidacji nebulizatorów optymalizowano przepływ gazu w zakresie 0 1 L/min. Optymalizację wykonano na wzorcu Pb o stężeniu 0,1 ( ) oraz 1 ( ). Wyznaczony optymalny przepływ gazu nebulizacji wyniósł w przypadku spektrometru 0,40 L/min, a dla spektrometru Table 2. Characteristics of the spectral lines selected for validation Tabela 2. Charakterystyka linii spektralnych wybranych do walidacji Względna intensywność Możliwe interferencje 168,215 20000 Al 182,205 5000 Si 216,999 90000 Mo 220,353 120000 brak 261,418 70000 Fe 280,199 35000 Zn 283,306 45000 Fe 405,783 18000 Mn, V Table 3. Content of Pb, matrix components and interferents in the CRM materials Tabela 3. Zawartość Pb, składników matrycowych oraz interferentów w zastosowanych do badań materiałach CRM Zawartość certyfikowana ± niepewność mg/kg Składniki matrycowe, % Pierwiastkiinterferenty, mg/kg Pierwiastek SRM 2782 NCS DC 73371 CRM 031-040 CRM 0 29-050 Pb 574±11 31±4 283,95±20,83 300±12 Ca 0,67 2,86 4,48 4,84 K 0,32 2,31 0,45 0,34 Mg 0,26 1,98 0,76 0,83 Na 1,30 2,52 0,17 0,16 P 0,50 0,15 2,01 2,21 S 0,20 0,014 1,36 Al 13700 81270 18960 12400 Fe 269000 16780 23570 20700 Mn 300 910 408 399 Mo 10 1,0 69 19 Si 20000 276000 370 828 V 80 115 286 42 Zn 1254 90 1304 14000 93/4(2014) 579
0,65 L/min. Parametry te ustawiono jako domyślne dla całego procesu kontrolnej walidacji. Przy wdrażaniu metody analitycznej dla spektrometrów optycznych z plazmą pionową niezbędna jest optymalizacja strefy widzenia, gdyż ma ona wpływ na czułość metody i jej odporność na interferencje. Optymalizację strefy widzenia wykonano wyłącznie dla spektrometru na wzorcu Mn o stężeniu 1. Strefę widzenia optymalizowano w zakresie 8 20 mm na 8 liniach analitycznych Mn. Najlepszą czułość uzyskano dla 9 mm. Wartość ta była jednakowa dla wszystkich linii Mn i tę wartość ustalono jako parametr metody (viewing height) dla wszystkich etapów walidacji. Wyznaczono granicę wykrywalności (LOD), stanowiącą najmniejsze stężenie analitu, jakie może zostać wykryte ze statystycznie istotną pewnością. Wartość tę definiowano przez krotność poziomu szumów 3). Za granicę oznaczalności (LOQ) przyjęto najmniejsze stężenie analitu, które można oznaczyć daną metodą pomiarową z odpowiednią dokładnością i precyzją 6). Najczęściej jest ona określana jako 3-krotność granicy wykrywalności 3). Na podstawie analizy ślepych prób (10 prób po 10 pomiarów dla każdej próby) wyznaczono odchylenie standardowe dla każdej z 10 ślepych prób (Sd) oraz maksymalne odchylenie standardowe (Sd maks. ). Granicę wykrywalności LOD zdefiniowano jako 3 Sd maks., a granicę oznaczalności jako 10 Sd maks.. Zakres liniowości (przedział zakresu pomiarowego procedury analitycznej, w którym sygnał wyjściowy zależy liniowo od stężenia analitu 3) ) wyznaczono poprzez wykreślenie zależności sygnału pomiarowego w funkcji stężenia Pb. Do sporządzenia krzywej kalibracji wykorzystano czysty roztwór wzorcowy z certyfikowaną zawartością Pb. Liniowość sprawdzano w zakresie 0,0005 12,5 ( ) oraz 0,001 250 ( ), przygotowując 10 serii pomiarowych wzorców dla każdego ze spektrometrów. Wykonano 10 powtórzeń dla każdego wzorca. Jako kryterium akceptacji przyjęto współczynnik korelacji krzywej R > 0,999. Poprawność, czyli zgodność otrzymanego wyniku z wartością odniesienia, wyrażono jako błąd względny metody pomiarowej, zgodnie z zależnością (1): Fig. 1. Test of the conical type nebulizers ( ) Rys. 1. Sprawdzenie nebulizatorów typu conical ( ) Fig. 2. Test of the v-groove type nebulizers ( ) Rys. 2. Sprawdzenie nebulizatorów typu v-groove ( ) Poprawność,% = ś % w której x śr oznacza wartość średnią otrzymaną z całej serii pomiarowej, a x odn wartość odniesienia, deklarowaną certyfikatem. Najlepsza poprawność jest równa zeru. Poprawność wyznaczono, korzystając z wyników analiz odpowiednich materiałów odniesienia z certyfikowaną zawartością Pb. Wykonano analizę materiałów CRM w 10 powtórzeniach. Otrzymaną wartość średnią dla serii pomiarowej porównano z wartością deklarowaną certyfikatem. W pierwszym etapie wykonano pomiary roztworów wzorcowych Pb o różnych stężeniach (okolice granicy wykrywalności oraz górnego zakresu liniowości). Następnie badano poprawność na podstawie analiz matrycowych materiałów CRM. Do wyznaczenia precyzji metody, która określa rozrzut, czyli rozproszenie wyników wokół wartości średniej przy użyciu danej metody badawczej, wykorzystano certyfikowane materiały odniesienia. Dla każdego z materiałów CRM wykonano 10 niezależnych pomiarów zawartości Pb w warunkach powtarzalności i odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej (dwóch różnych analityków). Wyniki uzyskane dla warunków odtwarzalności wyrażono jako odchylenie standardowe względne, zgodnie z równaniem (2): Odtwarzalność,% = w którym Sd odt oznacza odchylenie standardowe odtwarzalności, a X śr wartość odniesienia, deklarowaną certyfikatem. Precyzję wyznaczono z wyników analiz bezmatrycowych i matrycowych materiałów CRM. Wyznaczone parametry walidacyjne wykorzystano do ostatecznej selekcji linii analitycznych. Wybrano 5 linii spektralnych, które dopuszczono do stosowania w ustalonym zakresie. Cztery z nich: 216,999{455}, 216,999{456}, 220,353{153} oraz 220,353{453} zdefiniowano dla obu spektrometrów. Linie o długości fali 220,353 odznaczały się najwyższą spośród badanych linii czułością i były wolne od interferencji. Linię 405,783{83} stosowano wyłącznie dla spektrometru do oznaczania wysokich stężeń Pb, ze względu na stosunkowo małą czułość. Podczas analiz wykonywanych z użyciem linii 216,999 oraz 405,783 zwracano uwagę na zawartość Mo, Mn i V w badanej próbce, gdyż linie analityczne tych pierwiastków mogą powodować interferencje. Wyznaczoną granicę oznaczalności oraz liniowość wykorzystano do ustalenia zakresów pomiarowych dla wybranych linii analitycznych, osobno dla każdego ze spektrometrów. Zakres pomiarowy został określony jako przedział od wartości granicy oznaczalności LOQ (przy zaokrągleniu w górę do jednej cyfry znaczącej) do najwyższego stężenia analitu, dla którego system pomiarowy wykazywał wzrost sygnału. Analizę zawartości ołowiu w matrycowych CRM wykonano na wyselekcjonowanych liniach analitycznych. Krzywą kalibracji sporządzono na matrycy kwasowej. Odzysk Pb wyznaczono z równania (3): w którym C lab oznacza wartość wyznaczoną w laboratorium, a C CRM wartość deklarowaną certyfikatem. W celu rozpatrzenia praktycznych aspektów wykorzystania danych walidacyjnych przygotowano 3 równoległe próbki analityczne osadu ściekowego, które roztworzono w mieszaninie kwasu solnego i azotowego 7). Na podstawie analizy półilościowej (przegląd widma) ustalono skład matrycy badanej próbki osadu, a także poziom stężenia ołowiu oraz zawartość interferentów (tabela 4). Zawartość Pb w próbce osadu była na poziomie 135 mg/kg, co daje ok. 1 mg/kg w roztworze badanej próbki (-krotne rozcieńczenie zastosowane na etapie roztwarzania próbki). Zawartość Pb na tym poziomie była oznaczalna w obu spektrometrach. Uwzględniając skład matrycy w krzywej kalibracyjnej, wykonano analizę ilościową zawartości ołowiu z użyciem obu spektrometrów (, ). Do określenia zawartości ołowiu użyto linii analitycznych wyselekcjonowanych w procesie walidacyjnym. ś % Odzysk,% = % (1) (2) (3) 580 93/4(2014)
Table 4. Content of lead, matrix components and interferents in the tested sediment sample Tabela 4. Zawartość ołowiu, składników matrycowych i interferentów w badanej próbce osadu Ołów Składnik matrycowy Interferent mg/kg pierwiastek zawartość, % pierwiastek zawartość, mg/kg Ca 6,17 Al 19540 K 0,25 Fe 60550 Mg 0,54 Mn 269 135 Na 0,069 Mo 18 P 2,52 Si 205 S 0,62 V 22 Zn 903 Wyniki badań i dyskusja W tabelach 5 14 przy długościach linii analitycznych zamieszczono wartości w nawiasach klamrowych. Są to tzw. rzędy widma, które wynikają ze zjawiska dyfrakcji. W przypadku optyki Echelle, która została zastosowana w spektrometrach serii 6000 wprowadzony jest dodatkowy pryzmat, który umożliwia uzyskanie widma dwuwymiarowego 7). Dla większości linii (o tej samej długości fali) prawie zawsze występują linie w dwóch rzędach, a w obszarze zakładki (zakres długofalowy i krótkofalowy) mogą wystąpić trzy linie tego samego pierwiastka o tej samej długości, ale o różnych rzędach. Rzędy widma zaczynają się od kilkunastu, a kończą na kilkuset. Podanie rzędu widma wraz z długością fali jest niezbędne do pełnej identyfikacji linii analitycznej. Otrzymane wartości Sd maks., LOD i LOQ dla oraz zestawiono w tabeli 5. Wyraźnie widoczne są różnice w czułościach poszczególnych linii analitycznych oraz pomiędzy aparatami w obrębie tej samej linii, w zależności od rzędu widma. Zdecydowanie niższe granice oznaczalności uzyskiwano dla spektrometru z plazmą poziomą. Dużą wartość granicy oznaczalności uzyskano dla dla linii spektralnej 168,215{500}. Linię tę wyłączono z dalszych etapów walidacji kontrolnej. W tabeli 6 przedstawiono wyznaczony zakres liniowości. Poprawność (błąd względny) przedstawiono w tabelach 7 i 8, osobno dla każdego ze spektrometrów. Table 5. Maximum standard deviation (Sd max ), limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ), Tabela 5. Maksymalne odchylenie standardowe (Sd maks. ), granica wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ), Sd maks. LOD LOQ Sd maks. LOD LOQ 168,215 {500} 0,00167 0,0050 0,0167 0,22435 0,6731 2,2435 168,215 {501} 0,00138 0,0041 0,0138 0,14879 0,4464 1,4879 182,205 {485} 0,00066 0,0020 0,0066 0,00918 0,0275 0,0918 182,205 {486} 0,00092 0,0028 0,0092 0,01556 0,0467 0,1556 216,999{155} 0,00479 0,0144 0,0479 0,06901 0,2070 0,6901 216,999{156} 0,00500 0,0150 0,0500 0,08198 0,2459 0,8198 216,999 {455} 0,00189 0,0057 0,0189 0,02771 0,0831 0,2771 216,999 {456} 0,00314 0,0094 0,0314 0,02339 0,0702 0,2339 220,353 {153} 0,00088 0,0026 0,0088 0,00814 0,0244 0,0814 220,353 {453} 0,00035 0,0011 0,0035 0,00289 0,0087 0,0289 261,418 {129} 0,00392 0,0118 0,0392 0,05407 0,1622 0,5407 280,199 {120} 0,00726 0,0218 0,0726 0,06211 0,1863 0,6211 283,306 {119} 0,00390 0,0117 0,0390 0,05886 0,1766 0,5886 405,783 {83} 0,00254 0,0076 0,0254 0,04814 0,1444 0,4814 Table 6. Linearity range Tabela 6. Wyznaczony zakres liniowości otrzymany zakres korelacja, liniowości, R otrzymany korelacja, zakres liniowości, R 168,215 {500} 0,0005 12,5 0,9994 - - 168,215 {501} 0,0005 12,5 0,9999 0,01 250 0,9995 182,205 {485} 0,0005 12,5 0,9999 0,001 250 0,9998 182,205 {486} 0,0005 12,5 0,9998 0,001 250 0,9998 216,999{155} 0,001 12,5 0,9997 0,005 250 0,9999 216,999{156} 0,0005 12,5 0,9996 0,01 250 0,9999 216,999 {455} 0,0005 12,5 0,9991 0,001 250 0,9999 216,999 {456} 0,0005 12,5 0,9993 0,01 250 0,9998 220,353 {153} 0,0005 12,5 0,9992 0,001 250 0,9996 220,353 {453} 0,0005 12,5 0,9998 0,001 250 0,9998 261,418 {129} 0,005 12,5 0,9992 0,01 250 0,9996 280,199 {120} 0,1 12,5 0,9998 0,01 250 0,9998 283,306 {119} 0,0005 10 0,9995 0,01 250 0,9995 405,783 {83} 0,005 12,5 0,9996 0,01 250 0,9996 Table 7. Accuracy based on the non-matrix CRM materials for, % Tabela 7. Poprawność w oparciu o bezmatrycowe materiały CRM dla, % 0,001 0,005 0,01 0,025 1 10 168,215 {500} -0,900 7,06 6,72 1,86-7,09 2,11 168,215 {501} 25,1-105 15,0-13,3 7,41-3,97 182,205 {485} -223-114 0,950-14,8-1,69-0,0705 182,205 {486} -119-102 17,9 6,46-2,10-0,111 216,999{155} -244-170 24,9-30,3-1,67 0,855 216,999{156} -1057-326 -196-85,1 1,63 3,25 216,999 {455} 488 2,48 7,18-20,3-1,22 0,0957 216,999 {456} -246-10,7-6,03-3,08-1,98 0,0473 220,353 {153} 5,50-4,54 8,64 3,25-0,497 0,774 220,353 {453} 2,70-7,72-4,01-5,85-0,327 1,77 261,418 {129} -141-4,24 31,4 18,5-2,25 0,0339 280,199 {120} -230-101 -25,4-17,7-0,0971 2,10 283,306 {119} -60,9-146 102 6,58-4,72-1,76 405,783 {83} -149,4-132 17,1 11,5-2,64 2,33 Table 8. Accuracy based on the non-matrix CRM materials for, % Tabela 8. Poprawność w oparciu o o bezmatrycowe materiały CRM dla, % 0,01 0,05 0,1 0,5 125 µg/ ml 250 µg/ ml 168,215 {500} 1439-0,32 4,30 0,63 0,499 0,912 0,356 168,215 {501} 32,4-3,10 6,80 7,64 1,51 0,912 0,356 182,205 {485} 11,3-0,42-8,69-2,82 1,37 1,74 1,24 182,205 {486} -5,80-99,5 0,370-2,60 0,456 1,12 0,248 216,999{155} 957-384 -4,45-1,66 1,98 2,28 1,43 216,999{156} 353-1,34-2,72-9,01 1,23 1,76 1,28 216,999 {455} 201 6,42-4,57-1,67 1,06 1,56 1,25 216,999 {456} -0,500-5,36-22,8-6,83 0,213 0,888-0,172 220,353 {153} 2,90 2,10-8,71-5,34 0,960 1,33 0,964 220,353 {453} 278-116 6,11-11,7 1,83 1,75 0,168 261,418 {129} -507-158 1,72-2,08 1,53 2,06 1,18 280,199 {120} -670-161 9,34-9,71 0,625 1,43 0,552 283,306 {119} -6,20-0,460 5,4 1,94 2,05 2,03 1,24 93/4(2014) 581
Wyniki badania poprawności na podstawie analiz Pb w matrycowych materiałach CRM zestawiono w tabeli 9. Odrzucono wartości parametrów poprawności, które były zbyt wysokie. Jako kryterium dla tego etapu badań przyjęto poprawność poniżej (±)20%. Na podstawie wyznaczonych parametrów poprawności wyeliminowano całkowicie z dalszych badań dla obu spektrometrów linię analityczną 216,999{156} oraz linie 261,418{129}, 280,199{120}, 283,306{119}. Bardzo duża wartość poprawności wyznaczona dla tych linii analitycznych związana była najprawdopodobniej z dużą zawartością Al i Fe w próbkach, które interferując z ołowiem, wpływały na wynik oznaczenia. Dodatkowo dla wyłączono linię 216,999{155}. Wyniki otrzymane dla warunków odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej zestawiono w tabelach 10 12. Zakresy pomiarowe ustalone dla Pb przedstawiono w tabeli 13. Otrzymane wartości odzysku były zróżnicowane nie tylko na poszczególnych liniach, ale także różniły się dla każdego ze spektrometrów (rys. 3 i 4). Wszystkie otrzymane wartości można było uznać za zadowalające. Dla najgorszy odzysk otrzymano dla materiału NCS SC 73371, w którym zawartość ołowiu była dość niska. W pozostałych materiałach odzysk kształtował się na poziomie 98 102%. Table 9. Accuracy based on the Pb content analysis in CRM materials, % Tabela 9. Poprawność na podstawie analiz Pb w matrycowych materiałach CRM, % NCS DC 73371 CRM029-050 168,215 {500} -21,0-6,14 - -0,44-12,7-168,215 {501} -21,0 1,14-0,29 13,1-0,539 1,11-16,3-3,09 182,205 {485} bd* - 157 - -3,48 - -19,4-182,205 {486} 259-0,00348 135 58,0-10,6-0,225-18,0-1,28 216,999{155} -6,06-0,0993 88,5 15,6-11,3 0,229-7,07 0,657 216,999{156} -6,89 0,326-180 -1,05-1,06-0,095-5,52-0,817 216,999 {455} -1,45-0,190-19,8-2,67-19,4 0,451-27,5 0,327 216,999 {456} -2,28-0,00523-13,8-3,47 0,269 1,22-8,97 0,523 220,353 {153} -27,8-0,057-17,0 8,32-4,42 0,454-14,7-0,490 220,353 {453} -2,63 0,620-0,826-5,29-0,548 0,261-0,377 0,267 261,418 {129} 314-0,0854 720-2814 49,4 40,8-2,94 1,68 280,199 {120} -4,90-0,138 bd* 6152 328 562 207 594 283,306 {119} 93,5 0,0889 644 372-5,77 49,0-19,9 23,6 405,783 {83} -5,30 0,218 99,0-4,16-3,70 0,00704-13,4-0,890 * bd brak danych Table 10. Reproducibility based on the analysis of Pb in non-matrix CRM materials for, % Tabela 10. Odtwarzalność na podstawie analizy Pb w bezmatrycowych materiałach CRM dla, % 0,001 0,005 0,01 µg/ ml 0,025 1 10 168,215 {500} 445 74,1 31,5 16,2 0,316 0,123 168,215 {501} 384 72,0 44,6 15,4 0,481 0,139 182,205 {485} -105-2505 10,8 11,9 0,138 0,158 182,205 {486} -1148-95,8 23,8 9,7 0,366 0,175 216,999 {455} 38,1-59,1 17,7 10,2 0,195 0,167 216,999 {456} -127 48,2 38,2 25,8 0,390 0,287 220,353 {153} 147-1418 11,6 10,3 0,505 0,331 220,353 {453} 51,7 34,2 8,70 8,80 0,221 0,220 405,783 {83} -886-226 23,9 17,2 0,437 0,280 Uzyskanie odzysku prawie -proc. pozwalało przypuszczać, że walidowana metoda badawcza zapewniała dobrą dokładność wyników. Na rys. 5 przedstawiono wyniki analizy próbki osadu ściekowego uzyskane na poszczególnych liniach analitycznych, dla każdego ze spektrometrów. Widoczne są wyraźne różnice w zawartości ołowiu na poszczególnych liniach analitycznych. W przypadku obu spektrometrów tendencja była taka sama: większą zawartość oznaczano na liniach 216,999, a mniejszą na 220,353. Określenie, która z oznaczonych zawartości Pb była prawidłowa możliwe było Table 11. Reproducibility based on the analysis of Pb in non-matrix CRM materials for, % Tabela 11. Odtwarzalność na podstawie analizy Pb w bezmatrycowych materiałach CRM dla, % 0,01 0,05 0,1 0,5 µg/ 125 µg/ ml ml 250 168,215 {501} 107 493 123 71,9 0,878 1,04 1,04 182,205 {485} 117 318 16,6 2,80 0,465 0,461 0,219 182,205 {486} 589 283 48,0 7,00 0,403 0,440 0,314 216,999{155} 931 78743 136 31,7 0,669 0,785 0,485 216,999 {455} 77,6 371 43,5 7,83 0,339 0,396 0,250 216,999 {456} 157 281 77,4 7,69 0,374 0,476 0,258 220,353 {153} 2182 126 16,0 3,65 0,663 0,883 0,376 220,353 {453} 96,3 276 8,04 1,89 0,362 0,415 0,228 405,783 {83} 695 86,6 76,2 10,5 0,652 0,942 0,454 Table 12. Reproducibility based on the analysis of Pb in matrix CRM materials, % Tabela 12. Odtwarzalność na podstawie analizy Pb w matrycowych materiałach CRM, % NCS DC 73371 CRM029-050 Table 13. Measurement ranges for Pb (content of the sample solution) Tabela 13. Zakresy pomiarowe dla Pb (zawartość w roztworze badanej próbki) Zakres pomiarowy, od do od do 216,999{455} 0,02 12,5 0,3 250 216,999{456} 0,04 12,5 0,3 250 220,353{153} 0,009 12,5 0,09 250 220,353{453} 0,004 12,5 0,03 250 405,738{83} - - 0,5 250 168,215 {500} 0,669-7,28-0,898-0,526-168,215 {501} 0,681 0,798 1,67 78,0 0,541 2,92 0,565 2,40 182,205 {485} bd* - 174-0,572-0,195-182,205 {486} 0,323 0,532 158 34,4 1,201 2,33 0,357 3,01 216,999{155} - 1,36-41,8-3,17-3,23 216,999 {455} 0,352 0,581 4,79 49,8 0,763 1,50 0,268 1,00 216,999 {456} 0,482 0,621 8,63 69,4 0,745 1,52 0,445 0,998 220,353 {153} 0,294 0,940 2,33 21,5 0,469 1,11 0,339 1,26 220,353 {453} 0,328 0,675 1,07 53,0 0,410 0,886 0,116 0,822 405,783 {83} -1,56 1,07 3,22 3,00 0,258 1,21 0,317 1,26 * bd brak danych 582 93/4(2014)
dzięki wykorzystaniu wyników analiz certyfikowanych materiałów odniesienia, charakteryzujących się możliwie najbardziej zbliżoną do badanej próbki zawartością analitu oraz składników matrycowych. W celach porównawczych do kontroli jakości badań użyto tych samych matrycowych materiałów CRM, które były wykorzystywane w procesie walidacji. Otrzymane wyniki, w postaci odzysku zawartości Pb Odzysk, % 120 115 110 105 95 90 85 80 216,999 {455} 220,353 {153} 216,999 {456} 220,353 {453} NCS DC 73371 CRM029-050 Fig. 3. Recovery of Pbin matrix CRM materialsfor Rys. 3. Odzysk Pb dla matrycowych materiałów CRM dla Table 14. Recovery of Pb for certified reference materials, % Tabela 14. Odzysk Pb dla certyfikowanych materiałów odniesienia, % NCS DC 73371 CRM029-050 216,999 {455} 109,58 118,12 177,42 138,72 132,07 105,30 111,33 106,33 216,999 {456} 144,08 135,89 174,19 119,35 135,24 107,41 166,67 103,33 220,353 {153} 92,68 102,44 45,16,00 96,85 99,31,00 98,33 220,353 {453} 95,30,87 45,16 93,95 96,50,02 101,00 96,00 405,783 {83} - 98,26 - <LOQ* - 88,75-97,33 *<LOQ zawartość ołowiu poniżej granicy oznaczalności zestawiono w tabeli 14. Najbardziej odpowiednie do kontroli jakości badań próbki osadu były certyfikowane materiały odniesienia oznaczone oraz CRM029-050. Potwierdziły to wyniki badań odzysku uzyskane w obu spektrometrach. Wartości odzysku różniły się na poszczególnych liniach analitycznych, podobnie jak w przypadku badanej próbki osadu. Zdecydowanie zbyt wysoki odzysk otrzymano dla linii analitycznych 216,999, co pozwala sądzić, że zawartość Pb w badanej próbce osadu oznaczona na tych liniach analitycznych mogła być zawyżona. Na rys. 6 i 7 przedstawiono piki Pb uzyskane na dwóch liniach 216,999. Są to piki Pb w próbce osadu ściekowego (kolor 120 115 110 105 Odzysk, % 95 90 85 80 216,999 {455} 220,353 {153} 405,783 { 83} 216,999 {456} 220,353 {453} NCS DC 73371 CRM029-050 Fig. 4. Recovery of Pb in matrix CRM materials for Rys. 4. Odzysk Pb dla matrycowych materiałów CRM dla Fig. 6. Peak of Pb on the 216,999{455} analytical line Rys. 6. Pik Pb na linii analitycznej 216,999{455} Zawartość Pb, mg/kg 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 216.999{455} 216.999{456} 220.353{153} 220.353{453} 405.783{83} Fig. 5. Pb content in sediment sample Rys. 5. Zawartość Pb w próbce osadu oznaczona na obu spektrometrach Fig. 7. Peak of Pb on the 216,999{456} analytical line Rys. 7. Pik Pb na linii analitycznej 216,999{456} 93/4(2014) 583
Fig. 8. Peak of Pb on the 405,783{83} analytical line Rys. 8. Pik Pb na linii analitycznej 405,783{483} czerwony) oraz w próbkach dwóch materiałów CRM oraz CRM029-050 (linia fioletowa i zielona). Analiza kształtu pików ołowiu może pomóc w identyfikacji interferencji, które negatywnie wpływają na wyniki oznaczeń na tych liniach analitycznych. Na obu rysunkach widoczna jest duża interferencja Mo. Występowała ona zarówno w badanej próbce osadu, jak i w materiałach CRM, zawyżając zawartości ołowiu. Stężenie ołowiu oznaczone na obu liniach 216,999 nie było zatem prawdziwe. Podobnie było w przypadku linii 405,783{83}. Na rys. 8 przedstawiono pik ołowiu otrzymany na tej linii analitycznej. Widoczną interferencję spektralną zidentyfikowano jako Fe. Najbardziej widoczna była ona w badanej próbce osadu. Nie wpływała natomiast znacząco na oznaczaną zawartość Pb w materiałach CRM oraz CRM029-050. Ponieważ w badanej próbce osadu zawartość Fe była 3-krotnie większa niż w materiałach CRM, można było podejrzewać, że zawartość ołowiu oznaczona na tej linii również była zawyżona. Poprawnie Pb był zatem oznaczany wyłącznie na liniach 220,353, przedstawionych na rys. 9 i 10. Na liniach analitycznych 220,353 nie występowały widoczne w oglądanym obszarze interferencje spektralne. Odzysk zawartości Pb z matrycowych materiałów CRM był zadowalający. W związku z tym zawartość ołowiu oznaczoną na liniach analitycznych 220,353 uznano za poprawną. Podsumowanie i wnioski Analizując wyniki walidacji, wyznaczono parametry walidacyjne oraz dokonano selekcji linii analitycznych. Eliminacja linii analitycznych była związana z małą czułością oraz wpływem interferencji spektralnych. Linie analityczne wybrane na podstawie danych walidacyjnych stanowiły bazę metody analitycznej. Poprawność użycia danej linii analitycznej powinna być jednak dodatkowo weryfikowana przy każdej analizie, w zależności od matrycy analizowanej próbki, zawartości analitu i możliwych interferencji, co wykazano na przykładzie oznaczania ołowiu w próbce osadu ściekowego dostarczonego przez klienta. Wykazano także zasadność użycia certyfikowanych materiałów odniesienia już po zakończonym procesie walidacji, do kontroli jakości badań. Fig. 9. Peak of Pb on the 220,353{153} analytical line Rys. 9. Pik Pb na linii analitycznej 220,353{153} Badania wykonano w ramach projektu Opracowanie i atestacja nowych typów materiałów odniesienia niezbędnych do uzyskania akredytacji europejskiej przez polskie laboratoria zajmujące się analityką przemysłową MODAS 9). Otrzymano: 24-03-2014 Fig. 10. Peak of Pb on the 220,353{453} analytical line Rys. 10. Pik Pb na linii analitycznej 220,353{453} LITERATURA 1. PN-EN ISO/IEC 17025:2005, Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących. 2. O. McPolin, Validation of analytical methods for pharmaceutical analysis, Mourne Training Services, United Kingdom 2009. 3. Mat. szkoleniowe XVII Sympozjum Klubu Polskich Laboratoriów Badawczych POLLAB Klub Polskich Laboratoriów Badawczych POLLAB, Wymagania techniczne normy PN-EN ISO/IEC 17025 w praktyce laboratoryjnej 3, Walidacja, Kołobrzeg/Krynica Zdrój 2011. 4. Mat. szkoleniowe XVII Sympozjum Klubu Polskich Laboratoriów Badawczych POLLAB Klub Polskich Laboratoriów Badawczych POLLAB, Wymagania techniczne normy PN-EN ISO/IEC 17025 w praktyce laboratoryjnej 3, Walidacja, Kołobrzeg/Krynica Zdrój 2011, s. 9. 5. Trends Anal. Chem. 1999, 18, nr 9+10, 584. 6. E. Bulska, Metrologia chemiczna. Sztuka prowadzenia pomiarów, Wydawnictwo Malamut, Warszawa 2008. 7. http://thermopolska.pl/oes/charakterystyka_icap_6000.pdf, dostęp 25 października 2013. 8. Dokumentacja systemu zarządzania Akredytowanego Laboratorium Chemicznego Analiz Wielopierwiastkowych we Wrocławiu, certyfikat akredytacji nr AB 696 9. http://www.pg.gda.pl/chem/modas/, 28 października 2013 r. 584 93/4(2014)