Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu. Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt. Instytut Hodowli Zwierząt. Zakład Hodowli Bydła i Produkcji Mleka

Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt Instytut Hodowli Zwierząt Zakład Hodowli Bydła i Produkcji Mleka MONIKA DEMKOWICZ BIOAKTYWNE PREPARATY Z SIARY KRÓW ZACHOWUJĄCE PARAMETRY JEJ WARTOŚCI BIOLOGICZNEJ ORAZ ICH PRZYSWAJALNOŚĆ U JAGNIĄT I CIELĄT Wrocław 2012

Praca doktorska wykonana Pod kierunkiem prof. dr hab. Tadeusza Szulca Badania zrealizowano w ramach projektu BIOŻYWNOŚĆ innowacyjne, funkcjonalne produkty pochodzenia zwierzęcego nr POIG.01.01.02-014-090/09 współfinansowanego przez Unię Europejską ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka 2007 2013

Dziękuję Panu prof. Tadeuszowi Szulcowi za poświęcony czas, wskazówki oraz pomoc okazaną podczas pisania pracy Dziękuję wszystkim pracownikom Zakładu Hodowli Bydła i Produkcji Mleka za wsparcie i pomoc, a szczególnie Katarzynie Paczyńskiej i Irminie Newlacil za motywacje i wsparcie Dziękuję również: Romanowi Demkowiczowi Stanisławie Betscher Michałowi Markowi Lidii Karcz Marcie Przybyło Anettcie Kucharskiej bez których ta praca by nie powstała

Pracę dedykuję mojej wspaniałej mamie, Alicji Demkowicz

STRESZCZENIE Bioaktywne preparaty z siary krów zachowujące parametry jej wartości biologicznej oraz ich przyswajalność u jagniąt i cieląt Celem przeprowadzonych badań była analiza różnych technologii pozyskiwania, kolekcjonowania i konserwacji preparatów z siary krów rasy phf, pozwalających na zachowanie jej wartości biologicznej oraz wysokiego poziomu aseptyczności. Określono skład podstawowy (białko, tłuszcz, laktoza, sucha masa) i udział frakcji białkowych w siarze z pierwszego oraz pierwszych 10 dojów po porodzie. Oznaczono również profil kwasów tłuszczowych oraz zawartość mikroflory w siarze z pierwszego doju. W pierwszych dziesięciu dojach po porodzie wzrastała w siarze zawartość α-kazeiny, a znacząco obniżyła się zawartość immunoglobulin klasy G. W redukcji mikroflory siary krów, najskuteczniejszymi metodami okazały się: skoncentrowane pole mikrofalowe (CMF) zastosowane wraz z pulsacyjnym polem elektrycznym (PEF) oraz filtracja membranowa. Nieprzydatna natomiast okazała się pasteryzacja oraz zastosowanie promieni ultrafioletowych UV. Opracowano metodę pozyskiwania koncentratu białkowego z siary krów metodą filtracji na membranach ceramicznych. Uzyskany permeat charakteryzował się dużym udziałem immunoglobulin, wysoką przyswajalnością i przydatnością do zastosowania we wspomaganiu układ odpornościowego osesków. Suplementacja siarą i preparatami siarowymi u jagniąt w pierwszej dobie po porodzie wykazała wysoką przyswajalność immunoglobulin oraz pozytywny wpływ na ich rozwój i przyrosty dobowe. Przy zastąpieniu siary matek, w pierwszej dobie życia cieląt, suszonymi lub liofilizowanymi preparatami siarowymi, wykazano wysoką przyswajalność immunoglobulin z preparatów siarowych u cieląt po porodzie. 5 S tro n a

Stwierdzono, że suplementacja siarą i koncentratami siary krów u jagniąt po porodzie wpłynęła na poprawę ich statusu immunologicznego i wzrost tempa przyrostów dobowych masy ciała. Zamienne stosowanie w wychowie cieląt suszonego i liofilizowanego koncentratu siary krów, uzyskanego po filtracji membranowej i wcześniejszym działaniu skoncentrowanego pola mikrofalowego oraz pulsacyjnego pola elektrycznego, spowodowało istotny wzrost poziomu immunoglobulin w surowicy ich krwi. Stwierdzono wyższą przyswajalność immunoglobulin klasy G z preparatów siarowych u osesków w porównaniu do siary ich matek. Słowa kluczowe: siara, filtracja, immunoglobuliny, cielęta, jagnięta 6 S tro n a

SUMMARY Bioactive preparations from cow colostrum retaining parameters of its nutritional value and its digestibility in lambs and calves. The aim of this study was to analyze a different technologies for capturing, collecting and maintenance preparations from polish holstein-friesian (phf) cows colostrum, maintaining its biological value and a high level of aseptic. The basic components (protein, fat, lactose, dry weight) and protein fractions in the colostrum of the first and the first 10 milkings after the birth were determined. The fatty acid profile and content of microflora was analyzed in the colostrum from the first milking. The level of α-casein increased, while the contend of immunoglobulins G significantly decreased in the colostrum at the first ten milkings. The most effective methods of microbial reduction in cows colostrum were: the concentrated microwave field (CMF) along with the pulsated electrical field (PEF) and membrane filtration. The pasteurization and the ultraviolet radiation turned out to be uneffective. A method of obtaining protein concentrate from cow colostrum using ceramic membrane filtration was developed. The obtained permeate was characterized by a high proportion of immunoglobulins, high absorbency and suitability for use to support the immune system of newborns. The lambs supplementation by cattle colostrum and cattle colostrum preparations at the first day after their birth showed high absorption of immunoglobulins and positive impact on their development and daily gains. Replacing the maternal colostrum, in the first day of calves life by dried or lyophilized colostrum preparations showed high absorption of immunoglobulins. 7 S tro n a

Supplementation of colostrum and colostrum preparations in lambs after birth showed improved in their immune status activity and increase in the rate of their daily weight gains. Interchangeable usage of dried or lyophilized colostrum preparations in rearing calves, obtained by filtration membrane and PEF and CMF resulted in a significant increase in the level of immunoglobulin in their blood serum. Higher absorption of immunoglobulin G from colostrum preparations in suckling newborns compared to colostrum of their mothers was determined. Keywords: colostrum, filtration, immunoglobulins, calves, lambs 8 S tro n a

SPIS TREŚCI 1. Objaśnienia skrótów zastosowanych w pracy... str. 10 2. Wstęp... str. 11 3. Przegląd piśmiennictwa... str. 13 3.1 Skład siary... str. 13 3.1.1 Białka siary... str. 14 3.1.2 Tłuszcz siary... str. 20 3.1.3 Witaminy i związki mineralne... str. 23 3.2 Przetwarzanie i konserwacja siary... str. 24 3.3 Przyswajalność siary przez oseski... str. 32 4. Cele badań... str. 34 5. Materiał i metody... str. 35 5.1 Siara... str. 35 5.2 Metody analiz i oznaczeń... str. 35 5.3 Obróbka siary i preparatów siarowych... str. 38 5.4 Badania przyswajalności immunoglobulin preparatów siarowych przez jagnięta i cielęta... str. 44 6. Omówienie wyników i dyskusja... str. 47 6.1 Skład oraz cechy fizykochemiczne siary... str. 47 6.2 Redukcja flory bakteryjnej w siarze... str. 55 6.2.1 Klasyczna pasteryzacja siary... str. 55 6.2.2 Naświetlanie promieniami UV... str. 56 6.2.3 Zastosowanie skoncentrowanego pola mikrofalowego (CMF) oraz pulsacyjnych pól elektrycznych (PEF) w likwidacji flory bakteryjnej... str. 58 6.2.4 Zastosowanie filtracji membranowej w pozyskaniu koncentratu białkowego... str. 62 6.2.5 Dehydratacja siary i preparatów siarowych... str. 62 6.3 Wpływ siary i preparatów siarowych na status immunologiczny jagniąt... str. 63 6.4 Wpływ preparatów siarowych na status immunologiczny cieląt... str. 64 7. Podsumowanie... str. 70 8. Literatura... str. 71 9 S tro n a

1. OBJAŚNIENIE SKRÓTÓW ZASTOWOSANYCH W PRACY AA kwas arachidonowy CLA sprzężony kwas linolowy CMF skoncentrowane pole mikrofalowe DHA kwas dokozaheksanowy E. coli Escherichia coli EGF czynnik wzrostowy naskórka EPA kwas eikozapantaenowy FGF czynnik wzrostowy fibroblastów GMA glikomakropeptyd GM CSF czynnik stymulujący tworzenie koloni granulocytów i makrofagów HDL lipoproteina wysokiej gęstości IgG immunoglobuliny klasy G LDL lipoproteina niskiej gęstości MF mikrofiltracja MUFA jednonienasycone kwasy tłuszczowe PDGF płytkowy czynnik wzrostu PEF pulsacyjne pole elektryczne PRP bogaty w prolinę zestaw polipeptydów PUFA wielonienasycone kwasy tłuszczowe SFA nasycone kwasy tłuszczowe TGF transformujący czynnik wzrostu TNF czynniki martwicy nowotworu VEGF czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego WNKT wielonienasycone kwasy tłuszczowe 10 S tro n a

2. WSTĘP Siara jest wydzieliną gruczołu mlekowego samic ssaków, gromadzoną i produkowaną w końcowym okresie ciąży oraz w pierwszych dniach po porodzie. Dostarcza ona noworodkowi niezbędne substancje odżywcze oraz składniki biologicznie czynne, zapewniające odpowiedni poziom zabezpieczenia i stymulacji układu immunologicznego. Najważniejszą frakcją białkową w siarze są immunoglobuliny, dostarczające noworodkowi ciała odpornościowe przeciwko chorobotwórczej florze bakteryjnej, z którą spotyka się po urodzeniu. Poza immunoglobulinami w skład siary wchodzą inne białka, hormony, czynniki wzrostu (insulinowy czynnik wzrostu I i II, TGF alfa, beta1 i beta2, FGF, EGF, GM-CSF, PDGF, VEGF) enzymy i jelitowe peptydy regulacyjne oraz duża grupa czynników o działaniu antybakteryjnym, prebiotyki i probiotyki [Płusa 2009; Rawal i wsp. 2008; Stewagen i wsp. 2008; Szulc i Zachwieja 1998]. Od krowy wysoko wydajnej pozyskuje się w pierwszej dobie 12-15 litrów siary, gdy dla cielęcia w tym czasie wystarczy 6-7 litrów. W drugiej dobie wydajność jest podobna, chociaż wartość siary jest już dużo niższa. Zazwyczaj nadmiar zdajanej siary skarmiany jest starszymi zwierzętami lub utylizowany. Stwarza to możliwość wykorzystania nadwyżek tak unikatowego surowca do wspomagania odporności oraz w profilaktyce u innych gatunków zwierząt i ludzi. Główną właściwością biologiczną siary jest wzmacnianie bariery przeciwko patogennym mikroorganizmom. Wynika to z wysokiego udziału immunoglobulin oraz innych składników, takich jak: laktoferyna, laktopreoksydaza, układ dopełniacza, bogaty w prolinę zestaw polipeptydów (PRP), kazeiny i ich pochodne, glukomakropeptyd (GMA), laktoalbuminy, lizozym, defenzyny, laktoperoksydaza oraz cytokiny (interleukiny, TNF, chemokiny). Wszystkie te składniki mają udowodnione działanie antybakteryjne i przeciwzapalne, a także działania przeciwnowotworowe [Shield i wsp. 1993; Stewagen i wsp. 2008]. Wartościowym uzupełnieniem funkcji jest też tłuszcz siary występujący w formie bardzo małych, łatwo przyswajalnych kuleczek tłuszczowych. Siara ma więc szczególne właściwości prewencyjne, ale również wykazuje wysokie działanie terapeutyczne. 11 S tro n a

W procesie pozyskiwania siary dochodzi jednak do jej zakażenia, często bardzo znacznego, różnymi szczepami bakterii. Powoduje to nie tylko flora bakteryjna gruczołu mlekowego, ale również niska higiena urządzeń udojowych. Do najczęściej spotykanych zaliczyć należy bakterie z grupy Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leconostoc, Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, bakterie grupy coli (Esherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebisiella, Serratia) oraz patogenne gatunki: Salmonella, Campylobacter jejunii i C. coli, Streptococcus ureus [Akineden i wsp. 2001; Houser i wsp. 2008]. W realiach produkcyjnych nie można zapewnić aseptycznych warunków procesu pozyskania siary, które wyeliminowałyby możliwość zakażenia. Często też krowy wchodzą w nową laktację z zakażonym gruczołem mlekowym. Chcąc więc wykorzystać nadmiar siary produkowanej przez krowy należy określić sposób jej pozyskiwania i postępowania po wydojeniu tak, aby maksymalnie zmniejszyć jej zakażenie, zahamować dalszy rozwój flory bakteryjnej, bez obniżania jej właściwości biologicznych. W tym celu należy wdrożyć do procesu konserwacji, innowacyjne techniki obróbki siary, które wykorzystują inne zjawiska (poza wysoką temperaturą) dezaktywujące i eliminujące bakterie, bez utraty lub uszkodzenia aktywnych czynników immunostymulujących. Dla celów profilaktycznych i terapeutycznych, szczególnie przy wychowie osesków różnych gatunków zwierząt, należy poszukiwać metod przetwarzania siary i produkcji na jej podstawie bioaktywnych preparatów stymulujących i wspomagających układ odpornościowy. Wiele badań nad funkcją bioaktywnych preparatów siary i mleka w profilaktyce i żywieniu człowieka wskazują na potrzebę ich racjonalnego wykorzystania. 12 S tro n a

3. PRZEGLĄD PIŚMIENNICTWA 3.1 SKŁAD SIARY Siara jest początkową wydzieliną gruczołu mlekowego ssaków. Jej skład i właściwości w znaczący sposób różnią się od mleka: kolor przybiera różne odcienie żółci, ma wyższą gęstość, niższe ph (ok. 6,4), zawiera więcej składników biologicznie aktywnych. Siara w wielu kulturach była wysoko cenionym źródłem pełnowartościowego pożywienia [Szulc i Zachwieja 1998]. Jeszcze w drugiej połowie ubiegłego wieku główną wagę przykładano do zawartości białka oraz tłuszczu w mleku i siarze, a także liczby bakterii i komórek somatycznych. Dopiero w ostatnich 30 latach zintensyfikowano badania umożliwiające bardziej szczegółowe poznanie składu siary i jej struktury oraz identyfikację nieznanych do tej pory składników o wielofunkcyjnych właściwościach, w tym prozdrowotnych. Najwięcej biologicznie aktywnych cech stwierdzono w białkach i tłuszczu mleka, co wpłynęło na zainteresowanie tymi składnikami i ich wykorzystaniem w praktyce [Król i wsp. 2008; Ziemiecki i Artym 2005]. Skład siary poszczególnych krów wykazuje zmienność, która jest warunkowana przez rasę, stado, porę roku, długość okresu międzywycieleniowego, wydajność, wiek, stan zdrowia oraz poziom żywienia [Zachwieja i wsp. 2007]. Kolejnym czynnikiem wpływającym na zawartość poszczególnych składników jest czas oraz liczba dojów po ocieleniu [Szulc i wsp. 1998]. Z licznych badań wynika, że zawartość białka ogólnego w siarze pobranej z pierwszego doju po wycieleniu wynosi od 9,36 do 17,7% (w tym białka serwatkowe od 7,76 do 13,31%), tłuszczu w przedziale 3,71-6,59%, laktozy od 1,02 do 2,56% i związków mineralnych od 0,95 do 1,32%. Z każdym kolejnym dojem obniża się o około połowę zawartość immunoglobulin klasy G od poziomu 45-80 g/l do 0,5-1,5 g/l [Andrew 2001; Georgiev 2008; Guliński i wsp. 2006; Guliński i wsp. 2006a; Holloway i wsp. 2001; Holloway i wsp. 2002; Kehoe i wsp. 2011; Murphy i wsp. 2005; Pecka i Zachwieja 2011; Płusa 2009, Szulc 2012, Zachwieja 1991]. Główną właściwością biologiczną siary jest wzmocnienie bariery obronnej organizmu noworodka przeciwko chorobotwórczej florze bakteryjnej i rotawirusom oraz przyśpieszenie rozwoju jego układu immunologicznego, głównie dzięki zawartym w niej immunoglobulinom. Poza immunoglobulinami głównymi białkami siary są kazeiny i ich pochodne oraz inne związki, takie jak: laktoferyna, laktopreoksydaza, 13 S tro n a

układ dopełniacza, bogaty w prolinę zestaw polipeptydów (PRP), glikomakropeptyd (GMA), laktoalbuminy, lizozym, defenzyny i laktoperoksydaza oraz cytokiny (interleukiny, TNF, chemokiny), hormony, czynniki wzrostowe (insulinopodobny czynnik wzrostu I i II, TGF alfa, beta1 i beta2, FGF, EGF, GM-CSF, PDGF, VEGF) enzymy i jelitowe peptydy regulacyjne oraz duża grupa czynników o działaniu antybakteryjnym, prebiotyki i probiotyki [Elfstrand i wsp. 2002; Płusa 2009; Rawal i wsp. 2008; Stewagen i wsp. 2008; Szulc i Zachwieja 1998]. Wszystkie te składniki mają udowodnione działanie antybakteryjne i przeciwzapalne, ale również działanie przeciwnowotworowe u ludzi [Shield i wsp. 1993; Stewagen i wsp. 2008]. Wartościowym uzupełnieniem biologicznych funkcji siary jest tłuszcz występujący w formie małych, łatwo przyswajalnych kuleczek tłuszczowych. Krowa wysoko wydajna produkuje w pierwszej dobie po ocieleniu więcej siary niż może wypić jej cielę. W kolejnych dniach wydajność wzrasta, lecz wartość, a szczególnie poziom immunoglobulin, gwałtownie maleje. Zazwyczaj nadmiar zdajanej siary skarmiany jest starszymi zwierzętami, co nie jest racjonalnym jej wykorzystaniem, a nawet może powodować u nich biegunki. W niektórych stadach jest zamrażana i gromadzona w bankach siary, ale też czasem wylewana do kanalizacji. Większość badań nad właściwościami bioaktywnych składników siary i mleka wykonana została na zwierzętach, ale była również analizowana w procesach przemian fizjologicznych u ludzi. 3.1.1 Białka siary O właściwościach funkcjonalnych białek siary i mleka decydują właściwości oraz struktura ich cząsteczek. Do najważniejszych cech należy zaliczyć: wielkość, kształt, układ przestrzenny, łatwość wiązania się w konglomeraty, podatność na denaturację, sekwencje aminokwasowe. W skład mleka i siary wchodzi ponad 30 różnych białek, które można podzielić na dwie grupy: kazeiny (których udział w siarze sięga 20%, a w mleku 80%) i białka serwatkowe (w siarze do 80%). W białkach siary oznaczono 19 aminokwasów, z czego wszystkie mają pochodzenie egzogenne [Andrew 2001; Groen i wsp. 1994, Wróblewska i Jędrychowski 2003; Płusa 2009]. Liczne badania, zarówno na zwierzętach, jak i badania kliniczne na ludziach dowiodły, że 14 S tro n a

białka siary można wykorzystać również u ludzi w profilaktyce i terapii chorób autoimmunologicznych, geoplastycznych, przy obniżeniu odporności oraz w odbudowie układu immunologicznego po chemioterapii, zakażeniach, sepsie i endotoksemii [Ziemiecki i Artym 2005]. Pozytywny wpływ terapeutyczny białek siary odnotowano również przy leczeniu schorzeń zespołu hemolityczno-mocznicowego i biegunki krwotocznej. Preparaty siarowe zmniejszają też wystąpienie biegunek pochodzenia pokarmowego oraz zachorowań na wrzody przy zakażeniu Helicobacter pylori [Casswal i wsp. 1998]. Duże zainteresowanie budzą badania pilotażowe nad wpływem siary na cukrzycę (testy na myszach z cukrzycą alokanową) [Persaud i Barranco- Mendoza 2004; Pan i Liu 2008; Schatz i Maclaren 1996], a u pacjentów z AIDS podawanie siary zmniejszyło biegunki zakaźne [Shield i wsp. 1993]. Najważniejszą grupą białek siary są białka serwatkowe. Zaliczamy do nich immunoglobuliny, α-laktoalbuminę, β-laktoglobulinę i serum albuminę. W siarze ta grupa białek występuje w postaci koloidu i charakteryzują się wysoką zawartością cystyny, cysteiny i lizyny oraz wykazują wysoką aktywność biologiczną. Immunoglobuliny Immunoglobuliny są białkami wydzielanymi przez pobudzone limfocyty B w procesie odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego. Mają one zdolność do swoistego rozpoznawania antygenów. Odgrywają ważną rolę w obronie organizmu przed zewnętrznymi bakteriami i pasożytami. Głównym zadaniem immunoglobulin jest wiązanie antygenu, co umożliwia opsonizację i neutralizację patogenów, dzięki czemu łatwiejsze jest usunięcie ich z organizmu na drodze fagocytozy [Elfstrand i wsp. 2002; McConnel i wsp. 2001]. Aktywuje też układ dopełniacza, co skutkuje niszczeniem niektórych patogenów i pobudzeniem odpowiedzi odpornościowej, która uruchamia proces cytotoksyczności komórkowej (zależnej od przeciwciał) oraz neutralizowanie toksyn i wirusów przez oddziaływanie bakteriostatyczne i blokowanie adhezyn bakteryjnych. U ludzi i zwierząt wyróżnia się 6 klas immunoglobulin: H, G, M, A, D, E i Y (u ptaków). Ich obecność stwierdzono w większości wydzielin ciała (siara, łzy, ślina, krew, mleko) [Andrew 2001; Holloway i wsp. 2001; Korhonen i wsp. 2000; Levieux i Ollier 1999; Płusa 2009]. 15 S tro n a

U bydła wykazano obecność trzech klas immunoglobulin (IgG, IgM, IgA): immunoglobuliny klasy G (z dwoma podklasami G1 i G2) stanowią w siarze 65-90% immunoglobulin; głównym ich zadaniem jest stymulacja układu immunologicznego osesków i zwalczanie infekcji bakteryjnych, immunoglobuliny klasy M (IgM) stanowiące ok. 8-10% są czynnikiem przeciwzakaźnej odporności humoralnej; zależne są od limfocytów B, immunoglobuliny klasy A (IgA) działają w mechanizmach odpornościowych błon śluzowych przewodu pokarmowego, dróg oddechowych i układu moczowo-płciowego, gdzie zapobiegają kolonizacji przez patogeny [Szulc i wsp. 1993]. Alfa-laktoalbumina (α-la) Alfa-laktoalbumina bydlęca wykazuje 74% homologii do ludzkiego odpowiednika tego białka. Podlega denaturacji przy temperaturze powyżej 60 o C, ale po ponownym obniżeniu temperatury następuje częściowa adenaturacja [Chaplin i wsp. 1986]. Białko to pełni ważną funkcję w sekrecji mleka oraz transporcie jonów metali. Jest czynnikiem kancerogennym, towarzyszącym apoptozie i przekształcaniu linii komórek nowotworowych [Elfstrand i wsp. 2002; Król i wsp. 2008; Levieux i Ollier 1999]. Wchodząc w interakcję z kwasem oleinowym tworzy kompleks, który wykazuje działanie przeciwko komórkom nowotworowym. Posiada właściwości bakteriobójcze w odniesieniu do E. coli O127. Jej trawienie uwalnia antybakteryjne peptydy hamujące rozwój patogenów i zmniejszające biegunkę u noworodków. Dzięki dużej zawartości tryptofanu, prekursora serotoniny, zwiększa odporność na stres u osób, których dieta bogata jest w alfa-laktoalbuminę. Poprzez zwiększanie poziomu prostaglandyny wpływa pośrednio na ochronę organizmu przed wrzodami żołądka. Pełni również rolę immunostymulującą w diecie noworodków. Wykazuje też wysoki stopień homologii do lizozymu [Stelwagen i wsp. 2008]. Jednym z biopeptydów alfa-laktoalbuminy jest alfa-laktofiryna. Pobudza ona receptory opioidowe (odpowiedzialne za uśmierzanie bólu) w jelitach, stymuluje do wydzielania mucyny jelitowej, co stanowi wzmocnienie bariery odpornościowej organizmu oraz działając jako inhibitor ACE obniża ciśnienie krwi. 16 S tro n a

Beta-laktoglobulina (β-la) Jest to białko, o zdolności wiązania wielu substancji, w tym witamina A i witamina D, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych oraz cholesterolu. W niskim ph (do ph=3,5) jest monomerem, w wyższym ph (do ph=6,5) jest oktamerem, a w ph neutralnym dimerem [Pan i Liu 2007]. Nie występuje w mleku kobiecym i nie posiada ludzkiego odpowiednika białkowego, który mógłby być uznany za jej homolog. Nie jest trawiona w 100%, a niehemolizowane cząstki mogą powodować u ludzi alergie [Bärbel i wsp. 2005; Król i wsp. 2008, Levieux i Ollier 1999]. Odgrywa też kluczową rolę antyoksydacyjną w mleku, co wynika z obecności aminokwasów siarkowych oraz możliwości syntezy glutationu. Ma też wysoką aktywność kancerogenną (pozytywnie wpływa na stabilność DNA) i jako jedyne białko serwatkowe ma zdolność wiązania mutagennych, heterocyklicznych amin, co hamuje ich aktywność rakotwórczą. Wykazuje również działanie wspomagające w leczeniu infekcji wirusowych (obniża ryzyko występowania infekcji towarzyszących u zarażonych wirusem HIV) [Greenberg i Cello 1996; Kaducu i wsp. 2011; Rump i wsp. 1992]. Ma również działanie bakteriobójcze, zapobiegając adhezji komórek bakteryjnych oraz kolonizacji przez nie nowych siedlisk. Bioaktywny peptyd, pochodny β-laktofiryny ma właściwości ACE-inhibitorowe, co przyczynia się do obniżenia ciśnienia krwi u ludzi. Nadtrawiona beta-laktoglobulina ma działanie bakteriobójcze zarówno dla bakterii Gram dodatnich (Bacillus subtilis, Staphylococcus ureus), jak i gram ujemnych (E. coli, Bordetella bronchisepica) [Król i wsp. 2008]. Kazeiny Wśród kazein możemy wyróżnić cztery frakcje: alfa-s1, alfa-s2, beta i kappa. Ich proporcja w pierwszych godzinach po porodzie jest zbliżona do stosunku 38:11:38:13. Wraz z fosforanami wapnia, kazeiny tworzą kompleksy wielkocząsteczkowych miceli (50-250 nm). Białka te są cennym źródłem egzogennych aminokwasów, które stanowią blisko połowę jej masy, a proteiny powstające w wyniku jej hydrolizy charakteryzują się licznymi prozdrowotnymi właściwościami dla człowieka (białka opiatowe, białka immunostymulujące obniżające ciśnienie krwi i hamujące agregację płytek krwi, nośniki jonów metali). W połączeniu z fosforanem 17 S tro n a

wapnia zapobiega też próchnicy zębów [Ginger i Grigor 1999; Hay i Thompson 2002, Shu-Hua i Chi-Yue 2005]. Kazeiny są białkami immunologicznie poliwalentnymi, co może powodować reakcje alergiczne u ludzi. Największym potencjałem alergennym dla człowieka charakteryzuje się alfa-s1-kazeina, która nie posiada homologu w białkach mleka kobiecego. Natomiast posiadająca homolog w mleku kobiecym beta kazeina charakteryzuje się dużo niższą alergennością [Ginger i Grigor 1999, McIntosh i wsp. 1998]. Poza białkami serwatkowymi i kazeinami, w siarze występuje bogactwo związków białkopochodnych i enzymów białkowych o właściwościach prozdrowotnych. Wśród nich jest lizozym, którego zawartość w siarze może dochodzić do 1g/l. Wykazuje on silne właściwości bakteriobójcze i jest obecny w niewielkich stężeniach we wszystkich płynach ustrojowych. W obecności immunoglobulin jego aktywność ulega zwiększeniu. Dzięki odporności na działanie proteaz zachowuje swoje właściwości w całym układzie pokarmowym, gdyż nie ulega trawieniu [Conneely 2001]. Kolejnym związkiem oddziałującym na układ immunologiczny jest laktoferyna. Jest to glikoproteid mający zdolność wiązania żelaza, występujący w neutrofilach i w większości płynów ustrojowych [Tsuji i wsp. 1990]. Ma działanie immunostymulujące, przeciwbakteryjne, przeciwgrzybiczne, przeciwpasożytnicze i przeciwnowotworowe oraz reguluje absorpcję żelaza w jelitach. Laktoferyna siary bydlęcej wpływa stymulująco na dojrzewanie limfocytów i inicjację odpowiedzi immunologicznej, działając bezpośrednio na komórki prekursorowe T grasicy, powodując ich przekształcenie w limfocyty pomocnicze (Th) [Conneely 2001; Haqiwara i wsp. 2003 Lonnerdal i Iyer 1995; Malewska i Rotkiewicz 2007]. Promuje również dojrzewanie limfocytów B oraz umożliwia im zdolność do prezentowania antygenów liniom komórek Th. Wykazuje też właściwości adjuwantowe, a dodatkowo, podawana doustnie, stymuluje miejscową i systemową nieswoistą odpowiedź organizmu. Działa ochronnie na komórki nabłonkowe jelit, stymuluje wzrost tkanki kostnej, a u zwierząt poddanych immunosupresji przyspiesza ponowne, prawidłowe działanie układu immunologicznego [Ziemiecki i Artym 2005]. Laktoferyna znacząco pobudza do proliferacji limfocyty produkujące przeciwciała. Niewysycona żelazem 18 S tro n a

laktoferyna (apolaktoferyna) z łatwością łączy się ze ścianami komórkowych bakterii Gram ujemnych, powodując uwalnianie z nich liposacharydów, co prowadzi do degradacji komórek bakteryjnych [Eliasen i wsp. 2002; Elliason i Giehl 1991; Kawai i wsp. 1999]. Badania wykazują również działanie pośrednie przeciwko kolonizacji przez patogeny ścian jelita cienkiego, hamując ich adhezję do enterocytów. Dodatkowo, w stanach zapalnych, kiedy dochodzi do uszkodzenia mioglobiny i uwalniania żelaza, laktoferyna może je wiązać, zapobiegając tym samym powstawaniu toksycznych reaktywnych form tlenu [Eliasen i wsp. 2002]. Laktoperoksydaza należy do grupy enzymów klasy oksydoreduktaz, katalizujących utlenianie nadtlenkiem wodoru różnych substratów. Obecna jest w mleku krowim, natomiast nie została wykryta w mleku kobiecym. Liczne badania mają na celu znalezienie metody wykorzystania jej jako czynnika antybakteryjnego m.in. w gospodarstwie domowym, konserwacji żywności i higienie jamy ustnej, a także w hodowli ryb [Steijns i Van Hooijdonk 2000]. Układ dopełniacza stanowi zespół kilkudziesięciu białek obecnych w siarze, osoczu, innych płynach ustrojowych oraz powiązane z nimi funkcjonalnie liczne receptory i białka regulatorowe. Układ dopełniacza spełnia ważną rolę we wrodzonych, humoralnych mechanizmach nieswoistej odpowiedzi immunologicznej, ale także wiąże się ściśle z niektórymi mechanizmami odpowiedzi swoistej. Jego działanie polega na aktywacji kaskady enzymatycznej, mającej istotne znaczenie w przebiegu odpowiedzi immunologicznej i reakcji zapalnej. Jednak nadmierne jego pobudzenie lub defekty białek regulacyjnych mogą być przyczyną powstawania schorzeń. Do głównych zadań układu dopełniacza należy opsonizacja bakterii, wirusów, grzybów i pasożytów, aktywacja fagocytów, liza niektórych bakterii i wirusów oraz uszkodzonych lub zmutowanych komórek organizmu, ogólna aktywacja reakcji zapalnej oraz usuwanie kompleksów immunologicznych przeciwciało-antygen [Płusa 2009]. Bogaty w prolinę zestaw polipeptydów PRP (32 peptydy) wykazuje dużą homologię do β-kazeiny oraz pełni różnorodne funkcje, w tym promocję dojrzewania komórek T, indukcję cytokin, a także wspomaga hamowanie chorób układu immunologicznego [Kruzel i wsp. 2001]. Zastosowanie PRP u ludzi okazało się korzystne w ograniczaniu rozwoju choroby Alzheimera. Badania wykazały, że produkty trawienia PRP chymotrypsyną regulowały humoralną odpowiedź immunologiczną, 19 S tro n a

reakcję nadwrażliwości typu późnego i promowały dojrzewanie tymocytów [Starościk i wsp. 1983]. Liczne badania na myszach wykazują pozytywne działanie PRP w chorobach autoimmunologicznych i stwarzają podstawy do jego wykorzystania w terapii tych chorób również u ludzi [Ziemiecki i wsp. 1991]. Do pozostałych czynników biologicznie aktywnych należy też, pochodzący z κ-kazeiny glikomakropeptyd (GMP), wykazujący różnorodną aktywność przeciwbakteryjną i przeciwzakrzepową [Płusa 2009]. Kolejną grupę stanowią białka cytotoksyczne, takie jak: defenzyny, cytokiny, chemokiny, czynnik martwicy nowotworu (TNF) i interferon, które mają szeroki zakres aktywności wobec wirusów, a u bakterii i grzybów uszkadzając błony komórkowe. 3.1.2 Tłuszcz siary Tłuszcz, dzięki specyficznym właściwościom, wchodzi w budowę podstawowych struktur organizmu, w tym błon komórkowych i błon całych organów, w tym mózgu. Jest więc jednym z cennych składników diety. Dzięki swojej unikalnej formie maleńkich kuleczek jest najlepiej przyswajalnym tłuszczem w żywieniu [Szulc 2012]. W tłuszczu mleka identyfikuje się ponad 400 różnych kwasów tłuszczowych, fosfolipidów, pochodnych lipidowych oraz cholesterol. Jego unikatową właściwością jest zawartość zarówno krótko- jak i średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Są one źródłem łatwo dostępnej energii dla organów i mięśni, a jednocześnie nie powodują wzrostu poziomu lipidów we krwi, dzięki czemu nie stanowią ryzyka otyłości u ludzi [Czeczot i Cichosz 2008]. W żadnych badaniach epidemiologicznych nie dowiedziono szkodliwego wpływu tłuszczu mlecznego na zdrowie człowieka czy profil kwasów lipidowych we krwi [Barłowska i Litwińczuk 2009; Frelich i wsp. 2009; Szulc 2012]. Krótkołańcuchowe nasycone kwasy tłuszczowe (masłowy, propionowy, octowy, walerianowy oraz izowlerianowy) są odpowiedzialne w organizmie za syntezę cholesterolu i triglicerydów w komórkach wątroby oraz korzystnie działają na błony śluzowe układu pokarmowego. Długołańcuchowe nasycone kwasy tłuszczowe, w tym kwas palmitynowy, stanowiący do 45% sumy kwasów tłuszczowych, wchodzą w skład lipidów, fosfolipidów, lipoprotein i glikoprotein. Ich niedobór w diecie może być przyczyną przyśpieszonego rozwoju u ludzi chorób neurodegradacyjnych o podłożu 20 S tro n a

genetycznym, takich jak Parkinson czy Alzheimer oraz chorób psychicznych jak schizofrenia [Barłowska i wsp. 2006; Donovan i wsp. 2000]. Drugą grupę stanowią kwasy nienasycone, które dzielą się na: kwasy tłuszczowe jedno- i wielonienasycone. W profilu jendonienasyconych kwasów tłuszczowych dominuje kwas oleinowy omega-9 (Ω-9), który blokuje wchłanianie cholesterolu, obniża zawartość LDL w krwioobiegu, zmniejsza lepkość krwi i obniża jej ciśnienie. W tłuszczu mlecznym naturalnie występują również kwasy nienasycone w konfiguracji trans (głównie wakcenowy). Wykazuje on u ludzi właściwości przeciwmiażdżycowe i antynowotworowe, w odróżnieniu od sztucznych izomerów trans kwasów tłuszczowych, powstających w wyniku utwardzania olejów roślinnych [Czeczot i Cichosz 2008]. Do wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (WNKT) siary należy m.in. kwas linolowy omega-6 (Ω-6) i linolenowy omega-3 (Ω-3), które występują w niewielkich ilościach, ale w optymalnych proporcjach 3:1. Z kwasów tych w organizmie człowieka są syntetyzowane ich długołańcuchowe pochodne: kwas arachidonowy AA (omega-6), eikozapentaenowy EPA (omega-3) i dokozaheksanowy DHA (omega-3). Zapotrzebowanie organizmu człowieka na te związki jest niewielkie, ale pełnią one bardzo ważne funkcje biologiczne: między innymi determinują strukturę błon komórkowych i są źródłem eikozanoidów, czyli hormonów tkankowych. Te ostatnie, powstałe z kwasów omega-3, charakteryzują się działaniem przeciwzakrzepowym, przeciwzapalnym i zabezpieczają organizm przed reakcjami alergicznymi [Chilliard i wsp. 2009]. WNKT są istotnymi substancjami w procesach gospodarki lipidowej organizmu. Transportowany w lipoproteinach cholesterol (HDL, LDL) występuje w formie estru z cis wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Kwas lionolowy (omega-6) obniża zawartość LDL zdecydowanie lepiej niż kwas oleinowy, a kwas linolenowy (omega-3) jest 6-7 razy skuteczniejszy w redukcji tej frakcji cholesterolu. W organizmie człowieka kwasy tłuszczowe omega-3 i omega-6 są metabolizowane przez te same enzymy, jednak niemożliwa jest ich transformacja z omega-3 na omega-6 i odwrotnie. Nadmiar kwasu linolowego (omega-6), dostarczanego głównie przez oleje roślinne, blokuje enzymy i uniemożliwia syntezę WNKT z rodziny omega-3 (EPA, DHA). Wraz 21 S tro n a

z wiekiem obniża się w organizmie człowieka wydajność enzymów przekształcających kwasy omega [Czeczot i Cichosz 2008]. W mleku i siarze występują również związki nie będące kwasami tłuszczowymi, które zaliczane są do związków tłuszczopochodnych, takie jak np. fosfolipidy. W mleku stanowią one ok. 1% wszystkich lipidów i są składnikiem otoczek kuleczek tłuszczowych. Ich zawartość w przetworach mlecznych (np. w serach długodojrzewających) może być dużo wyższa niż w mleku. Jako główny składnik błon komórek nerwowych, komórek wątroby i śledziony oraz nerek są niezwykle ważne dla organizmu człowieka. Z uwagi na zawartość wielonienasyconych kwasów tłuszczowych oraz zdolność do wiązania kationów, fosfolipidy mają działanie antyoksydacyjne. Niektóre, jak sfingomieliny, charakteryzują się działaniem antynowotworowym. Zaburzenia w gospodarce, syntezie i dystrybucji fosfolipidów mogą być niebezpieczne i powodować choroby układu nerwowego [Czeczot i Cichosz 2008]. Mleko należy do pokarmów niskocholesterolowych. Dzięki antyoksydacyjnej ochronie przed utlenianiem składników obecnych w mleku (witaminy A, E, D, fosfolipidy, CLA, Q 10 ) nie stanowi zagrożenia dla zdrowia człowieka [Albera i Kankofer 2007]. Liczne badania (epidemiologiczne, kliniczne i eksperymentalne) wykazały, że obecność w tłuszczu mleka nasyconych kwasów tłuszczowych: mirystrynowego, laurynowego, palmitynowego czy samego cholesterolu, redukuje w wątrobie produkcję endogennego cholesterolu i frakcji LDL. W siarze występują również dwie biologicznie aktywne substancje lipidowe: skoniungowany kwas linolowy (CLA) i koenzym Q 10, czyli ubichinon. CLA jest unikalnym składnikiem tłuszczu mlecznego, powstającym dzięki specyficznej mikroflorze żwaczowej, o wysokich właściwościach antymutagennych i antynowotworowych [Chouinard i wsp. 1999; Paszczyk i wsp. 2005]. Udowodniono również, że hamuje on rozwój miażdżycy i osteoporozy. Natomiast ubichinon, występujący w mleku w niewielkich ilościach, jest również syntetyzowany przez organizm człowieka. Jednak z wiekiem wydajność procesu syntezy obniża się i dochodzi do jego niedoboru. Koenzym Q 10 pełni rolę w wytwarzaniu energii w komórkach podczas fosforylacji oksydacyjnej. Wykazuje też działanie antyoksydacyjne, co ma duże znaczenie w ochronie błon mitochondrialnych 22 S tro n a

i regeneracji witaminy E. Najbardziej wrażliwy na niedobór koenzymu Q 10 jest mięsień sercowy, którego komórki do prawidłowego funkcjonowania stale potrzebują dopływu ATP [Erdmann i wsp. 2008]. 3.1.3 Witaminy i związki mineralne w siarze O wartości odżywczej siary i mleka decyduje również obecności witamin i związków mineralnych. Ze względu na wysoką zawartość rozpuszczalnych w wodzie witamin z grupy B, rozpuszczalnych w tłuszczach witamin A, D i E oraz łatwo przyswajalnemu wapniowi mleko stanowi ważną pozycję w jadłospisie człowieka [Czeczot i Cichosz 2008; Furowicz i wsp. 1993]. Witaminy charakteryzują się właściwościami antyoksydacyjnymi, zapobiegającymi miażdżycy i powstawaniu procesów nowotworowych oraz unieczynniają wolne rodniki. Dodatkowo odgrywają ważną rolę w procesie podziału i różnicowania komórek oraz prawidłowym funkcjonowaniu narządu wzroku. Biorą udział w syntezie DNA, przemianach węglowodanów oraz wspomagają działanie układu nerwowego i krwionośnego. Zapobiegają utlenianiu LDL, kwasów tłuszczowych oraz lipidów w tkankach, co pozytywnie wpływa na błony komórkowe i reguluje procesy starzenia się organizmu (miażdżyca, choroby neurodegradacyjne Alzheimer, Parkinson) [Furowicz i wsp. 1993]. Ponadto uczestniczą w syntezie kolagenu i zapewniają ciągłość śródbłonka. Część witamin odpowiedzialna jest za prawidłową gospodarkę mineralną organizmu oraz wpływa na procesy mineralizacji kości i zębów. Witaminy pełnią również istotną funkcję w przemianach biochemicznych komórek organizmu, a jako enzymy lub grupy prostetyczne biorą udział w reakcjach enzymatycznych [Jensen i wsp. 1999; Płusa 2009]. Ich niedobór może prowadzić do zwiększenia ryzyka zawału mięśnia sercowego, udaru mózgu i choroby niedokrwiennej. U dzieci może zwiększyć prawdopodobieństwo wystąpienia krzywicy, a u dorosłych do osteomalacji lub osteoporozy. Niedobory witamin również obniżają aktywność enzymów i koenzymów w komórkach, przez co mogą prowadzić do zaburzeń na tle metabolicznym. Ponadto ich zbyt mała ilość prowadzi do zaburzeń w działaniu układu nerwowego (zapalenia nerwów, demencja), krwionośnego i pokarmowego (biegunki), nieprawidłowości w funkcjonowaniu błon śluzowych układu oddechowego i pokarmowego, zaburzeń procesu krzepnięcia krwi, zmian 23 S tro n a

skórnych oraz obniżenia odporności. Niedobór kwasu foliowego jest przyczyną zaburzeń rozwojowych płodu, takich jak niedorozwój układu nerwowego, opóźnienie syntezy DNA i podziału komórek, czy też niedokrwistości megablastycznej. Niedobór witaminy B 12 może doprowadzić do zwyrodnienia błony śluzowej żołądka, niedokrwistości złośliwej i megablastycznej, zaburzeń układu nerwowego i hiperhomocysteinemi, a tym samym nasilenia procesów miażdżycowych i zwiększenia ryzyka zawału serca [Płusa 2009]. Związki mineralne w mleku i siarze charakteryzują się wysoką przyswajalnością i odpowiednimi proporcjami. Wapń, poza zapobieganiem osteoporozie i próchnicy, wpływa pozytywnie na obniżenie ciśnienia krwi, reguluje jej krzepliwość, działa przeciwkancerogennie, stymuluje układ nerwowy, system odpornościowy oraz wydzielanie hormonów i kontroluje reakcje enzymatyczne w procesach metabolicznych. Obecność w mleku peptydów, zapobiegających wytrącaniu się wapnia, ułatwia jego przyswajanie i sprawia, że jest to najlepsze źródło tego pierwiastka w diecie. Pozostałe makro- i mikroelementy są niezbędne do prawidłowego przebiegu procesów enzymatycznych, przemiany białek, tłuszczów i węglowodanów. Duży udział pierwiastków: wapń-magnez-potas sprawia, że mleko ma właściwości zasadowe i pozytywnie wpływa na osoby cierpiące na chorobę wrzodową oraz sportowców, u których intensywny trening powoduje duże zakwaszenie organizmu [Czeczot i Cichosz 2008]. 3.2 PRZETWARZANIE I KONSERWACJA SIARY Bogactwo składników pokarmowych i substancji biologicznie aktywnych siary, a szczególnie jej białek o właściwościach obronnych dla organizmu osesków, ale też terapeutycznych i profilaktycznych dla zwierząt starszych i człowieka, skłania do badań zmierzających do opracowania sposobu jej przetworzenia i konserwacji, który pozwoliłby obniżyć poziom flory bakteryjnej, nie naruszając elementów biologicznie aktywnych. Na rynku można spotkać preparaty siarowe, których cena jest bardzo wysoka, a udział immunoglobulin i wartość biologiczna znacznie obniżona w stosunku do produktu wyjściowego. Nie ma natomiast preparatów o wydzielonych, 24 S tro n a

skoncentrowanych frakcjach siary, które w procesie pasteryzacji i utrwalania nie utraciły wartości biologicznej. Uzyskanie takich preparatów jest nowym podejściem do zagadnienia wykorzystania siary krów, pozwalającym na zachowanie jej wartości biologicznej i na wytworzenie produktów łatwych w magazynowaniu, dystrybucji i zastosowaniu. Warunki produkcyjne nie pozwalają na pozyskanie siary niezawierającej patogenów. Do najczęściej spotykanych w siarze i mleku mikroorganizmów chorobotwórczych zaliczyć można: Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leconostoc, Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, bakterie grupy coli (Esherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebisiella, Serratia) oraz patogenne: Salmonella, Campylobacter jejunii i C. coli, Streptococcus ureus [Andrzejczak i Malinowski 2010, Czerw i wsp. 2004, Drewniak i Drewniak 2007; Kubus i Kmiecik 2006]. Źródłem tych mikrobów może być zakażenie gruczołu mlekowego, niska higiena doju i urządzeń udojowych. Dlatego sposób jej pozyskiwania i postępowania po wydojeniu powinien przebiegać tak, by maksymalnie zmniejszyć jej zakażenie, zahamować, a następnie zlikwidować dalszy rozwój flory bakteryjnej, bez obniżania jej właściwości biologicznych. Do klasycznych, najczęściej stosowanych w warunkach produkcyjnych, metod konserwacji siary należy mrożenie, które jest najprostszym sposobem, nie wymagającym specjalistycznego sprzętu i dużych nakładów pracy. Jest to metoda stosowana w większości stad do tworzenia rezerwy siary (tzw. banki siary ). Mrożenie powoduje zahamowanie procesu namnażania bakterii i innych mikroorganizmów, lecz ich nie eliminuje. Może być to przyczyną zakażenia osesków, którym zostanie podana w czasie zastępowania siary matki lub wspomagania ich odporności biernej. W przypadku konserwacji większych ilości siary metoda ta wymaga urządzeń chłodniczych o dużych pojemnościach i całorocznej pracy agregatów mrożących [Holloway i wsp. 2001]. Brak możliwości przechowywania płynnej siary w temperaturze pokojowej i ograniczone możliwości konserwacji większej ilości siary przez mrożenie, skłaniają do wykorzystania procesu dehydratacji, stosując suszenie rozpyłowe lub liofilizację. 25 S tro n a

W trakcie suszenia rozpyłowego cząsteczki roztworu wirują z dużą prędkością, co ułatwia odparowanie wody i nie nagrzewa je do wysokich temperatur. Pozwala to chronić składniki wrażliwe na wysoką temperaturę przed degradacją. Mimo, iż proces suszenia odbywa się w temperaturze 140-160 O C, to cząsteczki siary podgrzewane są do temperatury 45-50 O C. Liofilizacja jest procesem wykorzystującym zjawisko sublimacji, czyli suszenia w obniżonej temperaturze i ciśnieniu (próżnia). Uniknięcie w tej metodzie suszenia działania wysokich temperatur na produkt umożliwia zachowanie jego właściwości, zwłaszcza aktywności substancji biologicznie czynnych, nieodpornych na podgrzewanie. W badaniach nad przyswajalnością mrożonej i liofilizowanej siary zaobserwowano obniżoną (nawet do 30%) przyswajalność siary mrożonej przez cielęta. Zwrócono również uwagę, że suszony tłuszcz siary może jełczeć w czasie przechowywania, dlatego zaleca się odtłuszczanie siary przed przeprowadzeniem dehydratacji. Suszenie i liofilizacja powodują tylko częściową eliminację flory bakteryjnej siary [King i wsp. 2008; Szulc i Zachwieja 1998]. Autorzy w różnych badaniach sprawdzali wpływ stosowanych w przemyśle mleczarskim metod termicznej eliminacji drobnoustrojów na jakość mikrobiologiczną siary. Jedną z nich jest pasteryzacja będąca procesem, w którym poprzez podgrzewanie produktów spożywczych następuje niszczenie lub hamowanie rozwoju flory bakteryjnej i enzymów przez nią wytwarzanych. Jej celem jest przedłużenie trwałości produktu poprzez uszkodzenie form wegetatywnych mikroorganizmów. Zabieg ten nie niszczy jednak większości przetrwalników i wirusów. Pasteryzacja nie usuwa z mleka enzymów pochodzenia bakteryjnego tzw. enterotoksyn. Enzymy te mogą uszkadzać tłuszcz oraz białko i przyczyniać się do powstania obcych zapachów i posmaków. Varnam i Sutherland [1994] stwierdzili, że w wyniku pasteryzacji następuje pogorszenia wartości biologicznej składników, spadek zawartości niektórych witamin, białek, laktozy oraz związków mineralnych. Śmietana i wsp. [2007] podają, że nawet delikatna obróbka termiczna może powodować nieodwracalne zmiany, takie jak: spadek zawartości witamin A, C, B 1, B 6, B 12, kwasu foliowego, biotyny, a w mleku sterylizowanym - kwasu pantotenowego, nikotynowego oraz ß-karotenu. Procesy termicznej konserwacji mogą być przyczyną denaturacji białka, inaktywacji enzymów, 26 S tro n a

oksydacji tłuszczów, a przy wyższej temperaturze mogą prowadzić do nieenzymatycznego brązowienia mleka [Śmietana i wsp. 2007]. W badaniach nad pasteryzacją siary, przeprowadzonych przez Goddena i wsp. [2003], procesowi poddawano partie po 57 i 95 litrów siary. Mniejsza ilość wymagała około 30 minut podgrzewania, natomiast większa od 2,5 do 3 godzin. Ustalono, że proces ten obniżył zawartość immunoglobulin klasy G odpowiednio o 23,6 i 58,5%. Po podaniu jej cielętom w pierwszej dobie życia odnotowano niższy poziom IgG w ich surowicy w porównaniu do ich poziomu w grupie kontrolnej. Meylan i wsp. [1995] w badaniach nad pasteryzacją siary w warunkach laboratoryjnych również stwierdzili obniżenie poziomu IgG w siarze, po przeprowadzonym procesie. Zaobserwowali również, że siara pasteryzowana w niewielkich ilościach po ostudzeniu gęstnieje i osiąga konsystencję puddingu, przez co nie ma możliwości podania jej cielętom. Badania te wykazały, że pasteryzacja nie jest dobrym procesem konserwacji siary i jest trudna do zastosowania w warunkach produkcyjnych. Wady termicznej obróbki siary wymuszają poszukiwanie innych metod nieangażujących wysokiej temperatury do eliminacji flory bakteryjnej. Dzięki rozwojowi nowych technik i technologii zaczęto dostosowywać procesy używane w innych gałęziach przemysłu do potrzeb przetwarzania produktów spożywczych, w tym również konserwacji żywności. Klasyczne metody obróbki termicznej można uzupełniać przez działanie promieni UV, a także nowymi technologiami, jak: pulsacyjne pola elektryczne (PEF - Pulsed Electric Field), skoncentrowane pole mikrofalowe (CMF - Content Microvawe Field), ultrafiolet czy mikroflitrację. Promienie UV powodują degradację materiału genetycznego zawartego w komórkach oraz uszkodzenie innych struktur komórkowych, w tym błon komórkowych. Uniemożliwia to podziały komórek oraz może powodować ich śmierć. Głównym czynnikiem ograniczającym jest czas prowadzenia procesu, który należy dostosować do wrażliwości substancji biologicznie czynnych na promieniowanie ultrafioletowe. Sterylizacja za pomocą promieni UV ma wiele zalet. Jedną z nich jest łatwość zastosowania oraz prostota urządzeń potrzebnych do tego procesu. Niewielki nakład pracy oraz koszt zakupu i użytkowania urządzeń może również przemawiać za zastosowaniem tej metody. Krishnamurthy [2006] stwierdził, że stosowanie UV do 27 S tro n a

sterylizacji jest tańsze w porównaniu do innych metod. Wiele przeprowadzonych do tej pory badań potwierdza te obserwacje [Choi i Nielsen 2005; Dunn 2007; Krishnamurthy 2006 ]. Taghipour [2004] donosi, że koszty mogą być nawet kilkadziesiąt razy mniejsze w porównaniu z innymi metodami pasteryzacji. Czynnikiem decydującym o stopniu bakteriobójczości jest długość fali emitowanej przez promiennik UV [Krishnamurthy 2006; Matak i wap 2004; Matak i wsp. 2007; Sarkar 2006]. W wielu badaniach dla zmniejszenia ilości bakterii stosowano promieniowanie UV o zakresie długości fali od 195 nm do 330 nm [Krishnamurthy 2006; Morgan 1989; Matak i wsp. 2004; Matak i wsp. 2007; Sarkar 2006]. Krishnamurthy [2006], Morgan [1989] i Sarkar [2006] podają, że najbardziej efektywne są długości fal w zakresie 254-264 nm. Istotnym czynnikiem jest także czas naświetlania ultrafioletem substancji sterylizowanej [Matak 2007]. Matak [2007] w czasie naświetlania trwającego 2-18 sekund mleka koziego uzyskał redukcję nawet o 5 jednostek w skali logarytmicznej Listeria monocytogenes. Matak [2004] uzyskał także redukcję o prawie 2,29 jednostki logarytmicznej Escherichia coli w mleku kozim odtłuszczonym. Podobnie jak w przypadku bakterii, stopień zmian w składzie chemicznym mleka uzależniony jest od długości fali, zastosowanego promieniowania ultrafioletowego, a także czasu naświetlania próbki [Caserio i wsp. 1978; Krishnamurthy 2006; Morgan 1989]. Naświetlanie koziego mleka w czasie 18 sekund nie powoduje dużych zmian w profilu kwasów tłuszczowych [Matak 2007], jedyną zmianą było niewielkie zaburzenie w ilości CLA w badanym mleku. Caserio i wsp. [1978] podają, że zastosowanie UV w przypadku mleka krowiego, w czasie naświetlania wynoszącym 5,5 sekundy, nie zmieniło profilu kwasów tłuszczowych, przy znaczącej redukcji flory bakteryjnej mleka. Naświetlanie za pomocą UV może prowadzić do zmian właściwości białek oraz do zmiany ich stabilności [Rhim i wsp. 1999]. Badania Kehoe i wsp. [2008] wskazują, że 24-godzinne naświetlanie ß-laktoglobuliny promieniami UV spowodowało denaturację 18% tego białka. Caserio i wsp. [1978] udowodnili, że pomimo działania UV, naświetlone mleko charakteryzowało się bardzo dobrą przydatnością technologiczną do serowarstwa, a czas tworzenia skrzepu nie wydłużył się. Przeprowadzone dotychczas badania wskazują, że naświetlanie mleka promieniami UV nie wpływa na zawartość w nim wolnych aminokwasów oraz laktozy [Caserio i wsp. 1978]. Zauważono jednak, że mleko poddane obróbce promieniami UV ma inny zapach 28 S tro n a

i smak, co związane jest z powstawaniem ozonu w trakcie działania promiennika [Krishnamurthy 2006]. W ramach badań własnych, wykonanych z Kałużnym [2010], wykonano badanie panelowe, w którym udział wzięło 40 osób w celu określenia zmian sensorycznych w poddanych naświetlaniu próbach porównywanych z próbami kontrolnymi. Różnicy nie zauważyło 7,5% badanych, 67,5% zauważyło nieznaczną różnicę, a 25% odnotowało znacząca różnice przy ocenie sensorycznej. Te same osoby uznały, że próby poddane naświetlaniu mają przyjemniejszy, swoisty dla mleka zapach (67,6% ankietowanych), można więc uznać, że zmiany takie są zależne od czasu naświetlania i długości fali światła. Inną, nietermiczną metodą nie używaną dotychczas w przetwórstwie spożywczym może być stosowanie pulsacyjnych pól elektrycznych Pulsed Electric Fields (PEF). Utrwalanie płynów przy pomocy PEF polega na oddziaływaniu impulsów o wysokim napięciu na żywność umieszczoną pomiędzy dwoma elektrodami (najkorzystniej, gdy są one zbudowanymi ze spieku węglowego). Istotą tego procesu jest zastosowanie wysokiego napięcia przez bardzo krótki czas, wyrażany najczęściej dla pojedynczego impulsu w nano- i mikrosekundach. Głównymi czynnikami utrwalającymi, zależnymi od parametrów pola elektrycznego, działającego destrukcyjnie na mikroflorę są: geometria impulsu, natężenie pola elektrycznego, czas oddziaływania PEF (liczba i szerokość impulsów) [Dutreux i wsp. 2000; Zhang i wsp. 1994]. Mechanizm inaktywacji drobnoustrojów pod wpływem PEF nie jest do końca wyjaśniony. Istnieją różne teorie próbujące wyjaśnić to zjawisko. Jedna z nich zakłada, że oddziaływanie na komórkę napięciem wyższym od jej naturalnego potencjału, wynoszącego ok. 1V, powoduje jej uszkodzenie, które może być odwracalne lub nieodwracalne (zależy to m.in. od natężenia pola elektrycznego oraz liczby i czasu trwania impulsów). Uszkodzona błona komórkowa jest w większym stopniu przepuszczalna dla małych cząsteczek, co ułatwia wyrównywanie ciśnienia osmotycznego pomiędzy środowiskiem zewnętrznym a zawartością komórki i może powodować jej pęcznienie, ewentualne zniszczenie błony komórkowej, a w konsekwencji śmierć komórki. Mechanizm ten często nazywany jest elektroporacją [Zimmerman 1986; Bryant i Wolfe 1987]. W licznych badaniach, mających na celu ustalenie czy proces ten warto wdrożyć do przetwórstwa na szeroką skalę, stwierdzono redukcję bakterii E. coli o 2,3 do 4,5 punkty w skali logarytmicznej w mleku 29 S tro n a

w zależności od zastosowanych parametrów (przy wyjściowej zawartości 6-7 punktów) [Dutreux i wsp. 2000]. Proces inaktywacji mikroflory z wykorzystaniem PEF, uzależniony jest od: pola elektrycznego: kształt impulsu, czas oddziaływania, właściwości obrabianego materiału: skład chemiczny, ph, siła jonowa, drobnoustrojów: faza wzrostu, liczba drobnoustrojów w jednostce objętości, ilość impulsów, szerokość impulsu, napięcia. Inną, nietermiczną formą obróbki siary i mleka może być zastosowanie skoncentrowanego pola mikrofalowego Concentrated Microwave Field (CMF). Zastosowanie CMF pozwala na poprawę standardu mikrobiologicznego, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej wartości biologicznej produktu. Wykorzystanie generatora skoncentrowanego pola magnetycznego pozwala na skierowanie wytworzonej wiązki mikrofal na naczynie reakcyjne. Ponadto zintegrowany, pirometryczny miernik pozwala na precyzyjne kontrolowanie przyrostu temperatury obrabianego medium. Możliwość ustalenia parametrów procesu (ilość impulsów w paczce, ilość paczek, odstępy pomiędzy impulsami i paczkami, ułamek energii maksymalnej) pozwala na precyzyjne dobranie energii dostarczonej do układu, co w pozwala na uzyskanie zadowalającego efektu końcowego [Oziembałowski i wsp. 2005]. CMF działając na białko kurze spowodowało niewielkie obniżenie tej aktywności. Zarówno PEF jak i CMF mogą być stosowane zgodnie z teorią płotków Leistnera jako techniki wspomagające konwencjonalne metody obróbki żywności. Pozwala to na utrzymanie pożądanego standardu mikrobiologicznego wraz z zachowaniem wysokich cech odżywczych i sensorycznych. Standard mikrobiologiczny siary przeznaczonej do konsumpcji, jak i do dalszego przetwórstwa, zachować można stosując techniki membranowe. Mikrofiltracja (MF) jest jedną z tych technik, do których zalicza się również odwróconą osmozę, nanofiltrację i ultrafiltrację. Wszystkie te metody mają za zadanie zagęszczenie lub 30 S tro n a

segregację roztworów. Mikrofiltracja jest najbardziej otwartym procesem z całego spektrum filtracji przeprowadzanym przy niskim ciśnieniu. Służy ona do separacji cząstek zawieszonych w roztworze, w tym bakterii, grzybów i pleśni. W przemyśle mleczarskim jest stosowana przed procesem pasteryzacji oraz niekiedy do frakcjonowania kazeiny, w celu separacji białek serwatkowych, a następnie użycia ich do produkcji serów [Bruckmaier i wsp. 2004]. Odwrócona osmoza jest procesem prowadzącym do odwodnienia substancji wyjściowej, w celu zagęszczenia roztworów o niskiej masie cząsteczkowej. Stosowana jest także w procesie oczyszczenia wody. Uzyskany permeat zawiera bardzo niskie stężenie cząstek w nim zawieszonych. To zjawisko wykorzystywane jest również do destylacji wody morskiej. Kolejnym procesem z zastosowaniem membran jest ultrafiltracja, będąca selektywnie przepuszczalnym procesem w trakcie którego stosujemy ciśnienie do 10 bar (145psi). Stosuje się ją między innymi do frakcjonowania białek mleka i serwatki oraz frakcjonowania dzielonych wcześniej grup białek. W zależności od zastosowanej membrany możemy uzyskiwać permeat o niskiej zawartości białek lub wyłącznie białka selektywnie przepuszczane przez membranę. W przypadku, gdy nie można zastosować odwróconej osmozy, ani ultrafiltracji (ze względu na bardzo mały rozmiar cząstek, które chcemy separować), można zastosować nanofiltrację. Przy tej metodzie do permeatu przechodzą tylko jony jednowartościowe i substancje organiczne o bardzo niskiej masie, takie jak alkohole [Szewczyk 1997; Bednarski 2007]. Wykorzystując ciśnieniowe techniki membranowe istnieje możliwość uzyskania pożądanego standardu mikrobiologicznego z redukcją bakterii o 99,80%. Zastosowanie łagodnej pasteryzacji podczas procesu MF pozwala na redukcję 99,99% bakterii. Proces filtracji zazwyczaj prowadzony jest w temperaturze 45-47 C. Uzyskany koncentrat zawiera białka i sole o masie cząsteczkowej poniżej 140 kd (w zależności od zastosowanej membrany), większość składników biologicznie aktywnych, przy zatrzymaniu poza koncentratem flory mikrobiologicznej. W większości dostępnej literatury badania prowadzone były na mleku odtłuszczonym [Ding i wsp. 2003; Vyas i Tong 2003], ponieważ tłuszcz w trakcie procesu zatyka oczka membrany i znacznie obniża efektywność procesu. W przemyśle mleczarskim 31 S tro n a

najczęściej używa się membran o dużo mniejszych oczkach, zastosowanych w celu separacji laktozy lub α-laktoalbuminy oraz β-laktoglobuliny jako czynników alergizujących w mleku [Patel i wsp. 1991, Lucas i wsp. 1998] lub też oddzielania kazeiny od białek serwatkowych [Al-Akoum i wsp. 2002]. Prowadzono również badania nad odzyskiwaniem z koncentratu (przez filtrację na drobnooczkowych membranach) soli mineralnych [Vyas i Tong 2003]. W dostępnym piśmiennictwie brak jest informacji o badaniach nad pozyskiwaniem i wykorzystywaniem koncentratów białkowych siary otrzymanych tymi metodami. Dlatego uznano, że uzasadnione są badania mające na celu uzyskanie takiego koncentratu, zbadanie jego składu, właściwości biologicznych i przyswajalności u osesków. 3.3 PRZYSWAJALNOŚĆ SIARY PRZEZ OSESKI Po urodzeniu oseski narażone są na kontakt ze środowiskiem pełnym patogenów. W związku z budową łożyska matki i jego przepuszczalnością (a właściwie jej brakiem), noworodki rodzą się z niewykształconym w pełni układem immunologicznym. Często, jak w przypadku osesków przeżuwaczy, odnotowuje się hypogammaglobulinemię [Quigley i wsp. 2002; Van der Perre 2003; Zarcula i wsp. 2008]. Poza właściwościami odżywczymi, pobudzającymi funkcjonowanie przewodu pokarmowego, zabezpieczenie statusu immunologicznego uznać można za główną funkcję siary. U większości noworodków ssaków przeważającą frakcją globulin zawartą w siarze są immunoglobuliny klasy G [Hurley i Theil 2011]. Poza działaniem na układ odpornościowy wykazują też miejscowe działanie antybakteryjne, zapobiegając adhezji patogenów do ścian przewodu pokarmowego. Przyswajanie immunoglobulin zachodzi na drodze pinocytozy, zarówno selektywnej jak nieselektywnej, poprzez niewykształcone ostatecznie enterocyty nabłonka jelitowego. Proces ten jest najefektywniejszy przez 3-6 godzin po przyjściu noworodka na świat [Witkowski i wsp. 2005; Zarcula i wsp. 2008]. Dlatego tak niezwykle istotnym czynnikiem, jest czas podania siary. Po 24-34 godzinach komórki nabłonka jelita są już w pełni wykształcone i przyswajanie ciał odpornościowych z siary jest bardzo obniżone [Stott i wsp. 1979; Szulc i Zachwieja 1998; Szeky i wsp. 1979; Witkowski i wsp. 2005]. Również po tym czasie zawartość trypsyny produkowanej 32 S tro n a

przez noworodka wzrasta i jej inhibitory zawarte w siarze nie są w stanie uchronić immunoglobulin przed rozkładem [Quigley 2002]. Siara zawiera również, poza immunoglobulinami, inne substancje wspomagające układ odpornościowy, takie jak lizozym, laktoferyna czy układ dopełniacza, które poza działaniem antybakteryjnym stymulują układ odpornościowy do produkcji leukocytów [Szulc i Zachwieja 1998]. Dodatkowo obecne w siarze bakterie acydofilne zasiedlają nabłonek jelita blokując adhezję bakterii E. coli do jego powierzchni. Niski poziom immunoglobulin we krwi noworodków może być spowodowany małą ich koncentracją w siarze, zbyt małą dawką podanej siary, za późnym jej podaniem lub niedoczynnością układu trawiennego oseska. Zachorowalność na choroby układu pokarmowego i oddechowego u osesków, którym nie zapewniono prawidłowego statusu immunologicznego znacząco wzrasta [Godden i wsp. 2008; Stott i wsp. 1979; Szeky i wsp. 1979]. Suplementacja noworodków preparatami zawierającymi immunoglobuliny nie zawsze przynosi oczekiwane rezultaty, bądź też koszt pozyskania dużej ilości globulin nie równoważy zysk z takiej suplementacji [Quigley 2002; Quigley i wsp. 2002; Witkowski i wsp. 2005]. Quigley [2002] zwraca uwagę, że pomimo wielu dostępnych na rynku suplementów lub produktów zastępczych dla siary, samo pojęcie takich produktów nie jest jasne i ściśle określone. Tak więc można się spotkać z preparatami, które nie zawierają odpowiedniej ilości immunoglobulin i innych składników odżywczych, zapewniających prawidłowy status immunologiczny osesków. Autorzy zwracają uwagę, że u osesków zwierząt gospodarskich, zwłaszcza u cieląt, siara matek często nie zapewnia odpowiedniego poziomu przeciwciał [Quigley 2002; Rauprich i wsp. 2000]. W takich przypadkach istotne jest podanie siary konserwowanej lub preparatu siarowego, który wpłynie na podniesienie statusu immunologicznego noworodka i zapewni jego ochronę w pierwszym okresie życia. 33 S tro n a

4. CEL BADAŃ 1. Analiza składu oraz różnych technologii pozyskiwania, kolekcjonowania i konserwacji preparatów z siary krów, pozwalających na zachowanie jej wartości biologicznej oraz wysokiego poziomu aseptyczności. 2. Opracowanie metody pozyskiwania preparatu białkowego z siary krów metodą filtracji na membranach ceramicznych, w celu pozyskania permeatu o dużym udziale immunoglobulin, wysokiej przyswajalności, wspomagającego układ odpornościowy osesków. 3. Wytworzenie preparatów siarowych przydatnych we wspomaganiu układu immunologicznego osesków. 4. Sprawdzenie na jagniętach przyswajalności siary krów i jej preparatów. 5. Ocena przyswajalności immunoglobulin z suszonych lub liofilizowanych preparatów siary krów przez cielęta w pierwszej dobie życia. 34 S tro n a

5. MATERIAŁ I METODY 5.1 SIARA Do badań wykorzystano siarę pochodzącą od 327 krów rasy polskiej holsztyńsko-fryzyjskiej odmiany czarno-białej z siedmiu stad z terenu zachodniej Polski (woj. dolnośląskie, zachodnio-pomorskie, wielkopolskie i opolskie) o zróżnicowanych systemach utrzymania i żywienia. Z badań odrzucono próby siary z widocznym zanieczyszczeniem krwią (ok. 5%). Badania składu podstawowego siary obejmowały: białko, tłuszcz, suchą masę, suchą masę beztłuszczową, liczbę komórek somatycznych (LKS) oraz pomiar gęstości i oporności prądu. Oznaczono również zawartość poszczególnych frakcji białkowych oraz udział immunoglobulin klasy G, lizozymu i laktoferyny. Siara do dalszego przetwarzania pochodziła z pierwszej doby po ocieleniu. Dodatkowo w jednym stadzie przeprowadzono badania na siarze z pierwszych 10 dojów (5 dni po porodzie), w celu ustalenia dynamiki zmian składu podstawowego, udziału frakcji białkowych i zawartości immunoglobulin. 5.2 METODY ANALIZ I OZNACZEŃ Tabela 1. Zakres analiz i metod ich wykonania Zakres analiz Skład siary i koncentratu białkowego: zawartość tłuszczu, białka ogólnego, laktozy, suchej masy, suchej masy beztłuszczowej Kwasowość czynna Kwasowość potencjalna Termostabilność Gęstość siary Metoda oznaczeń Infrared Milk Analizer 150 firmy Bentley PN-A-86002, PN-ISO 9622, PN-EN ISO, pehametr Level2 metoda Soxhleta-Henkla PN-ISO 6091:2001 próba alkoholowa PN-A-86003/A1:1998 gęstościomierz DMA 35N Density Meter PN-A-86122:1968 35 S tro n a

Poziom oporności siary Zawartość kazeiny Zawartość frakcji białkowych w siarze: albuminy surowiczej, α- kazeiny, β-kazeiny, κ-kazeiny, α- laktoalbuminy i β-laktoglobuliny Zawartość immunoglobulin klasy G w siarze, koncentracie białkowym, preparatach, surowicy cieląt i jagniąt Zawartość laktoferyny w siarze, koncentracie białkowym i preparatach Zawartość lizozymu w siarze, koncentracie białkowym i preparatach Profil kwasów tłuszczowych* Ogólna liczba bakterii Liczbę bakterii Esherichia coli oraz coliform Liczbę bakterii Listeria monocytogenes aparat Dramińskiego PN-A-86122:1968 metoda Walker a PN-68/A-86122,1985 elektroforeza pionowa na żelu akrylamidowym w obecności SDS wg metody Laemml a [1970] test immunoenzymatyczny ELISA przy użyciu zestawu kitów do oznaczania IgG firmy Bethyl test immunoenzymatyczny ELISA przy użyciu zestawu kitów do oznaczania laktoferyny firmy Bethyl test immunoenzymatyczny ELISA przy użyciu zestawu kitów do oznaczania lizozymu firmy Molecular Probes chromatografia gazowa PN-EN ISO 5509 metoda cytometrii przepływowej na aparacie Bactocount 70 firmy Bentley PN-93 A-86034/08 przy użyciu pożywek Coli ID firmy Biomerieux, wyniki zliczono przy użyciu czytnika acolyte firmy Symbiosis PN-ISO 10560 + AC1. * Profil kwasów tłuszczowych (w tym CLA c9,t11 i 10t,12c oraz EPA i DHA) oznaczono na chromatografie gazowym 7890A firmy Agilent z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym. Do rozdziału kwasów tłuszczowych użyto kolumny kapilarnej typu HP-88 (100m x 0,25 mm x 250 m). Piec chromatografu gazowego 36 S tro n a

pracował w trypie programowanej temperatury z izotermą początkową 100 C utrzymywaną przez 5 minut, po czym następował wzrost do 140 C z szybkością 4 C/min, a następnie do 240 C z szybkością 2 C/min, izoterma końcowa utrzymywana przez 5 minut. Nastrzyk wynosił 1 l w trybie podziału strumienia (split), dzielnik strumienia 20:1, temperatura dozownika 250 C. Gazem nośnym był hel. Temperatura detektora 270 C. Zastosowana metoda oznaczenia jakościowego kwasów tłuszczowych opierała się na oznaczeniu składu mieszaniny estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) uzyskanych w wyniku transestryfikacji tłuszczu wyekstrahowanego z materiału badawczego. Tłuszcz z mleka ekstrahowano metodą Folcha (chloroform i metanol w stosunku objętościowym 2:1) [Folch i wsp. 1957]. Transestryfikacja kwasów tłuszczowych prowadzona była bezpośrednio, bez wcześniejszej hydrolizy trójacylogliceroli, przy wykorzystaniu 2M metanolowego roztworu wodorotlenku potasu, zgodnie z normą PN-EN ISO 5509 Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych (metoda przeestryfikowania). Identyfikację poszczególnych estrów kwasów tłuszczowych wykonano na podstawie wzorcowych estrów: mieszanina 37 FAME Supelco TM oraz CLA c9,t11 i 10t,12c firmy Larodan wykorzystując program Agilent ChemStation. 37 S tro n a

5.3 OBRÓBKA SIARY I PRODUKCJA PREPARATÓW SIAROWYCH Pasteryzacja Ze względu na brak standardowych urządzeń do pasteryzacji siary i mleka, umożliwiających badanie niewielkich ilości substancji oraz możliwości zgromadzenia licznych zestawów do przeprowadzenia analiz różnych wariantów testu na aparaturze przemysłowej bądź półprzemysłowej, wykorzystano własną metodę przeprowadzania procesu. Siarę w szczelnie zamkniętym szklanym pojemniku, mającym zapewnić równomierne ogrzanie produktu, umieszczono w kąpieli wodnej (w łaźni z systemem mieszającym). Próby pasteryzacji siary (zarówno świeżej, jak i mrożonej) przeprowadzono w temperaturze 65, 70, 75, 80 i 90 o C w czasie 5, 10, 15 i 20 minut. W kolejnych powtórzeniach pasteryzacji siary temperaturę w przedziale od 59 do 63 o C zwiększono o 1 o C. Po przeprowadzeniu pasteryzacji w próbach analizowano zawartość ogólnej liczby bakterii oraz liczbę szczepów E. coli. Naświetlanie UV Do oznaczenia optymalnych parametrów sterylizacji promieniami UV użyto urządzenia skonstruowanego do wcześniejszych badań własnych prowadzonych razem z Kałużnym [Kałużny 2010]. Aparat składa się z lampy wyładowczej TUV 15W SLV o długości fali 253,7nm, wokół której zamontowano szklaną spiralę do przepływu siary (Rys. 1). Przy wyborze lampy kierowano się badaniami autorów [Krishnamurthy i wsp. 2006; Morgan i wsp. 2004; Sarkar i wsp. 2001], którzy podają, że najbardziej efektywne są długości fal w zakresie 254-264nm. Konstrukcja spirali umożliwiła równomierne naświetlenie badanej próbki, a różnica wysokości pomiędzy zbiornikiem a pojemnikiem odbiorczym powodowała grawitacyjne wymuszenie ruchu cieczy. Długość okresu naświetlania regulowano długością przesłony nakładanej na źródło promieniowania. Długość przesłon określono na podstawie pomiaru objętości spirali i czasu przepływu przez nią siary, przy niezmiennej wysokości zbiornika z cieczą oraz stałej długości wszystkich przewodów. 38 S tro n a

Rysunek 1. Sterylizator promieniami UV. A rurka wprowadzająca siarę; B belka montażowa; C promiennik UV; D spirala; E przesłona; F rurka wyprowadzająca; G obudowa; H włącznik Parametrem zmiennym był czas naświetlania: 3, 5, 7 i 9 sekund (Tab. 2). Po każdej przeprowadzonej próbie oznaczono całkowitą liczbę drobnoustrojów oraz skład podstawowy próbek. Sprawdzono również wpływ promieniowania UV na frakcje białka mleka przy pomocy elektroforetycznego rozkładu białek. Próby kontrolne, w celu optymalizacji przebiegu procesu, wykonano na mleku krowim, następne na wybranej partii siary. Tabela 2. Układ doświadczenia. Czas naświetlania [s] Seria 0 3 5 7 9 1 1,0 1,3 1,5 1,7 1,9 2 2,0 2,3 2,5 2,7 2,9 Numer 3 3,0 3,3 3,5 3,7 3,9 próby 4 4,0 4,4 4,5 4,7 4,9 5 5,0 5,5 5,5 5,7 5,9 39 S tro n a

Pulsacyjne Pola Elektryczne (PEF) W celu ustalenia zakresu parametrów optymalnej dla redukcji zawartości flory bakteryjnej siarę poddano działaniu pulsacyjnego pola elektrycznego z wykorzystaniem reaktora SU-1. Działanie reaktora uzależnione jest od czynników kształtowanych przez: pole elektryczne: kształt impulsu, czas oddziaływania, właściwości obrabianego materiału: skład chemiczny, ph, siła jonowa, drobnoustroje: faza wzrostu, liczba drobnoustrojów w jednostce objętości. Podczas procesu PEF stałymi parametrami były: liczba impulsów 30 i 100 oraz szerokość impulsu 90 µs, a parametrem zmiennym było napięcie 10; 20; 30 kv. Skoncentrowane Pole Mikrofalowe (CMF) Optymalizację procesu pasteryzacji siary wykonano w oparciu o stworzony model matematyczny. Dzięki licznym wariantom pozwolił on zobrazować redukcję mikroflory bakteryjnej przy zmiennych parametrach odstępu pomiędzy impulsami [ms] i czasu relaksacji układu [s] podczas niekonwencjonalnej pasteryzacji z wykorzystaniem skoncentrowanego pola mikrofalowego (CMF). Parametry wejściowe procesu obróbki siary określono na podstawie własnego planu procesu, wygenerowanego w pakiecie Statistica z pięcioma zmiennymi parametrami wejściowymi. Siarę poddawano oddziaływaniu CMF z zachowaniem odstępu pomiędzy impulsami na poziomie 0,3 0,9 sekund i odstępu pomiędzy paczkami w zakresie 10 30 sekund (Tab. 2). Stałymi parametrami procesu była liczba paczek i liczba impulsów w paczce. Dla obydwu parametrów ustalono ją na poziomie 10 sztuk, natomiast długość impulsu ustalono na stałym poziomie 90 milisekund. Do analizy wyników wykorzystano metodę powierzchni odpowiedzi (RMS) umożliwiającą wybór optymalnych parametrów procesu inaktywacji komórek bakteryjnych. Podczas procesu CMF niezmiennymi parametrami były: ilość paczek 10, ilość impulsów w paczce 10, szerokość impulsu 90 ms, moc generatora 600 W, 40 S tro n a

natomiast zmiennymi różnicującymi proces były: odstępy między paczkami 10; 20; 30 s, odstępy pomiędzy impulsami 300; 600; 900 ms. W wyniku wdrożenia procesu uzyskano wiele alternatywnych wariantów badań, które obrazuje tabela 3. Tabela 3. Alternatywne ustawienia parametrów w procesie CMF Próba Odstępy paczki [s] Ostępy pomiędzy impulsami [ms] Ilość paczek Impuls y Szerokość impulsu [ms] Moc generatora zmienna zmienna const Const const zmienna 1 10 300 10 10 90 50% 2 10 600 10 10 90 50% 3 10 900 10 10 90 50% 4 20 300 10 10 90 50% 5 20 600 10 10 90 50% 6 20 900 10 10 90 50% 7 30 300 10 10 90 50% 8 30 600 10 10 90 50% 9 30 900 10 10 90 50% 10 20 600 10 10 90 100% CMF1 10 600 10 10 90 100% CMF2 20 600 10 10 90 100% CMF3 30 600 10 10 90 100% Filtracja membranowa Do uzyskania permeatu koncentratu białek siary o zredukowanej zawartości mikroflory wykorzystano membrany ceramiczne o punkcie odcięcia 140 kd (instalacja dr Łukasza Bobaka z Wydziału Nauk o Żywności UP we Wrocławiu Rys. 2). Część filtracji wykonano na siarze pełnej, a cześć na odtłuszczonej. Każdorazowo po 41 S tro n a

wykonaniu filtracji membranę przemywano słabym roztworem zasadowym w celu zmydlenia pozostałości tłuszczu. Następnie układ płukano słabym roztworem kwasu solnego. Ostatnim etapem było płukanie ciepłą wodą minimum przez 30 minut według zasad podanych przez Kazemimoghadam i Mohammadi [2006]. Na uzyskanym koncentracie przeprowadzono badania mikrobiologiczne na obecność E. coli i L. monocytogenes metodą posiewów. Rysunek 2. Instalacja do prowadzenia ultrafiltracji (fot. własna) Membrany ceramiczne w stalowym stelażu Odbieralnik koncentratu z filtrem powietrza Suszenie rozpyłowe Suszenie rozpyłowe przeprowadzono przy użyciu suszarki rozpyłowej B-290 firmy BUCHII. 42 S tro n a

Rysunek 3. Suszarka rozpyłowa (zdjęcie pochodzi ze strony producenta) Punkt pomiaru temperatury wlotowej Punkt pomiaru temperatury wylotowej Odbieralnik Proces suszenia przeprowadzono przy początkowym ciśnieniu kompresora na poziomie 2-3 bar. Temperaturę wlotową ustawiono na 140 o C, wylotową na 80 o C. Następnie zwiększano ciśnienie do 7,5 bar. Po wykonaniu serii prób ustalono temperaturę powietrza wlotowego na 140 o C, przy temperaturze wylotowej 60 o C. Założone parametry powodowały, że suszone cząsteczki siary nie nagrzewały się do temperatury przekraczającej 40 o C, co minimalizuje możliwość uszkodzenia białka i enzymów zawartych w suszonej substancji. Z powodu dużej gęstości i lepkości siary rozcieńczano ją sterylnym roztworem fizjologicznym soli (0,9% NaCl) lub płynem Ringera (0,86 NaCl, 0,03% KCl, CaCl 2 6H 2 O), by nie zaburzyć ciśnienia osmotycznego. Rozcieńczenia wykonano w stosunku 1:1, a następnie zwiększono stosunek rozcieńczenia do 1:2, z uwagi na dużą gęstość i lepkość siary. By zapobiec degradacji białek serwatkowych w odbieralniku suszonej siary, gdzie temperatura ulegała wzrostowi w miarę trwania procesu suszenia, chłodzono go blokiem lodowym. 43 S tro n a

Liofilizacja Proces liofilizacji przeprowadzono za pomocą liofilizatora laboratoryjnego Alpha 1-4 LSC CHRIST przy ustawieniu temperatury sublimacyjnej 18 o C. Przed liofilizacją tace z siarą lub koncentratem białek oraz statyw zamrażano przez minimum 12 godzin. 5.4 BADANIA PRZYSWAJALNOŚCI IMMUNOGLOBULIN PREPARATÓW SIAROWYCH PRZEZ JAGNIĘTA I CIELĘTA. Jagnięta owcy rasy olkuskiej Materiał badawczy stanowiły 33 jagnięta owcy rasy olkuskiej urodzonych od stycznia do kwietnia 2012 roku. Jagnięta przyporządkowano do 4 grup, zależnie od kolejności urodzin. Każda grupa różniła się dodatkiem suplementującym siarę owczą: siarą bydlęcą lub koncentratem białkowym siary podawanym w pierwszym dniu po urodzeniu: I grupa kontrolna (8 jagniąt) II grupa dodatek 150 ml siary bydlęcej zawierającej 7,5g IgG (8 jagniąt) III grupa dodatek koncentratu białek siary zawierający 6 g IgG (9 jagniąt) 125 ml IV grupa dodatek koncentratu białek siary zawierający 12 g IgG (8 jagniąt) 250 ml Jagniętom podawano jednorazowo siarę bydlęcą lub koncentrat białek siary przy użyciu butelki ze smoczkiem, obliczając jego ilość na podstawie analizy składu (Tab. 4) Tabela 4. Skład siary i płynnego koncentratu białek siary (po ultrafiltracji) podawanych jagniętom Sucha Białko IgG Kazeiny Laktoza masa Wyszczególnienie % % w suchej masie % w suchej masie % w suchej masie % w suchej masie Siara 23,49 55,30 21,28 21,78 9,53 Preparat płynny po ultrafiltracji 11,78 81,25 48,16 2,49 12,13 44 S tro n a

Jagnięta pozostawały przez cały okres doświadczenia przy maciorkach. W 2., 12., 22. i 32. dobie życia z żyły szyjnej prawej pobrano krew do oznaczeń zawartości poziomu IgG w surowicy. W tych dniach dokonano również pomiaru masy ciała jagniąt. Zwierzęta podlegały stałej obserwacji zootechnicznej i opiece weterynaryjnej. Badania na cielętach W celu sprawdzenia przyswajalności immunoglobulin z koncentratu białek siary, uzyskanego w procesie ultrafiltracji, podanego dehydratacji w suszarce rozpyłowej lub liofilizatorze (Tab. 5), wykonano badania na cielętach rasy polskiej holsztyńsko-fryzyjskiej (phf) odmiany czarno-białej. Do badań wybrano 24 cielęta, które przydzielono do 3 grup. W grupie II (otrzymującej suszony koncentrat) i III (otrzymującej liofilizowany koncentrat) utworzono dwie podgrupy: Grupa I kontrolna, cielęta pojone siarą matki, Grupa II suszony koncentrat białek: A pokrywającej zapotrzebowanie cielęcia na IgG w ok. 100%, B pokrywającej zapotrzebowanie cielęcia na IgG w ok. 120%, Grupa III liofilizowany koncentrat białek: A pokrywającej zapotrzebowanie cielęcia na IgG w ok. 100%, B pokrywającej zapotrzebowanie cielęcia na IgG w ok. 120%, W ustaleniu zapotrzebowania cieląt na immunoglobuliny wykorzystano metodę oceny na podstawie ilości przestrzeni wodnej w organizmie [Szulc i Zachwieja 1998]. Przyjęto, że ilość przestrzeni wodnej w organizmie cielęcia wynosi 44%, a ilość IgG niezbędna do zapewnienia odpowiedniego statusu immunologicznego to 15 g immunoglobulin na 1l płynów. Zawartość immunoglobulin w 2. dobie życia w przeliczeniu na kilogram masy ciała obliczono dzieląc zawartość immunoglobulin znajdujących się w płynach przestrzeni wodnej przez masę urodzeniową cielęcia. Suszony i liofilizowany koncentrat siary rozpuszczano przed karmieniem w mleku krów, tak aby cielę otrzymało ilość płynów w takiej samej ilości jak w grupie kontrolnej (5 litrów). 45 S tro n a

Tabela 5. Skład siary oraz suszonego i liofilizowanego koncentratu białek siary krów (po ultrafiltracji) podawanych cielętom Sucha Białko IgG Kazeiny Laktoza masa Wyszczególnienie % % w suchej % w suchej % w suchej % w suchej masie masie masie masie Siara 23,98 58,63 23,07 24,58 9,81 Suszony i liofilizowany koncentrat 98,13 83,19 58,79 2,63 12,25 Krew z żyły szyjnej prawej pobrano od cieląt w 2., 7., 14., 21. i 28. dniu życia. Zwierzęta podlegały stałej obserwacji zootechnicznej i opiece weterynaryjnej. 46 S tro n a

6. OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA 6.1 SKŁAD ORAZ CECHY FIZYKOCHEMICZNE SIARY Wartości składu podstawowego siary (tłuszcz, laktoza, sucha masa, sucha masa beztłuszczowa, liczba komórek somatycznych) nie odbiegały od wartości podawanych przez innych autorów [Adamczak i Bednarski 2008; Szulc i Zachwieja 1998, Zachwieja 1991]. Jedynie zawartość białka i suchej masy w siarze była na nieznacznie niższym poziomie (Tab. 6, Tab. 7). Niższy poziom tych składników mógł być spowodowany dość wysoką zawartością komórek somatycznych w badanych próbach, co potwierdzają badania Zachwieji [2004], ale też wynikać z faktu, że krowy rasy phf produkuja więcej siary, co powoduje obniżanie ilości zawartych w niej składników. Sześć prób kolekcjonowanej siary z zawartością tłuszczu powyżej 10% może wskazywać na zaawansowaną ketozę u tych krów. Ustalono też, że niska zawartość tłuszczu w siarze 12 krów (poniżej 4%) łączyła się z niską zawartością białka (poniżej 9,5%). Odnotowane wartości mogą wynikać ze zmienności osobniczej lub stanu zdrowia krów. Większość prób mieściła się w zakresie odchylenia standardowego wyznaczonego dla danego parametru, co wskazuje na wysoką powtarzalność składu siary u krów. Tabela 6. Skład podstawowy siary krów rasy phf Wyszczególnienie Średnia wartość Odchylenie standardowe LKS [x1000] Tłuszcz % Białko % Sucha masa % Sucha masa beztłuszczowa % 1.830,45 6,34 13,09 23,79 17,45 sd 1.589,90 2,67 2,25 4,38 2,86 Maksymalna wartość 6.309,00 12,36 17,09 35,54 23,17 Minimalna wartość 71,00 2,48 6,87 15,30 11,81 % prób mieszczących się w przedziale ± sd 62,14 85,10 78,95 90,00 67,50 Wartości średnie dla gęstości i oporności siary (Tab. 4) nie odbiegały od wyników podawanych przez innych autorów [Batavani i wsp. 2007; Barłowska i wsp. 47 S tro n a

2005; Ilie i wsp. 2010; Ogola i wsp. 2007; Ontsouka i wsp. 2003; Zachwieja 2004]. Próby o niskiej gęstości (poniżej 1,050 g/cm 3 ) i niskiej oporności mogą wskazywać na podkliniczne stany mastitis, jednak przypadki takie stanowiły mniej niż 3% krów. Wysoka zawartość komórek somatycznych, wielokrotnie przekraczająca zawartość w mleku zdrowych krów, wynikała z naturalnego procesu przekazywania wraz z siarą limfocytów o właściwościach immunostymulujących (Szulc 2012). Uzyskane wartości wskazują, że ponad 90% krów produkowało siarę wysokiej jakości, co wskazuje, że część cieląt może mieć problemy zdrowotne, pobierając siarę niskiej jakości. Tabela 7. Właściwości fizyko-chemiczne siary krów rasy phf Wyszczególnienie ph Gęstość [g/cm 3 ] Oporność [Ω] Średnia wartość 6,35 1,058 599,348 Odchylenie standardowe sd 0,10 0,012 107,185 Maksymalna wartość 6,54 1,076 810 Minimalna wartość 6,15 1,041 380 % prób mieszczących się w przedziale ± sd 70,21 57,14 60,87 Zawartość bakterii E. coli oraz coliform w siarze (Tab. 8) wskazuje na duże zróżnicowanie w zakażeniu siary szczepami tych bakterii. We wszystkich stadach odnotowano przypadki bardzo wysokiej liczby drobnoustrojów w siarze, co może świadczyć o podklinicznym schorzeniu gruczołu mlekowego krów, być przyczyną zakażenia cieląt i obniżenia ich odporności [Garcia i wsp. 2000; Zachwieja i wsp. 2009]. Wysoka zawartość coliform w siarze może też świadczyć o niskim poziomie higieny urządzeń udojowych oraz nieprawidłowym przygotowaniu i przebiegu doju krów [Górska i wsp. 2008]. Dla porównania, dopuszczalne miano coli dla mleka surowego wynosi od 0,0001 do 0,00001, co oznacza, że w 1 ml może być od 100 do 1000 bakterii z grupy coli. Średnia wartość dla badanej siary znacząco przekroczyła te wartości. Należy też zwrócić uwagę, że część prób siary (10,5%) nie wykazywała lub cechowała się śladową ilością bakterii E. coli i coliform. 48 S tro n a

Tabela 8. Zawartość bakterii E.coli i coli form w 1 ml siary z pierwszego doju po porodzie Wyszczególnienie E.coli Coliformy Średnia wartość 284,85 68.834,00 Odchylenie standardowe sd 351,65 20.599,50 Maksymalna wartość 1.300 1.070.000 Minimalna wartość 0 40 Poziom immunoglobulin, laktoferyny i lizozymu (Tab. 9) nie odbiegał od wartości podawanych przez innych autorów i wynosił odpowiednio 43,89 g/l, 3421,08 mg/l i 867,54 mg/l [Stelwagen i wsp. 2009; Szulc i Zachwieja 1998; Ziajka 1997]. Wysoka zawartość laktoferyny może być spowodowana wysoką LKS w badanych próbach, na co wskazują wyniki badań Sarikaya i wsp. [2006]. Niski udział immunoglobulin, stwierdzony w 13 próbach siary krów, świadczył o jej niskiej jakości, co mogło być przyczyną ich problemów zdrowotnych. Potwierdza to wyniki badań wielu autorów wskazujących, że w każdym stadzie pewna grupa krów produkuje siarę o niskiej wartości immunologicznej (Zachwieja i wsp. 2007). Tabela 9. Zawartość immunoglobulin klasy G, laktoferyny i lizozymu w siarze z pierwszego doju. Wyszczególnienie IgG [g/l] Laktoferna [mg/l] Lizozym [mg/l] Średnia wartość 43,89 3421,08 867,54 Odchylenie standardowe Sd 9,78 651,03 134,52 Maksymalna wartość 79,54 6178,62 1023,41 Minimalna wartość 32,16 1900,87 432,11 Profil kwasów tłuszczowych w siarze krów, pochodzącej z pierwszego doju po porodzie, był zbliżony do wartości podawanych przez innych autorów [Anantakrishnan i wsp. 1946; Paszczyk i wsp. 2005] (Tab. 10). W odniesieniu do badań Anantakrisznana, zawartość kwasu C4:0 była niższa o 1%, natomiast zawartość C6:0 49 S tro n a

była dużo niższa i wynosiła w jego próbach 0,02% ogólnej sumy kwasów tłuszczowych. Odnotowano prawie o połowę niższą zawartość kwasu C8:0, natomiast zawartości kwasów C:10, C12:0, C16:0 i C18:0 była na zbliżonym poziomie. Nieco wyższą zawartość odnotowano w przypadku kwasu C14:0. Różnice te mogły wynikać z odmiennego profilu kwasów tłuszczowych występującego w siarze krów badanej rasy Sindhi, Gir, Tharparkar i Sahiwal. Zawartość kwasów grupy C18:1 trans pokrywała się z przedziałem podawanym przez Paszczyka i wsp. [2005]. Ponad 50% udział kwasu wakcenowego odnotowali również Wolf [1994] oraz Prechta i Molkentina [1996]. Znacznie wyższy był udział kwasu C18:2 oraz nieco wyższa zawartość CLA niż w badaniach wyżej wymienionych autorów. Zawartość kwasu C18:2 9c11t mieściła się w przedziale wartości prezentowanych przez Wolfa [1994], Prechta i Molkentina [1996] oraz Paszczyka i wsp. [2005]. Zawartość wszystkich krótkołańcuchowych (do C:10) i większości długołańcuchowych kwasów nasyconych była niższa niż podawana dla mleka [Christaki i wsp. 2012; Felkner-Późniakowska i wsp. 2012; Frelich i wsp. 2009; Lipiński i wsp. 2012]. Udział w siarze i mleku kwasów od C16:0 był zbliżony.. Natomiast zawartość większości nienasyconych kwasów tłuszczowych była wyższa w siarze, poza kwasem wakcenowym i CLA, których było nieznacznie mniej niż średnie dla mleka podawane przez wspomnianych wyżej autorów. W siarze nie oznaczono kwasu EPA, dla którego średnia wartość w mleku wynosi ok. 0,03-0,07% sumy wszystkich kwasów tłuszczowych. Stosunek jednonienasyconych kwasów tłuszczowych do nasyconych (MUFA/SFA) był korzystnie wyższy dla siary o 0,02, natomiast stosunek wielonienasyconych do nasyconych wyniósł 0,07 i był podobny do górnych wartości tego wskaźnika dla mleka. Analiza profilu kwasów tłuszczowych siary wskazuje na duże podobieństwo do kwasów tłuszczowych zawartych w mleku, przy nieco niższym udziale kwasów nasyconych. 50 S tro n a

Tabela 10. Profil kwasów tłuszczowych w siarze z pierwszego doju w porównaniu do mleka Kwas tłuszczowy Udział Średni udział w sd procentowy mleku* C4:0 1,38 0,49 2,90-3,84 C6:0 0,91 0,20 1,82-2,57 C8:0 0,52 0,11 1,09-1,98 C10:0 1,09 0,28 2,32-4,06 C12:0 1,57 0,42 2,52-4,47 C14:0 7,89 2,12 9,00-12,37 C14:1 0,70 0,24 0,27-0,35 (0,98-1,53**) C15:0 0,54 0,13 1,16-1,49 C16:0 30,64 5,01 23,46-34,96 C16:1 3,03 0,45 1,02-2,19 C17:0 0,74 0,10 0,42-0,79 C17:1 0,52 0,13 0,21-0,47 C18:0 11,34 1,85 7,24-12,88 C18:1n9t 0,40 0,10 0,27-1,43 C18:1n11t 1,08-4,29 0,90 0,21 (wakcenowy) C18:1n9c 17,21-32,01 30,15 5,07 (oleinowy) C18:1n8c 0,98-1,05 1,51 0,34 lub C18:1n11c C18:2n6c 2,76 0,49 2,11-3,61 C20:0 0,13 0,02 0,09-0,20 C18:3n3 0,41 0,09 0,37-0,40 C20:1 0,12 0,03 0,05-0,35 C18:2 9c11t 0,39-1,68 0,34 0,06 CLA C20:5n3 0,03-0,07 0,00 0,00 (EPA) suma 18:1t 0,78 0,19 - C20:4n6 0,39 0,42 0,17-0,25 SFA 56,75 4,21 58,19-77,13 MUFA 37,21 3,24 19,71-37,40 PUFA 3,90 0,81 3,16-4,60 MUFA/SFA 0,66 0,09 0,26-0,64 PUFA/SFA 0,07 0,01 0,04-0,08 * Christaki i wsp. 2012; Felkner-Poźniakowska i wsp. 2012; Frelich i wsp. 2009; Jensen 2002 **Lipiński i wsp. 2012 Analiza wydajności i składu siary krów z pierwszych 10 dojów (pierwsze 5 dni) po porodzie, utrzymywanych w tych samych warunkach w okresie okołoporodowym, 51 S tro n a

pozwala stwierdzić, że zmiany badanychwskaźników siary (Rys. 4), wynikające ze stopniowego przejścia z wydzielania siary w mleko, co jest zgodne z badaniami innych autorów [Szulc i Zachwieja 1998, Ziajka 2008, Ostersen i wsp. 1997, Heck i wsp. 2008]. Należy zauważyć znacznie mniejszą zmienność badanych parametrów w pierwszym doju w odniesieniu do wyników badań siary krów w wielu stadach (Tab. 6 i 10). Wskazuje to na wpływ stada na zmienność składu siary [Zachwieja 2004]. Rysunek 4. Wydajność i skład siary krów w dziesięciu kolejnych dojach po porodzie Wydajność i skład siary krów w kolejnych dojach po porodzie wskazuje na wielkość potencjału immunoglobulin produkowanych w tym czasie przez krowy, który wykorzystywany jest tylko w części w karmieniu ich cieląt. Obniżenie zawartości białka, tłuszczu i suchej masy oraz zwiększanie ilości laktozy w siarze w kolejnych dojach wynika z fizjologii procesu laktacji [Szulc i Zachwieja 1998; Ziajka 1997]. Wydajność siary systematycznie wzrastała z ponad 7 l w pierwszych dwóch dojach do 13,2 l w 10-tym doju. W tym czasie zawartość laktozy wzrosła do około 4%, co nadal jest wartością niższą niż w mleku w czasie późniejszej laktacji, kiedy wynosi 4,6-4,8%. Znaczne zmiany odnotowano w poziomie białka, którego zawartość obniżała się w pierwszych 5 dojach od prawie 16% do około 5% i pozostawał na tym poziomie w następnych dojach, przy odchyleniach standardowych dla każdego pomiaru wynoszących ok. 10%. Podobną tendencją charakteryzowały się zmiany zawartości suchej masy (obniżenie z 23,82 do 14,21%), jednak odchylenia dla tego parametru w odniesieniu do wartości średniej sięgały 20%. Zawartość tłuszczu obniżyła się z 5,6% 52 S tro n a

w pierwszym doju do 3,25% w trzecim doju a następnie wzrosła do ok. 5% w kolejnych dniach i utrzymywała się na tym poziomie. Zmiany frakcji białkowych, w tym α-, β- i κ-kazeiny, α-laktoalbuminy oraz albuminy surowiczej, a także immunoglobulin (Tab. 11 i Rys. 5), wykazywały tendencję wskazywane przez innych autorów. Poziom tych białek może świadczyć o zdrowiu gruczołu mlekowego krów [Batavani i wsp. 2007; Urech i wsp. 1999]. Rozkład proporcjonalny tych biologicznie czynnych białek zdaniem Garry i wsp. [1996] wpływa na przyswajalności IgG przez cielęta[]. Notowane zmiany udziału kazein i ich proporcje do albumin, wynikają ze stopniowego przejścia z wydzielania siary w wydzielanie mleka. Poziom globulin obniżał się wraz z kolejnymi dojami od 36,52% białka całkowitego w pierwszym do 11% w 10. doju, przy czym znaczny spadek odnotowano w ostatnich pomiarach. Udział α-kazeiny w stosunku do innych białek zwiększał się systematycznie w kolejnych dojach z 28,88% do 44,76% i wykazywał niewielką zmienność w poszczególnych pomiarach. Udział pozostałych frakcji nieznacznie wzrósł, w tym największym wzrostem charakteryzowała się α-laktoalbumina (o 3,09%), a najmniejszym β-kazeina (2,05%). Natomiast zmiany w obrębie κ-kazeiny cechowały się największą dynamiką do 5. doju obniżając się do 3,67%, a następnie zwiększając się do 5,9% w doju 10. Rysunek 5. Zmiany zawartości frakcji białkowych w kolejnych dojach 53 S tro n a

Tabela 11. Skład podstawowy i udział frakcji białkowych w siarze z pierwszych 10 dojów Skład % w białku ogólnym Dój 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Wydajność 7,36 6,82 10,45 11,27 13,00 13,00 14,18 13,09 13,15 13,20 Tłuszcz 5,60 3,90 3,25 3,72 4,91 4,88 5,08 5,01 5,25 4,98 sd 0,97 0,72 0,64 0,64 0,58 0,67 0,62 0,55 0,41 0,58 Białko 15,94 11,35 7,80 6,90 4,80 4,48 4,31 4,20 5,25 4,82 sd 2,01 1,34 1,82 0,97 0,54 0,71 0,42 0,55 0,31 0,71 Laktoza 2,28 3,04 3,76 4,10 4,20 4,25 4,27 4,28 4,03 3,96 sd 0,22 0,43 0,39 0,64 0,31 0,57 0,31 0,27 0,32 0,35 Sucha masa 23,82 19,01 15,10 15,07 14,36 14,10 14,12 13,95 15,01 14,21 sd 4,25 3,87 4,12 3,54 3,41 3,48 3,12 3,08 4,00 3,18 IgG 36,52 35,43 28,64 23,67 20,85 20,78 18,65 20,74 15,03 11,00 sd 5,72 5,61 4,98 3,02 4,06 3,87 3,68 3,69 3,45 3,72 Serum albumina 6,52 6,76 6,15 6,48 7,76 9,19 8,27 8,25 9,35 8,89 sd 1,23 1,07 1,63 1,53 1,78 2,01 1,98 1,65 2,03 1,06 α-kazeina 28,88 27,68 31,65 34,12 38,76 37,99 35,50 37,49 39,51 44,76 sd 3,21 3,02 3,41 3,56 3,74 3,62 3,45 3,88 3,71 4,59 β-kazeina 9,62 10,67 8,85 10,32 10,95 10,57 11,49 10,68 12,02 11,67 sd 1,78 1,62 2,04 1,94 1,99 2,00 1,69 1,67 2,43 2,09 κ-kazeina 11,27 11,06 9,35 9,64 7,60 14,31 12,27 12,86 12,75 13,51 sd 2,08 2,13 1,87 1,77 2,45 2,67 2,05 2,16 2,01 2,00 α-laktoalbumina 5,93 5,80 7,20 7,40 7,74 8,40 8,33 8,77 8,72 9,02 sd 0,97 0,89 1,23 1,13 1,47 1,15 1,78 1,64 1,57 2,03 54 S t r o n a

6.2 REDUKCJA FLORY BAKTERYJNEJ W SIARZE 6.2.1 Klasyczna pasteryzacja siary Mleko pasteryzowane metodą klasyczną w przemyśle spożywczym poddawane jest działaniu temperatury od 72 C przez 15 sekund do 90 C przez kilka sekund, natomiast sterylizowane metodą UHT w temperaturze 135-150 C przez kilka sekund. W mleku pasteryzowanym mogą pozostawać przeżywające ten proces bakterie [Łobacz i wsp. 2008; Ziajka 2008]. Trwałość oraz jakość mleka uzyskana na drodze pasteryzacji zależy od jakości surowca użytego do tego procesu oraz od stopnia wtórnego zanieczyszczenia mleka pasteryzowanego. Tabela 12. Zawartość komórek bakteryjnych w zależności od temperatury i czasu trwania pasteryzacji siary Temperatura Czas przeprowadzania pasteryzacji 5 min 10 min 15min 20 min 65 101000 97000 96000* - 70 101000 89000 - - 75 98000 - - - 80 - - - - 90 - - - - * w części próbek doszło do powstania skrzepu Próba kontrolna 102000 Pasteryzacja siary w temperaturze od 65 do 90 o C przez 5 do 20 minut powodowała zbyt niską redukcję flory bakteryjnej przy niskich temperaturach i krótkim czasie podgrzewania produktu (Tab. 12). Natomiast podwyższenie temperatury i/lub wydłużenie czasu pasteryzacji skutkowało koagulacją białek, a w efekcie tworzeniem się skrzepu i znacznym zagęszczeniem badanej próby. Uzyskane wyniki potwierdzają badania Meylanda i wsp. [1995], którzy zaobserwowali, że pasteryzowana w niewielkich ilościach siara, po ostudzeniu gęstnieje i osiąga konsystencję puddingu, przez co nie ma możliwości podania jej cielęciu. Stwierdzili również, iż w pasteryzowanej siarze nastąpiło znaczne obniżenie poziomu IgG. Godden i wsp. [2003], mimo używania pojemników do pasteryzacji o znacznej pojemności (57 i 95 l), stwierdzili, że proces ten spowodował obniżenie zawartość immunoglobulin klasy G odpowiednio o 23,6 i 58,5% oraz obniżył się poziom IgG w surowicy krwi karmionych nią cieląt. Wyniki badań własnych zdecydowały również o wykluczeniu tej metody 55 S t r o n a

z dalszych procesów badawczych i technologicznych jako nieefektywnej oraz obniżającej jakość biologiczną surowca wyjściowego. Aby pozbyć się całkowicie komórek bakteryjnych, siara musiała być podgrzewana przez co najmniej 10 minut w temperaturze 75 o C, co według badań Goddena i wsp. [2003] spowodowałoby znaczne straty wartości immunologicznej. 6.2.2 Naświetlanie promieniami UV Nie uzyskano statystycznego potwierdzenia redukcji mikroflory w badanych próbach (Tab. 13, Rys. 6), chociaż jej zawartość w kolejnych pomiarach systematycznie obniżała się. W przypadku najdłuższego czasu naświetlania (9 sekund) nastąpiło obniżenie poziomu mikroflory o 24%. Niektórzy autorzy podają, że przy naświetlaniu mleka przez czas krótszy niż 20 s można osiągnąć redukcję poszczególnych szczepów chorobotwórczych nawet o kilka jednostek w skali logarytmicznej [Matak i wsp. 2001]. Rysunek 6. Ogólna liczba drobnoustrojów w zależności od czasu naświetlania W pierwszej, drugiej i czwartej próbie nastąpił nieoczekiwany wzrost zawartości bakterii, natomiast w pozostałych próbach wyraźny spadek. Przyczyna niskiej redukcji mogła wynikać z fakty, że promienie UV działały na mleko przez rurki szklane przez które przepływały, ale też być efektem metody detekcji komórek bakteryjnych w cytometrii przepływowej, która została wykorzystano w tym badaniu, dając wynik pozytywny również dla części uszkodzonych komórek. 56 S t r o n a

Niewielki spadek zawartości bakterii w mleku przy badanych parametrach wskazuje, że promienie ultrafioletowe nie mogą być alternatywą dla innych metod likwidacji mikroflory, a wydłużenie czasu naświetlania może pogorszyć jakość siary i mleka. Naświetlanie nie wpłynęło negatywnie na zawartość białka w badanych próbach (Tabela 14). Odnotowano nieznaczny spadek poszczególnych frakcji białkowych, jednak wyniki te nie znalazły statystycznego potwierdzenia (Tab. 15). Tabela 13. Ogólna liczba bakterii w mleku [tysiące / ml], w zależności od czasu naświetlania. Próba Czas naświetlania [sekundy] Wyszczególnienie Kontrolna 3 5 7 9 1 39 46 52 52 58 2 38 43 47 45 44 Ogólna liczba bakterii w 1 3 101 101 77 70 92 ml próby 4 75 82 91 65 87 [x1000] 5 139 110 91 116 17 średnie 78,4 76,4 71,6 69,6 59,6 Uzyskane wyniki potwierdzają między innymi badania Kehoe i wsp. [2000] oraz Caserio i wsp. [1978], którzy stwierdzili, że proces naświetlania promieniami UV nie obniżnył zawartości frakcji kazein, co nie obniżyło przydatności technologicznej mleka do serowarstwa. Tabela 14. Wpływ czasu naswietlania mleka na zawartość białka w badanej próbie. Wyszczególnienie Zawartość białka w próbie [%] Nr serii Czas naświetlania [sekundy] 0 3 5 7 9 1 3,28 3,34 3,34 3,35 3,33 2 3,32 3,35 3,35 3,34 3,33 3 3,33 3,34 3,33 3,35 3,32 4 3,32 3,37 3,37 3,36 3,36 5 3,32 3,32 3,31 3,30 3,30 średnie 3,31 3,34 3,34 3,34 3,33 57 S t r o n a

Panelowa ocena sensoryczna mleka po działaniu promieni UV wykazała, że 7,5% badanych nie zauważyło różnic, 67,5% zauważyło nieznaczną różnicę, a 25% odnotowało znacząca różnice przy ocenie sensorycznej (Tab. 16). Nie potwierdzają tego badania Matak [2001], które wskazują na zmianę zapachu mleka poddawanego naświetlaniom promieniami UV. Tabela 15. Wpływ promieniowania UV na zawartość [%] frakcji białkowych w mleku badanych prób Czas naświetlania [sekundy] Wyszczególnienie Frakcja białka 0 3 5 7 9 Średnia zawartość poszczególnych frakcji białka [%] Immunoglobuliny G 0,60 0,61 0,65 0,68 0,67 Albumina surowicy 0,71 0,66 0,54 0,55 0,62 α-kazeina 0,62 0,64 0,73 0,75 0,79 ß-kazeina 0,55 0,53 0,53 0,50 0,47 κ-kazeina 0,67 0,63 0,66 0,57 0,54 Inne frakcje 0,18 0,25 0,23 0,29 0,25 Tabela 16. Stopień różnic w zapachu pomiędzy mlekiem nienaświetlanym, a naświetlanym, według ankietowanych. Wyszczególnienie Liczba osób Udział procentowy Brak różnic 3 7,5 Różnice są niewielkie 27 67,5 Różnice są znaczące 10 25 Łączna liczba ankietowanych 40 100 6.2.3 Zastosowanie skoncentrowanego pola mikrofalowego (CMF) oraz pulsacyjnych pól elektrycznych (PEF) w likwidacji flory bakteryjnej Stwierdzono, że zastosowanie skoncentrowanego pola mikrofalowego (CMF) przez dostarczenie do układu 4,8 kj energii oraz przy wzroście temperatury średnio o 14,1±0,3 C następowała redukcja flory bakteryjnej w siarze o ok. 30%. Natomiast 58 S t r o n a

zastosowanie pulsacyjnego pola elektrycznego (PEF) spowodowało jej redukcję o 50% (Rys. 6 i 7). Równie znaczącą redukcję mikroflory; o ponad 6 jednostek w skali logarytmicznej, w odniesieniu do E. coli i prawie o 4 jednostki w odniesieniu do L. innocua, odnotowali Dutreux i wsp. [2000] stosując parametry PEF niezmieniające temperatury badanej substancji. Dodatkowo zaznaczyli, że w przypadku oddziaływania PEF na próby o znacznej zawartości E. coli i zastosowaniu ponad 35 impulsów nastąpiła prawie 100% inaktywacja komórek bakteryjnych. Zaobserwowali również w badaniach mikroskopowych, że powierzchnie komórek bakteryjnych poddanych działaniom pola elektrycznego były poprzerywane i pomarszczone, co spowodowało wyciek soków komórkowych do środowiska zewnętrznego. Jednak, jak zaznacza Vega- Mercado i wsp. [1997], mechanizm powstawania porów w błonach komórek bakteryjnych, na skutek działania PEF, nie jest jeszcze poznany. Można jedynie przypuszczać, że powoduje ono destabilizację zewnętrznych struktur komórki oraz dezaktywację działania enzymów [Góngora-Nieto i wsp. 2001]. Zhao i wsp. [2008] zauważył, że długotrwałe oddziaływanie PEF na enzymy (m.in. lizozym) może powodować ich dezaktywację, jeśli ich koncentracja w roztworze jest niska. W badaniach własnych nie stwierdzono obniżenia poziomu substancji biologicznie aktywnych po zastosowaniu pola elektrycznego, przyjmując wartość siary nieprzetworzonej jako 100% (Tab. 17). Tabela 17. Zmiany zawartość składników biologiczny w siarze po zastosowaniu PEF Zawartość po PEF sd Białko 99,86 0,01 IgG 99,78 0,06 Lizozym 99,98 0,00 Laktoferyna 99,85 0,02 Badania siary z zastosowaniem pulsacyjnego pola elektrycznego (PEF) wykazały, że optymalnym parametrem procesu jest 100 impulsów z napięciem na poziomie 30kV. Impulsy PEF miały szerokość 90µs, a odstępy pomiędzy impulsami 900ms. Zastosowane parametry umożliwiły redukcję mikroflory o 50%. Zastosowanie przemienne obu tych technik, bez względu na kolejność realizacji, umożliwiło obniżenie poziomu mikrobiologicznego siary o ok. 65%. 59 S t r o n a

Na podstawie uzyskanych wyników wybrano ostateczne parametry obróbki siary przy produkcji preparatów: 1) CMF 10 paczek, 10 impulsów w paczce o szerokości impulsu 90ms i mocy reaktora 600 W, co odpowiadało dostarczeniu do układu 4,8 kj energii (Rys. 7), 2) PEF natężenie 100 impulsów przy napięciu 30 kv o szerokości impulsów 90µs, odstępy pomiędzy paczkami wynosiły 30 s, a pomiędzy impulsami 900 ms (Tab. 8, Rys. 8). Rysunek 7. Wykres RSM procesu wykorzystania CMF uwzględniający odstęp pomiędzy paczkami oraz odstęp pomiędzy impulsami w paczce. Stopień redukcji mikroflory podczas obróbki CMF 900 0,25 0,32 0,48 ODSTĘPY POMIĘDZY IMPULSAMI [us] 800 700 600 500 400 300 0,14 0,26 0,40 0,08 0,26 0,39 10 15 20 25 30 ODSTĘPY POMIĘDZY PACZKAMI [s] > 0,5 < 0,475 < 0,375 < 0,275 < 0,175 < 0,075 We wstępnych próbach badaniu poddano też mleko zaszczepione szczepem z rodzaju Bacillus. Po procesie elektropasteryzacji PEF i CMF uzyskano redukcję tych drobnoustrojów o 99,996%. Uwzględniając wyniki tych badań w trakcie produkcji preparatów siarowych podjęto decyzję o zastosowaniu elektorpasteryzatora. Pozwoliło to na otrzymanie preparatów o zredukowanej florze bakteryjnej do poziomu ok. 35% w stosunku do surowca wyjściowego. Uwzględniając fakt, że preparat siarowy pochodził z ultrafiltracji, w wyniku której następowała prawie całkowita redukcja flory 60 S t r o n a

bakteryjnej, to po poddaniu go procesom PEF i CMF otrzymywano prawie sterylny preparat. Samodzielne zastosowanie procesu PEF w badaniach własnych nie wpłynęło na zawartość białka w badanej siarze, natomiast nastąpiła redukcja flory mikrobakteryjnej od 11% do 28% w stosunku do próby kontrolnej (Tab. 18, Rys. 8). Próby przy zastosowaniu 30 impulsów wykazały najmniejszą (11%) redukcję mikroflory. Przy zastosowaniu 100 impulsów i napięcia 30 kv różnica ta wyniosła o jedną jednostkę w skali logarytmicznej mniej w stosunku do zawartości wyjściowej (ponad 28%) (Rys. 8, Tab. 18). W przypadku zastosowania CMF z użyciem różnych wartości zmiennych różnicujących odnotowano spadek liczby drobnoustrojów o 50% w porównaniu z próbą kontrolną. Tabela 18. Zawartość bakterii w siarze w zależności od parametrów PEF Napięcie Ilość impulsów Próba kontrolna 30 100 10 kv 330000-436000 20 kv 349000-30 kv 388000 312000 Rysunek 8. Stopnień redukcji liczby drobnoustrojów w preparatach siary po obróbce PEF. Log Zawartość bakterii 61 S t r o n a