Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Wprowadzenie do hodowli in vitro dowolnej rośliny WSTĘP Metoda kultury in vitro, tzn. uprawy w szkle, jest to specyficzny sposób uprawy materiału biologicznego w warunkach sterylnych. Symuluje on warunki środowiska naturalnego, umożliwia dzielenie się komórek lub sprzyja różnicowaniu np. tworzeniu tkanek, organów czy wreszcie powstawaniu całych roślin. Na końcowy efekt kultury in vitro mają wpływ 3 grupy czynników: a) właściwości biochemiczno fizjologiczne i genetyczne uprawianego materiału roślinnego, b) substancje odżywcze i stymulatory wzrostu zawarte w podłożu oraz jego właściwości fizyczne, c) warunki zewnętrzne panujące w pomieszczeniu (naczyniu), w którym prowadzi się kulturę (temperatura, wilgotność, oświetlenie). W kulturach roślinnych wykorzystuje się morfogenetyczny potencjał komórek roślinnych związany z występującym powszechnie w świecie roślinnym zjawiskiem totipotencji. Główne sukcesy osiągnięte dzięki metodzie in vitro oparte są na nieograniczonych zdolnościach komórek roślinnych do dzielenia się i odtwarzania całego organizmu czyli totipotencji. Teoretycznie każda komórka roślinna zachowuje zdolność do ekspresji całego swojego potencjału genetycznego. Komórki w których zachodzi zjawisko totipotencji są to tzw. komórki kompetentne. Do czynników wyzwalających totipotencję należą pożywki bogate w składniki odżywcze i substancje wzrostowe np. płynne bielmo (mleczko kokosowe, mleczko kukurydziane), które jest naturalnym środowiskiem dla komórek, podobnym do tego, w jakim rozwija się zygota w woreczku zalążkowym. Naturalne składniki roślinne mogą być zastąpione złożoną pożywką syntetyczną, w której ważnym jest dobór i wzajemny stosunek substancji wzrostowych.
Warunki wzrostu roślinnych kultur tkankowych. Tempo wzrostu i podziałów komórek roślinnych jest kilkakrotnie niższe niż tempo namnażania się komórek bakterii czy grzybów. Konsekwencją jest szybkie przerośnięcie kultur roślinnych rosnących na pożywce agarowej zawierającej organiczne źródło węgla przez mikroorganizmy. Roślinne kultury in vitro muszą więc być kulturami sterylnymi axenic culture. Axenic wolne od mikroorganizmów, xenos (gr.) życie. Etapy sterylizacji tkanki roślinnej: 1) mycie detergentem, 2) dokładne płukanie wodą destylowaną, 3) odkażanie 50 70% etanolem, 4) zwilżanie środkiem obniżającym napięcie powierzchniowe, np. Tween, 5) sterylizacja podchlorynem wapnia (sodu, potasu 3% - 14%), środki komercyjne (Chlorox, Ace), 6) 3-krotne opłukanie sterylną wodą. Istotnym problemem w hodowli in vitro jest zachowanie sterylności kultur w trakcie ich wzrostu. Wymaga to szczególnej staranności i ostrożności podczas wprowadzenia i utrzymywania kultur. Roślinne kultury tkankowe prowadzi się w specjalnie przygotowanych pomieszczeniach lub kamerach. Fitotron to pomieszczenie w którym regulowane jest naświetlenie (długość dnia, intensywność naświetlania, rodzaj stosowanego światła), temperatura i wilgotność. Długość dnia (fotoperiod) wynosi zazwyczaj 16 godzin. Skład i przygotowanie pożywek do roślinnych kultur tkankowych. Pożywka ma do spełnienia następujące zadania: 1. Dostarcza eksplantowi wodę, niezbędne do życia związki i sole mineralne. 2. Stanowi źródło węgla i innych substancji, których komórki nie mogą samodzielnie wytworzyć. 3. Stanowi środowisko fizyko-chemiczne właściwe dla rozwoju eksplantu. 4. Wykazuje zdolność buforową w celu utrzymania właściwego ph. 5. Wykazuje zdolność do pochłaniania szkodliwych produktów przemiany materii wydzielanych przez eksplant. Pożywki różnią się zawartością substancji odżywczych: makro- i mikroelementów, witamin, węglowodanów i stymulatorów wzrostu. Najczęściej obecnie stosowaną w roślinnych kulturach pożywką jest Murashige i Skoog (MS).
Grupy związków chemicznych wchodzących w skład pożywek: 1) woda, 2) makroelementy: N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, 3) mikroelementy (zw. nieorganiczne): Cl, B, Mn, Zn, Mo, Co, Cu, 4) źródło węgla (organiczny składnik pożywki, najczęściej sacharoza), 5) witaminy: mezo-inozytol, thiamina, kwas nikotynowy, pirydoksyna, 6) aminokwasy: glicyna, arginina, glutamina, kwas glutaminowy, prolina, asparagina, 7) hormony roślinne lub syntetyczne regulatory wzrostu, 8) składniki organiczne: ekstrakt drożdżowy, mleko kokosowe, pulpa bananowa, soki owocowe i warzywne, 9) substancje zestalające: agar, phytogel. Sporządzanie pożywek. 1. Przygotowanie tzw. stock solution makro- i mikroelementów. 2. Dodanie ich do 400 ml sterylnej wody destylowanej. 3. Dodanie sacharozy i dokładne wymieszanie pożywki. 4. Uzupełnienie wody do 900 ml. 5. Doprowadzenie ph do 5,8. 6. Dodanie agaru (0,7%), jednocześnie podgrzewając i mieszając pożywkę. 7. Uzupełnienie wody do 1000 ml. 8. Autoklawowanie. 9. Dodanie wysterylizowanych przez sączenie na filtrach roztworów witamin i regulatorów wzrostu. Zastosowanie roślinnych kultur tkankowych prowadzonych in vitro: 1. Badania podstawowe proste modele do badania zjawisk biologicznych: - studia na zawiesinach komórkowych, - badanie procesów podziałowych w komórkach roślinnych, - badania prowadzone na kalusie, - badania interakcji komórka roślinna komórka patogena 2. Mikrorozmnażanie roślin. 3. Uwalnianie roślin od patogenów. 4. Produkcja nowych odmian. 5. Pozyskiwanie farmakologiczne czynnych metabolitów wtórnych. 6. Uzyskiwanie nowych odmian w wyniku wprowadzenia obcego DNA do genomu komórki roślinnej. 7. Wytwarzanie nasion syntetycznych. 8. Przechowywanie i gromadzenie zasobów genowych. Część praktyczna. Materiał roślinny: nasiona dowolnej rośliny Materiały nie sterylizowane: słoik z wodą destylowaną,
słoik z 10% roztworem płynu Ludwik, słoik z 70% EtOH, pensety, bibuła Whatmann nr 1, parafilm, minutnik, rękawiczki jednorazowe, zszywacz, ołówek, gumka, pisaki do szkła. Materiały sterylne: słoiki typu Twist z podłożem MS, słoik z 3% i 9% Ca(OCl) 2 do sterylizacji nasion, płytki Petriego o średnicy 8 cm 2 szt, pensety długie i krótkie, słoiki z wodą destylowaną do płukania nasion. Sprzęt: komora laminarna palnik Wykonanie ćwiczenia. Celem niniejszego ćwiczenia jest założenie hodowli in vitro z nasion dowolnie wybranej rośliny. W tym celu należy: 1. Przygotować pakieciki z bibuły Whatmann nr1 wielkości 6cm/4cm wg schematu podanego przez Prowadzącego zajęcia i napełnić je nasionami dowolnej rośliny. 2. Umieścić pakieciki w słoiku z 10% roztworem Ludwika na ½ godziny, w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego nasion. 3. Po upływie ½ godziny przełożyć pakieciki do słoika z wodą destylowaną na około 20 minut. UWAGA: Odtąd wszystkie czynności należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. 4. Następnie umieścić pakieciki w słoiku z 70% EtOH na 2-5 sekund. 5. Za pomocą sterylnej pensety, dobrze opalonej w płomieniu palnika, umieścić nasiona w słoiku z 3% lub 9% roztworem podchlorynu wapnia, w celu wysterylizowania nasion. Stężenie środka sterylizującego jak również czas sterylizacji nasion ustala Prowadzący w zależności od rodzaju użytych nasion. Czas trwania sterylizacji nasion wynosił będzie odpowiednio: 7.5 minuty, 12 minut, 15 minut, 20 minut i 30 minut. 6. Po każdym czasie sterylizacji nasiona należy 3-krotnie wypłukać wodą destylowaną przez następujący okres czasu: pierwsze płukanie 5 minut, drugie płukanie 5 minut, trzecie płukanie 15-30 minut.
7. Wysterylizowane nasiona przełożyć do słoików z pożywką MS, zakleić słoiki parafilmem i umieścić w fitotronie. Czas kiełkowania nasion wynosi około 6 tygodni. W tym czasie usuwać sterylnie rośliny gorzej rosnące, czy zaatakowane przez mikroorganizmy. Przygotowanie sprawozdania. 1. Opisz przebieg ćwiczenia. 2. Podaj znane Ci sposoby sterylizacji materiału roślinnego, pożywek, sprzętu laboratoryjnego. 3. Jakie znasz metody uwalniania roślin od patogenów. 4. W jaki sposób najłatwiej zainicjować kulturę kalusa w warunkach in vitro? 5. Podaj skład pożywek do roślinnych kultur in vitro. Wyjaśnij rolę żelaza, podaj jaki składnik pożywki jest źródłem węgla, a także wyjaśnij rolę makroi mikroelementów dla wzrostu roślinnych hodowli tkankowych. Przy opracowaniu sprawozdania jak i w celu przygotowania do zajęć obowiązuje również materiał z wykładów. Literatura: 1. S. Malepszy. Biotechnologia roślin. PWN 2004. 2. Wprowadzenie do biotechnologii w genetyce i hodowli roślin. Praca Zbiorowa pod kierownictwem S. Malepszego, Wydawnictwo SGGW-AR, Warszawa 1990.