Ill PL9801007 BADANIE ODDZIAŁYWAŃ DIPOLOWO DIPOLOWYCH POMIĘDZY ŻELAZEM A ZNACZNIKIEM SPINOWYM W CYTOCHROMIE C METODĄ SR EPR W. BUCHARSKI, W. FRONCISZ, A. KOSTRZEWA, A. OSYCZKA, B. TURYNA Instytut Biologii Molekularnej Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków Znakowanie spinowe cytochromu c Otrzymywanie monopochodnych cytochromu c modyfikowanych znacznikiem spinowym na eaminowych resztach grup lizynowych przeprowadzone było w dwóch etapach. Pierwszym z nich była preparatyka, a drugim analiza otrzymanych pochodnych w celu dokładnego stwierdzenia sposobu i wydajności modyfikacji. Preparatyka Pierwszym etapem było przeprowadzenie reakcji cytochromu ze znacznikiem spinowym (rys. 1). Cytochrom c rozpuszczony został w buforze fosforanowosodowym o ph=5, zaś znacznik w acetonitrylu. Mieszanina reakcyjna była sporządzona w ten sposób, aby roztwór zawierał cytochrom i znacznik w stosunku molowym 1:1. Najbardziej prawdopodobne jest wtedy uzyskanie pochodnych cytochromu znakowanych na jedne Iizynie (monopochodnych). Reakcja, prowadzona była przez 1 do 2 godzin. cytclysnhj + f"\ Y ] ^ / \ H i N Lys cytc rys. 1. Reakcja cytochromu c ze znacznikiem spinowym charakterystycznym na reszty lizynowc (Dursztynyloimidylo 2,2,5,5 telramclylo 3 pyrolino 3 karbolciy 10 N oksyl). Następnym etapem był wstępny rozdział mieszaniny reakcyjnej metodą FPLC, na kolumnie Mono S. Kolejną czynnością był już zasadniczy rozdział otrzymanych frakcji metodą chromatografii jonowymiennej (HPLC), na kolumnie CM300 (obie w/w kolumny są kolumnami kationitowymi). Każdą frakcję trawiono trypsyną (TPCK trypsyna), po czym poszczególne peptydy uzyskane po przetrawieniu frakcji były rozdzielane metodą RPHPLC, na kolumnie BondapakPhenyl (kolumna odwróconej fazy), której zasada działania opiera się na wych
wytywaniu różnic w hydrofobowości peptydów. Jest to jedna z znanych obecnie metod rozdziału peptydów. najskuteczniejszych Analiza otrzymanych pochodnych cytochromu i peptydów Każdy z otrzymanych po rozdziale peptydów sprawdzany był za pomocą spektroskopii EPR w celu ustalenia, czy zawiera on znacznik spinowy. Jeśli sygnał znacznika został wykryty tylko w jednym peptydzie z danej frakcji cytochromu, to przyjmowano, ze frakcja zawiera monopochodną cytochromu c (czyli cytochrom znakowany na jednej, konkretnej lizynie). Rozdział peptydów z monopochodnej porównywano dla sprawdzenia z rozdziałem peptydów dla natywnego cytochromu. Zazwyczaj w rozdziale monopochodnej pojawiał się jeden dodatkowy peptyd, w którym znajdował się znacznik spinowy. Następną czynnością była analiza aminokwasów tego konkretnego peptydu, dla ustalenia pozycji znakowanej lizyny. Dodatkowo w celu sprawdzenia, czy frakcja zawiera monopochodną wyznaczono stężenia cytochromu w roztworze metodami spektrofotometrycznymi i sprawdzono stężenia znacznika przez badanie widma EPR (powierzchnia pod Unią jest proporcjonalna do stężenia znacznika). Jeśli stosunek obu stężeń wynosił w granicach błędu 1:1, to przyjmowano, ze frakcja zawiera pochodną cytochromu znakowaną na jednej lizynie. Powyższą metodą uzyskano i odseparowano 6 monopochodnych cytochromu c. Wyniki pomiarów Celem wykonanych pomiarów doświadczalnych było stwierdzenie, czy za pomocą wykorzystanego spektrometru impulsowego EPR można ustalić wpływ oddziaływania dipolowodipolowego pomiędzy dwoma różnymi spinami elektonowymi (w naszym przypadku pomiędzy spinami pochodzącymi od niesparowanych elektronów na rodniku nitrowwym i żelazie w grupie hemowej) występującymi w jednej makromolekule (cytochromie c) na mierzony czas relaksacji T\. Pomiary przeprowadzone byty w temperaturze 20 C i wyższej. Wiele tego typu badań było prowadzonych metodą fali ciągłej [Lik2,Kok,Kul], jak i za pomocą spektrometrii impulsowej [Hir.Bec] przeważnie w niskich temperaturach, kiedy procesy relaksacyjne związane z dyfuzją rotacyjną są znacznie spowolnione, bądź też wogóle nie mają miejsca (w wypadku ciał starych lub zamrożonych roztworów). Dodatkowym oddziaływaniem mającym duży wpływ na procesy relaksacji w cieczy jest oddziaływanie wymienne (wymiana Heisenberga) pomiędzy spinami. W efekcie wykonania preparatyki otrzymane zostały pochodne cytochromu c znakowane na eaminowych resztach grup lizynowych (odpowiednio,, 8). Wykonane pomiary czasów relaksacji spinowosieciowej miały na celu oszacowanie odległości pomiędzy atomem żelaza znajdującym się w centrum pierścienia porfirynowego cytochromu, a niesparowanym elektronem rodnika nitroksylowego znajdującego się w konkretnym miejscu makromolekuły. Wbl
Pomiary dla różnych monopochodnych Zakładano, że dla niesparowanego elektronu rodnika nitrozowego w monopochodnych cytochromu istnieją dwa mechanizmy relaksacji mechanizm wynikający z anizotropii czynników g i A oddziaływanie dipolowodipolowe pomiędzy jonem żelaza a rodnikiem Wynika stąd, że mierzony sygnał odrostu nasycenia powinien być jednoeksponencjalny, co zostało zaobserwowane dla sygnałów o większym stosunku sygnału do szumu (S/N>60). Dla sygnałów o mniejszym stosunku S/N nie było możliwe stwierdzenie ile składowych zawiera mierzony sygnał. Zmierzony czas relaksacji 7' exp dany jest zależnością 1 1 t 1 gdzie 7" inl określone jest wzorem [Ber] zaś 7" ldip wzorem,,, nr. frakcji Frakcja la Frakcja 2a Frakcja 3a Frakcja la (zreduk.) Frakcja lb Frakcja 2b Frakcja 3b Frakcja le Frakcja2e Frakcja3e Frakcja le (zreduk.) Frakcja 2e (zreduk.) Frakcja 3e (zreduk.) znakowanie 8 8 8 8 r{k] 7", [ni] 1019.8 ±18.6 1080.5138.3 569.5 18.0 1327.0148.0 1325.51 17.5 1435.2126.1 1138.9124.1 1466133 1571157 1161142 1343146 1532158 1234130 Tab.l. Odległości Feznacznik i zmierzone czasy relaksacji; r oznacza odległości FeLizyna znane?. pomiarów metodą dyfrakcji rentgenowskiej.
Pomiary czasów relaksacji 1\ zostały przeprowadzone dla trzech otrzymanych monopochodnych cytochromu c. Różnice w otrzymanych czasach relaksacji dla poszczególnych serii pomiarów mogą być spowodowane różną postacią białka w próbce. Niektóre serie pomiarów wykonane byty na "świeżo otrzymanym" materiale inne zaś na starym, który mógł już ulec agregacji. 6.4 _ 8.6 8 8 7.0 7.2 1400 2.80 3.00 3.20 1000/T 1/K) 3.40 1200 1000 800 600 400 200 40.0 60.0 Twnpetctuni [ C 80.0 Rys. 2. Zaleznoać czasów rołakaecg od temperatury dla monopoortodnaj cyloehramu. Czasy mierzona były przy wzractqjacej tempersttfza. N«górnym rysunku km)«azg2ono zal«inooć temp«raturowq na wykresie Arrtwntuea. Poza obszarami dttnaturacj włdać nlowązal«łm«ćln(in' 1 ) odioovt. Niewielkie różnice w wartościach zmierzonych czasów relaksacji dla frakcji le, 2e oraz 3e i ich zredukowanych odpowiedników sugerowałyby, że wpryw oddziaływań dipolowodipolowych pomiędzy znacznikiem spinowym, a żelazem na mierzony czas T\ jest na tyle mały w temperaturach pokojowych, że nie da się na jego podstawie oszacować odległości żelazoznacznik. Jednakże badanie stopnia utlenienia żelaza po zredukowaniu było
wykonane jedynie jedną metodą (kolorymetryczną) i powinno zostać potwierdzone przynajmniej jeszcze inną niezależną metodą. W obrębie każdej serii jednakie wzajemne zależności czasów relaksacji są podobne, co sugerowałoby, że wykonana preparatyka jest powtarzalna. Ponadto wpływ oddziaływań dipolowodipolowych tłumaczyłby (przynajmniej częściowo) różnice w wartościach czasów relaksacji (poprawna zależność zgodna z teorią: większa odległość dłuższy czas relaksacji). Z drugiej strony różnice w wartościach czasów relaksacji można tłumaczyć także różnym ksztahem makromolekuly znakowanej w różnych miejscach (efektywnym promieniem mającym wpływ na czas korelacji). Na mierzony doświadczalnie czas relaksacji ma także wpływ konformacja reszty lizynowej zmodyfikowanej znacznikiem spinowym (J e J położenia przestrzennego względem łańcucha polipeptydowego). Zależność temperaturowa Skokowy wzrost czasów korelacji w obszarach 47.5 C57.5 C oraz 70 C75 C (rys.2.) można tłumaczyć jako efekt denaturacji cytochromu, która następuje dwustopniowo [Boy,Moo] Przy takim procesie łańcuch białkowy rozwija się, co powoduje dwa efekty. zwiększenie rozmiarów liniowych białka i najprawdopodobniej utracenie kształtu kulistego, co powoduje wydłużenie czasów korelacji zwiększenie odległości r pomiędzy dipolami magnetycznymi, co również wpływa na wydłużenie czasów relaksacji Literatura [Boy] R. E. Dickerson, R. Timkovich, "Cytochromes c", w:"the Enzymes", P. D. Boyer, Academic Press, New York (1975), 397547 [Moo] G. R. Moore, G. W. Pettigrew, w: "Cytochromes c, Evolutionary, Structural and Physicochemical Aspects", SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, New York, London (1990), 196209 [Hir] D. J. Hirsch, W. F. Beck, I. B. Innes, G. W. Brudvig, Biochemistry, 3J. (1992), 532541 [Bee] W. F. Beck, J. B. Innes, J. B. Lynch, G. W. Brudvig, Jour. Mapi. Res. (1991) 91, 1229 [Lik2] A. V. Kulikov, G. I. Likhtenstein, Advances in Molecular Relaxation and Interaction Processes, 10(1977)4779 [Kok] A. I. Kokorin, V. E. Formazyuk, Mokkulamaja Biologija, 15, No. 4, 930938 (1981) [Kul] A. V. Kulikov, Molekulamaja Biologija, 1Q, No. 1, 132141 (1976) [Ber] L. Band, I. Bertini, C. Luchinat, "Nuclear and Electron Relaxation", VCH Verlaggesselschafl mbh, Weinheim (1991)