METODA REAL - TIME PCR W DIAGNOSTYCE ZAKAŻEŃ WIRUSEM EPSTEINA-BARR

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 253-258 Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka METODA REAL - TIME PCR W DIAGNOSTYCE ZAKAŻEŃ WIRUSEM EPSTEINA-BARR Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: doc. dr hab. Bogumiła Litwińska Przeprowadzono porównawczą ocenę wyników wykrywania DNA EBV przy zastosowaniu metody real-time PCR oraz nested PCR. Wirus Epsteina-Barr (EBV); Herpeswirus typu 4 człowieka (HHV-4) jest jednym z najpowszechniej występujących wirusów u ludzi. EBV wykazuje tropizm przede wszystkim do limfocytów B, ale jest zdolny do zakażenia również limfocytów T, komórek nabłonkowych i innych komórek (7). Po zakażeniu pierwotnym, do którego dochodzi najczęściej w pierwszej dekadzie życia, w większości przypadków ustalane jest latentne zakażenie wirusem, które może ulegać okresowym reaktywacjom. Wirus Epsteina Barr jest czynnikiem etiologicznym wielu chorób i pierwszym wirusem, dla którego został określony bezpośredni związek z procesem nowotworzenia (16). Szerokie spektrum łagodnych i złośliwych chorób nowotworowych etiologicznie związanych z EBV jest unikalną cechą tego patogenu wśród innych DNA wirusów (10). W chwili obecnej diagnostyka laboratoryjna zakażenia EBV jest prowadzona w różnorodny sposób, z wykorzystaniem wielu metod diagnostycznych (od testów serologicznych do ilościowych metod genetycznych) stosowanych w zależności od celu prowadzonej diagnostyki. Oznaczenia serologiczne są metodą z wyboru przy potwierdzaniu ostrych i dokumentowaniu przebytych zakażeń EBV u osób zdrowych (5). Ilościowe metody genetyczne są coraz powszechniej używane przy diagnozowaniu, monitorowaniu oraz leczeniu chorób związanych z EBV, szczególnie potransplantacyjnych zaburzeń limfoproliferacyjnych (PTLD) (1, 8). Wśród tych metod real-time PCR jest najczęściej stosowaną metodą do oznaczania poziomu DNA wirusa EBV (viral load) (6). Celem niniejszej pracy była analiza wyników uzyskanych metodą real-time PCR oraz home made nested PCR, stosowanej w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH do rutynowej diagnostyki, w grupie pacjentów z serologicznie potwierdzonym aktualnym lub niedawno przebytym zakażeniem EBV. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły próbki surowic przesyłane do Zakładu Wirusologii w celu rutynowych badań diagnostycznych. W próbkach surowic oznaczano obecność przeciwciał

254 A. Trzcińska, J. Siennicka Nr 3 swoistych dla EBV w klasie IgM i IgG dla antygenu kapsydowego wirusa (VCA), IgG dla antygenu jądrowego (EBNA) i wczesnego (EA). Oznaczeń dokonywano metodą ELISA przy zastosowaniu komercyjnych testów: ETI-EBV-M reverse, ETI-VCA-G, ETI-EBNA- G (DiaSorin), Anti-EBV EA IgG ELISA (Biotest). Do oznaczeń metodami genetycznymi wybrano surowice osób z serologicznie potwierdzonym aktualnym lub niedawno przebytym zakażeniem EBV, u których wykryto obecność przeciwciał w klasie IgM dla antygenu kapsydowego VCA (40 surowic, I grupa) lub obecność przeciwciał w klasie IgG dla antygenu wczesnego EA, przy jednoczesnym braku przeciwciał IgM dla VCA (20 surowic, II Grupa). Charakterystykę serologiczną grupy I i II podano w tabeli I. Obecność anty-vca IgM lub anty-ea IgG jest potwierdzeniem aktualnego lub niedawno przebytego zakażenia EBV. Przy czym, zgodnie ze wzorem interpretacji podanym przez producenta testów, przyjęto że obecność anty-ea IgG przy braku anty-vca IgM i obecności anty-vca IgG i/lub anty-ebna IgG jest charakterystyczna dla reaktywacji zakażenia EBV. Natomiast obecność anty-vca IgM może przemawiać za istnieniem zakażenia pierwotnego, w szczególności przy braku przeciwciał anty-ebna IgG, które są wytwarzane relatywnie późno. Tabela I. i oznaczeń serologicznych w badanych grupach pacjentów. I grupa (średnia wieku 15,21 ± 12,13) VCA - IgM VCA-IgG EA-IgG EBNA-IgG Liczba surowic o danym wzorze serologicznym Liczba próbek w których wykryto DNA metodą PCR + + + + 14 0 + + - - 4 1 + + + - 16 10 + - + - 1 1 + + nb - 2 0 + + nb + 1 1 + - nb - 1 0 + nb nb nb 1 0 II grupa (średnia wieku 22,20 ± 15,34) VCA - IgM VCA-IgG EA-IgG EBNA-IgG liczba surowic (+) w PCR - + + + 18 0 - + + - 2 0 nb badanie nie zostało wykonane z powodu zbyt małej ilości surowicy DNA z badanych próbek surowic oraz z kontroli negatywnej izolowano za pomocą zestawu firmy Affigene (Sangtec Molecular Diagnostics AB) High Pure Viral Nucleic Acid Kit zgodnie z modyfikacjami firmy Roche. Badania metodą real-time PCR wykonano przy użyciu komercyjnego testu LightCycler EBV Quant Kit fimy Roche zgodnie z procedurą podaną przez producenta. Poziom wykrywalności - LOD (Limit of Detection) dla surowicy/plazmy w przypadku testu LightCycler EBV Quant Kit określono na 229 kopii DNA/ml. Badania jakościową metodą nested PCR wykonywano zgodnie z procedurą opisaną przez Pozo i wsp. (12), a detekcję produktów po amplifikacji przeprowadzano w 4% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny. Na podstawie wyników badań kontroli zewnętrznej (QCMD) czułość zastosowanej metody nested PCR określono na powyżej 250 genomów/ml.

Nr 3 Diagnostyka zakażeń EBV 255 Tabela II. i uzyskane dla surowic, w których stwierdzono obecność DNA EBV metodą real-time lub/i nested PCR Lp Wiek pacjenta VCA-IgM AU/ml VCA-IgG AU/ml ELISA EBNA- IgG AU/ml EA-IgG Absorbancja PCR Real-time PCR kopie DNA/ ml 1 4 75 + 27,8 + 12,8-0,316 + 1,32 x 10 4 + + 2 4 79,3 + <10 - <5-0,473 + 2,63 x 10 3 + + 3 5 >140 + >170 + 15,5-1,079 + 4,40 x 10 4 + + 4 5 25,4 + >170 + 104 + nb nb 2,80 x 10 3 + + 5 6 >140 + 58,7 + 11,4-0,553 + 5,23 x 10 2 + - 6 6 103 + >170 + 6,33-1,214 + 1,77 x 10 3 + + 7 9 122 + 115 + 7,1-0,156 - ------------ - + 8 11 >140 + 119 + <5-0,986 + 8,86 x 10 3 + + 9 12 39,9 + >170 + 9,8-1,642 + 4,24 x 10 3 + + 10 12 39 + 17,7 + <5-0,286 + 1,08 x 10 4 + + 11 18 >140 + >170 + 5,9-2,06 + 4,95 x 10 3 + + 12 18 37,1 + 81,9 + <5-1,242 + 5,13 x 10 3 + + 13 20 130 + >170 + <5-0,846 + ------------ - + Nested PCR WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Wykrywanie kwasów nukleinowych ma duże znaczenie w diagnostyce w wirusologii klinicznej. Zarówno jakościowe, jak i ilościowe metody molekularne są obecnie rutynowo stosowane w większości laboratoriów wirusologicznych. Dostępne zaplecze techniczne, automatyzacja niektórych etapów procesu diagnostycznego daje możliwość rozwinięcia i wprowadzenia systemów wykrywania większości wirusów, jak również uzyskania klinicznie istotnych informacji, niezbędnych przy ustalaniu optymalnej terapii przeciwwirusowej (11). Jedną z technik jakościowego i ilościowego wykrywania DNA i RNA wirusów jest PCR, metoda pozwalająca m.in. na szybką detekcję tych wirusów, których wykrycie przy pomocy tradycyjnych metod wirusologicznych było do tej pory trudne, lub wręcz niemożliwe (14). Real-time PCR jest najczęściej stosowaną metodą do pomiaru viral load, wartości niezwykle istotnej w monitorowaniu odpowiedzi na zastosowane leczenie w zakażeniach takimi wirusami jak HIV, CMV, HBV, HCV czy EBV (18). Biorąc pod uwagę zdolność EBV do ustalania zakażenia latentnego uważa się, że wykrycie obecności DNA tego wirusa jest niewystarczające do diagnozowania chorób z nim związanych. Ilościowy pomiar EBV DNA, w odpowiednio dobranym materiale klinicznym, jest istotny do rozróżnienia niskiego poziomu replikacji wirusa u osób klinicznie zdrowych od wysokiego poziomu replikacji, charakterystycznego dla chorób związanych z EBV (6, 9, 13). Jak wykazują liczne badania kliniczne, pomiar viral load dla EBV może odgrywać istotną rolę w diagnozowaniu i monitorowaniu nowotworów związanych z EBV, np. raka nosogardzieli, PTLD, choroby

256 A. Trzcińska, J. Siennicka Nr 3 Hodgkin a i innych (4, 9). Podstawowym narzędziem w diagnostyce pierwotnego/ostrego zakażenia EBV pozostają jednak nadal testy serologiczne. Jednakże, biorąc pod uwagę osoby z niedoborami immunologicznymi, u których reakcja odpornościowa, a więc również produkcja przeciwciał, może być nietypowa, do rozpoznania pierwotnego/ostrego zakażenia EBV u tych osób również niezwykle przydatne okazują się być ilościowe metody genetyczne (5, 17). Podczas ostrej, litycznej fazy zakażenia, wirusowe DNA może być wykrywane w surowicy (2). W prezentowanych badaniach zastosowano metodę real-time PCR do określenia poziomu EBV DNA w surowicach osób, u których badaniem serologicznym wykryto obecność przeciwciał anty-vca IgM (I grupa) lub obecność przeciwciał anty-ea IgG, przy jednoczesnym braku przeciwciał anty-vca IgM (II grupa). Otrzymane wyniki porównano z wynikami metody nested PCR dla tych samych próbek surowic. Ogółem zgodnych wyników (dodatnich i ujemnych) w obu metodach PCR uzyskano 57/60 (95%): 10 zgodnie dodatnich i 47 zgodnie ujemnych. Trzy wyniki niezgodne dotyczyły 2 przypadków wykrycia DNA EBV tylko metodą nested PCR, oraz 1 przypadku wykrycia DNA wirusa tylko metodą real-time PCR (Tabela II). Koncentracja DNA EBV mierzona metodą real-time PCR w próbkach dodatnich wyniosła od 5,23 x 10 2 do 4,40 x 10 4 kopii DNA/ml, przy czym próbka surowicy, w której stwierdzono najniższą koncentrację DNA wirusa, w badaniu nested PCR była ujemna. Obecność DNA EBV którąkolwiek z metod PCR wykrywano jedynie wśród osób z I grupy (13/40). Brak DNA EBV w próbkach surowic pacjentów, u których stwierdzono obecność markerów serologicznych świadczących o reaktywacji zakażenia (II Grupa) może być związany z fazą choroby, jak również z długością utrzymywania się wirusa we krwi. Bauer i wsp. (2) wykazali, że w przypadku pierwotnego zakażenia EBV istnieje ścisły związek pomiędzy wykryciem DNA wirusa a czasem jaki upłynął od momentu pojawienia się pierwszych objawów chorobowych. DNA EBV było zawsze wykrywane do 12 dnia od pojawienia się objawów, natomiast po 22 dniu nie obserwowano już dodatnich wyników oznaczeń PCR. Analiza zależności pomiędzy statusem serologicznym pacjentów włączonych do tego badania a obecnością DNA EBV wykazała, że w większości (12/13; 92,3%) próbek surowic, w których wykryto obecność kwasu nukleinowego wirusa, nie stwierdzano obecności przeciwciał anty-ebna IgG. Biorąc pod uwagę, że wzór serologiczny reprezentowany przez te próbki: anty-vca IgM (+), anty-vca IgG (+) i anty-ebna IgG (-) jest charakterystyczny dla wczesnej fazy zakażenia pierwotnego, można stwierdzić, że większość wyników dodatnich uzyskanych metodą PCR dotyczyła właśnie tej fazy. Jedynie w nielicznych pracach opisany jest związek pomiędzy mianem lub obecnością swoistych dla EBV przeciwciał a viral load. Besson i wsp. (3) stwierdzili, że u pacjentów z chorobą Hodgkin a miano przeciwciał anty-vca IgG wzrasta wraz ze wzrostem poziomu DNA EBV w limfocytach krwi obwodowej, natomiast nie obserwowali korelacji pomiędzy anty-ebna-1 IgG oraz anty-ea IgG a viral load. O pozytywnej korelacji pomiędzy przeciwciałami anty-vca IgG a viral load w grupie pacjentów zakażonych HIV donoszą Stevens i wsp. (15). i prezentowanej pracy wskazują na brak związku pomiędzy poziomem przeciwciał (AU/ml) w próbce a liczbą kopii wykrytego DNA (regresja liniowa, r 2 < 0,1; p > 0,05). Otrzymane wyniki wskazują, że metoda real-time PCR w zastosowanym wariancie, jest wiarygodnym narzędziem diagnozowania wczesnej fazy zakażenia pierwotnego i może

Nr 3 Diagnostyka zakażeń EBV 257 stanowić test potwierdzenia dla wyników oznaczeń serologicznych w przypadkach wątpliwych. Stosowana w rutynowych badaniach diagnostycznych w Zakładzie Wirusologii metoda nested PCR wykazała porównywalny w stosunku do zastosowanego wariantu metody real-time PCR stopień wykrywalności DNA EBV. A. Trzcińska, J. Siennicka REAL - TIME PCR IN DETECTION OF EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTION SUMMARY The aim of presented paper was to compare the results of EBV tests performed using real-time PCR (LightCycler EBV Quant Kit Roche) and home made nested PCR in patients with serological confirmed actual or recent EBV infection. In serum samples the presence of IgM and IgG antibody to virus capsid antigen (VCA), IgG antibody to nuclear antigen (EBNA) and early antigen (EA) was tested. Serum samples with the presence anty-vca IgM (I Group) or with anty EA IgG and without anty-vca IgM (II Group) were tested by PCR. Real-time PCR results were compared to nested PCR. In both PCR methods 57/60 (95%) concordant results were obtained (10 positive and 47 negative samples). In two serum samples positive result was obtained only by real-time PCR, in one serum sample only by nested PCR. EBV DNA was detected only in serum samples from I Group. Negative EBV DNA detection may be correlated to phase of infection (time after onset of disease) in which the sample was collected, as well as with fact how long EBV is presence in blood. The results indicate that real-time PCR is a reliable tool for diagnosis of primary EBV infection early in the course of disease and may serve as test of confirmation in serologically indeterminate EBV infection (doubtful cases). PIŚMIENNICTWO 1. Bakker NA, Verschuuren EA, Erasmus ME I inni. Epstein-Barr virus-dna load monitoring late after lung transplantation: a surrogate marker of the degree of immunosuppresion and a safe guide to reduce immunosuppresion. Transplantation 2007; 83: 433 8. 2. Bauer CC, Aberle SW, Popow-Kraupp T I inni. Serum Epstein-Barr virus DNA load in primary Epstein-Barr virus infection. J Med Virol 2005; 75: 54 8. 3. Besson C, Amiel C, Le-Pendeven C i inni. Positive correlation between Epstein-Barr virus viral load and anti- viral capsid immunoglobulingtiters determined for Hodgkin s lymphoma patients and their relatives. J Clin Microbiol 2006; 44: 47 50. 4. De Paoli P, Pratesi C, Bortolin MT. The Epstein Barr virus DNA levels as a tumor marker in EBV-associated cancers. J Cancer Res Clin Oncol 2007; 133: 809 15. 5. Gulley ML. Molecular diagnosis of Epstei-barr virus-related diseases. J Mol Diagn 2001; 3: 1 10. 6. Gulley ML, Tang W. Laboratory assays for Epstein-Barr virus-related disease. J Mol Diagn 2008; 10: 279 92. 7. Hassan R, White LR, Stefanoff CG I inni. Epstein-Barr virus (EBV) detection and typing by PCR: a contribution to diagnostic screening of EBV-positive Burkitt s lymphoma. BMC Diagnostic Pathology 2006; 1: 17. 8. Hayden RT, Hokanson KM, Pounds SB i inni. Multicenter comparison of different real-time PCR assays for quantitative detection of Epstein-Barr virus. J Clin Microbiol 2008; 46: 157 63.

258 A. Trzcińska, J. Siennicka Nr 3 9. Kimura H, Ito Y, Suzuki R, Nishiyama Y. Measuring Epstein-barr virus (EBV) load: the significance and application for each EBV-associated disease. Rev Med Virol 2008; 18: 305 19. 10. Kutok JL, Wang F. Spectrum of Epstein-Barr virus-associated diseases. Ann Rev Pathol 2006; 1: 375 404. 11. Niesters HG. Clinical virology in real time. J Clin Virol 2002; 25(Suppl 3): S3 12. 12. Pozo F, Tenorio A. Detection and typing of lymphotropic herpesviruses by multiplex polymerase chain reaction. J Virol Methods 1999, 79: 9-19. 13. Sato T, Fujieda M, Tanaka E I inni. Monitoring of Epstein-Barr virus load and antibody in pediatric renal transplant patients. Pediatr Int 2008; 50: 454 8. 14. Speers DJ. Clinical applications of molecular biology for infectious diseases. Clin Biochem Rev 2006; 27: 39 51. 15. Stevens SJ, Blank BS, Smits PH I inni. High Epstein-Barr virus (EBV) DNA loads in HIV-infected patients: correlation with antiretroviral therapy and quantitative EBV serology. AIDS 2002; 16: 993 1001. 16. Uozaki H, Fukayama M. Epstein-Barr virus and gastric carcinoma viral carcinogenesis through epigenetic mechanisms. Int J Clin Exp Pathol 2008; 1: 198 216. 17. Yamashita N, Kimura H, Morishima T. Virological aspects of Epstein-Barr virus infections. Acta Med Okayama 2005; 59: 239 46. 18. Yang S, Rothman RE. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future applications in acute-care setting. Lancet Infect Dis 2004; 4: 337 48. Otrzymano: 28 VII 2009r Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii NIZP-PZH.