Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 1 płytka płytek

Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 1 płytka - 96 72340 5 płytek - 480 72341 TEST PRZESIEWOWY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ ANTY-HCV (PRZECIWKO WIRUSOWI ZAPALENIA WĄTROBY TYPU C) W OSOCZU LUB SUROWICY LUDZKIEJ METODĄ IMMUNOENZYMATYCZNĄ IVD 883635-2013/09

SPIS TREŚCI 1. PRZEZNACZENIE TESTU... 5 2. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIE TESTU... 5 3. ZASADY TESTU... 5 4. ODCZYNNIKI... 6 5. OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI... 7 6. PRÓBKI... 9 7. TEST... 9 8. OGRANICZENIA TESTU... 12 9. CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA... 13 10. PIŚMIENNICTWO... 14 4 [PL]

1. PRZEZNACZENIE TESTU Test Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 jest pośrednim jakościowym testem immunoenzymatycznym do wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) w oparciu o wykrycie przeciwciał anty-hcv w ludzkiej surowicy lub osoczu. Test może być stosowany przez laboratoria diagnostyczne i banki krwi. 2. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIE TESTU Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest otoczkowym wirusem RNA o dodatniej polaryzacji (9.5 kb) z rodziny Flaviviridae. Od czasu jego wyizolowania w 1989 roku zidentyfikowanych zostało 6 głównych genotypów tego wirusa. Wirus HCV jest główną przyczyną wirusowego zapalenia wątroby nie-a nie-b. Zakażenie wirusem HCV ma zazwyczaj postać ostrą i przewlekłą, która może prowadzić do marskości i raka wątrobowokomórkowego. W badaniach przesiewowych pierwszego rzutu w kierunku zapalenia wątroby typu C wykorzystywany jest test immunoenzymatyczny ELISA trzeciej generacji służący do wykrywania przeciwciał anty-hcv. 3. ZASADA TESTU Test Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 opiera się na zastosowaniu fazy stałej przygotowanej z użyciem oczyszczonych antygenów: trzech rekombinowanych białek z regionu niestrukturalnego (NS3 i NS4), peptydu z regionu strukturalnego (kapsyd) wirusa HCV oraz fazy płynnej (koniugatu) zawierającej mysie przeciwciała anty-ludzkie IgG sprzężone z peroksydazą. Badanie składa się z następujących etapów: 1) Rozcieńczalnik próbki (R6), a następnie próbki i kontrole (R3 i R4) są nanoszone do dołków mikropłytki. Jeśli w próbce obecne są przeciwciała HCV, wiążą się one z antygenami na fazie stałej. 2) Po inkubacji prowadzonej przez 1 godzinę w temperaturze 37 C i etapie płukania dodaje się koniugat (R7) zawierający znakowane peroksydazą anty-ludzkie przeciwciała IgG. Jeśli w próbce obecne są ludzkie przeciwciała IgG, koniugat anty-ludzkich przeciwciał IgG zwiąże się z ludzkimi przeciwciałami, które związały się z fazą stałą w poprzednim etapie. 3) Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37 C niezwiązany koniugat enzymatyczny zostaje usunięty poprzez płukanie, a obecność kompleksów antygen znaczony peroksydaząprzeciwciało zostaje ujawniona poprzez dodanie substratu. 4) Po 30 minutach inkubacji w temperaturze laboratoryjnej (18 30 C) następuje zatrzymanie reakcji, a następnie spektrofotometryczny odczyt absorbancji przy długości fali 450/620 700 nm. Pomiar absorbancji próbki umożliwia wykrycie ewentualnej obecności przeciwciał HCV w próbce. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do ilości przeciwciał HCV związanych z fazą stałą. [PL] 5

4. ODCZYNNIKI 4.1. Opis Oznaczenie na etykiecie Opis Postać / Przygotowanie 72340 72341 R1 Microplate Mikropłytka 12 pasków po 8 dołków opłaszczonych oczyszczonymi rekombinowanymi antygenami (NS3, NS4) i peptydem kapsydowym HCV. Numer identyfikacyjny = 94 1 płytka Gotowa do 5 płytek Gotowe do R2 Concentrated washing solution (20X) Stężony roztwór do płukania (20X) Bufor Tris NaCl ph 7,4 Substancja konserwująca: Proclin 300 (0,04%) 70 ml Do rozcieńczenia 235 ml Do rozcieńczenia R3 Negative control Kontrola ujemna Bufor Tris HCI zawierający BSA (albumina surowicy bydlęcej) Substancja konserwująca: ProClin 300 (0,1%) 1 ml Gotowa do 1 ml Gotowa do R4 Positive control Kontrola dodatnia Ludzka surowica zawierająca przeciwciała przeciw HCV, ujemna pod względem antygenu HBs oraz przeciwciał anty-hiv-1 i anty-hiv-2, rozcieńczona w buforze Tris HCI zawierającym BSA, inaktywowana fotochemicznie Substancja konserwująca: ProClin 300 (0,1%) 1,5 ml Gotowa do 3 ml Gotowa do R6 Sample diluent Rozcieńczalnik próbki Bufor cytrynianowy; barwa purpurowa Substancja konserwująca: azydek sodu (<0,1%), Cosmocil CQ (0,025%) 15 ml Gotowa do 2 fiolki 2 x 30 ml Gotowe do R7 Conjugate Koniugat Mysie przeciwciała anty-ludzkie IgG / peroksydaza Barwa zielona. Substancja konserwująca: ProClin 300 (0,5 %) 15 ml Gotowa do 2 fiolki 2 x 30 ml Gotowe do R8 Substrate buffer Substrat Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu, ph 4,0, zawierający H2O2 (0,015%) i dimetylosulfotlenek (DMSO) 4% 60 ml Do rekonstytucji 2 fiolki 2 x 60 ml Do rekonstytucji R9 Chromogen: TMB solution (11X) Chromogen: roztwór TMB Roztwór zawierający 3.3, 5.5 tetrametylobenzydynę (TMB) 5 ml Do rekonstytucji 2 fiolki 2 x 5 ml Do rekonstytucji R10 Stopping solution Roztwór zatrzymujący reakcję Roztwór kwasu siarkowego 1N 28 ml Gotowa do 3 fiolki 3 x 28 ml Gotowe do 6 [PL]

.2. Warunki przechowywania i stosowania estaw przechowywać w temperaturze +2 8 C. Każdy element zestawu przechowywany w temperaturze +2 8 C może być wykorzystywany do daty ważności podanej na opakowaniu (o ile nie alecono inaczej). o otwarciu odczynniki R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 i R10 przechowywane w temperaturze 2 8 C mogą yć wykorzystywane do daty ważności podanej na etykiecie, o ile nie doszło do ich skażenia. Identyfikator Przechowywanie R1 R2 R8 + R9 Po otwarciu zamkniętej próżniowo torebki paski z mikrodołkami przechowywane w starannie zamkniętym opakowaniu oryginalnym w temperaturze +2 8 C mogą być wykorzystywane przez miesiąc. Rozcieńczony roztwór do płukania może być przechowywany w temperaturze +2 30 C przez 2 tygodnie. Stężony roztwór do płukania (R2) może być przechowywany w temperaturze +2 30 C. Po rekonstytucji odczynniki przechowywane bez dostępu światła mogą być wykorzystywane przez 6 godzin w temperaturze pokojowej (18 30 C).. OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Wyrób do stosowania w diagnostyce in vitro przez wyspecjalizowany personel medyczny..1. Higiena i bezpieczeństwo pracy: Niniejszy zestaw testowy powinien być stosowany przez odpowiednio przeszkolony personel laboratorium, który zna procedury laboratoryjny i potencjalne zagrożenia. Należy nosić odpowiednią odzież ochronną, rękawiczki oraz ochronę oczu/twarzy. Należy stosować zasady Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Zestaw zawiera komponenty przygotowane z ludzkiej krwi. Materiał pochodzenia ludzkiego używany do przygotowania kontroli dodatniej (R4) został zbadany i był ujemny pod względem antygenu powierzchniowego wirusa HBV (HBs Ag) i przeciwciał przeciw ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2 Ab) oraz dodatni pod względem przeciwciał anty-hcv. Kontrola dodatnia R4 została inaktywowana przez ogrzewanie. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, wszystkie składniki pochodzące z krwi ludzkiej, odczynniki oraz badane próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny, zgodnie z zalecanymi uniwersalnymi środkami ostrożności dotyczącymi czynników zakaźnych przenoszonych przez krew, określonymi przez przepisy lokalne, regionalne i krajowe. Postępowanie w przypadku rozlania materiałów biologicznych: rozlane materiały pochodzenia ludzkiego należy traktować jako materiały potencjalnie zakaźne. Jeśli rozlana substancja nie zawiera kwasu, należy natychmiast odkazić obszar wycieku, materiały i zanieczyszczone powierzchnie lub narzędzia odpowiednim chemicznym środkiem dezynfekującym, który skutecznie neutralizuje czynniki biologiczne z próbek (na ogół 1:10 roztwór wybielacza stosowanego w gospodarstwach domowych, 70 80% etanol lub izopropanol, jodofor (np. 0,5% Wescodyne Plus) itp.) oraz wytrzeć je do sucha. Jeśli rozlana substancja zawiera kwas, należy osuszyć (wytrzeć) ją bibułą lub zneutralizować, a następnie zmyć powierzchnię wodą i wytrzeć do sucha. Może istnieć konieczność wyrzucenia materiałów wchłaniających użytych do czyszczenia do pojemnika na odpady zakaźne. Obszar wycieku należy odkazić chemicznym środkiem dezynfekującym. UWAGA: nie autoklawować roztworów zawierających wybielacz! Wszystkie próbki i materiały wykorzystane do testu należy utylizować w taki sam sposób jak materiały zakaźne. Odpady laboratoryjne, chemiczne lub biologiczne muszą być traktowane i utylizowane zgodnie z przepisami lokalnymi, regionalnymi i krajowymi.

Zalecenia i środki ostrożności dotyczące niektórych chemicznych składników zestawu są przedstawione za pomocą piktogramów zamieszczonych na etykietach oraz w informacjach znajdujących się na końcu tej instrukcji. Dokument SDS jest dostępny na stronie www.bio-rad.com. 5.2. Środki ostrożności dotyczące testu 5.2.1. Przygotowanie Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania następujących zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności. Nie mieszać ani nie łączyć ze sobą odczynników z różnych partii w jednej serii oznaczeń. Przed użyciem umieścić odczynniki w temperaturze pokojowej (18 30 C) i odczekać 30 minut w celu stabilizacji i osiągnięcia temp. pokojowej. Nazwa testu oraz specjalny numer identyfikacyjny danego testu są podane na obramowaniu każdej ikropłytki. Ten sam numer identyfikacyjny znajduje się też na każdym pasku. Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3: numer identyfikacyjny = 94 Przed użyciem testu sprawdź numer identyfikacyjny. Jeżeli numeru identyfikacyjnego brakuje lub różni się on od podanego powyżej, paska nie należy używać. UWAGA: podczas danego oznaczenia można używać roztworu do płukania (R2, identyfikator na etykiecie: 20X, zielony), bufora substratu peroksydazy (R8, identyfikator na etykiecie: bufor TMB, niebieski), chromogenu (R9, identyfikator na etykiecie: TMB 11X, purpurowy) i roztworu zatrzymującego reakcję (R10, identyfikator na etykiecie: 1N, czerwony) z innej partii pod warunkiem, że w danej serii oznaczeń stosowane są materiały z tej samej partii. Te odczynniki można stosować razem z niektórymi pozostałymi produktami Bio-Rad. Szczegółowych informacji udzieli dział techniczny. Unikać skażenia podczas rekonstytucji odczynników. Używać dobrze umytego i wypłukanego wodą dejonizowaną szkła lub, co jest preferowane, materiałów jednorazowych. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodaniem odczynnika. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie jonów metali. Unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami substratu i koniugatu. Roztwór wykrywający reakcję (bufor substratu + chromogen) musi mieć barwę różową. Zmiana zabarwienia w czasie kilku minut po rekonstytucji świadczy o tym, że odczynnik nie może być użyty i należy go zastąpić innym. Roztwór należy przygotowywać w czystej plastikowej rynience jednorazowego użytku lub szklanym naczyniu umytym HCl 1N oraz dokładnie opłukanym wodą destylowaną i wysuszonym. Odczynnik należy przechowywać w ciemnym miejscu. Nie należy nigdy stosować tego samego pojemnika do nanoszenia koniugatu i roztworu wykrywającego reakcję. 5.2.2. Przebieg testu Nie zmieniać procedury testu. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (zasadowych, kwasów i aldehydów) oraz kurzu mogących wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. Płukanie dołków jest istotnym etapem procedury; należy przestrzegać przewidzianej liczby cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy dołki są całkowicie napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest przyczyną błędnych wyników. Należy starannie przestrzegać opisanych procedur płukania w celu uzyskania optymalnego działania testu. W przypadku niektórych aparatów konieczna może być optymalizacja procedury płukania (zwiększenie liczby cykli płukania i/lub ilości buforu do płukania w każdym cyklu) dla zachowania akceptowalnego poziomu tła OD w próbkach ujemnych. W sprawie adaptacji testu i procedur specjalnych należy skontaktować się z Bio-Rad.

6. PRÓBKI Próbki krwi należy pobierać zgodnie z obowiązującą procedurą. Badanie powinno być wykonywane z nierozcieńczonej surowicy lub osocza (pobranego na EDTA, heparynian litu, cytrynian sodu lub ACD). Próbki zawierające agregaty należy przed wykonaniem testu odwirować. Obecność cząsteczek fibryny lub agregatów może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie dodatnich. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temperaturze +2 8 C lub głęboko zamrozić w temperaturze 20 C. Nie wykonywać więcej niż 3 cykli zamrażania/rozmrażania. Próbki należy rozmrażać w temperaturze pokojowej (18 30 C). Przed użyciem zhomogenizować próbki przez odwracanie. Na wynik oznaczenia nie wpływa obecność w próbce do 120 g/l albuminy, 200 mg/l bilirubiny, do 33 g/l trioleiny ani do 2 g/l hemoglobiny. Nie należy jednak stosować próbek skażonych, hiperlipemicznych ani silnie zhemolizowanych. Próbki przeznaczone do transportu (najlepiej zamrożone) muszą być zapakowane zgodnie z obowiązującymi przepisami dotyczącymi transportu czynników etiologicznych. Nie należy podgrzewać próbek. 7. TEST 7.1. Dodatkowe wymagane materiały, nieuwzględnione w zestawie Woda destylowana. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu. Bibuła. Folia adhezyjna. Rękawiczki jednorazowe. Okulary ochronne. Probówki jednorazowe. Pipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o stałej pojemności, lub multipipety pobierające 50 μl, 80 μl, 100 μl, 200 μl i 1 ml. Cylindry miarowe na 10 ml, 200 ml i 1000 ml. Worteks. Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna. Łaźnia wodna lub inkubator mikropłytek o temperaturze 37 C ± 1 C (*). Pojemnik na odpady zakaźne. Czytnik mikropłytek z filtrami 450 nm, 490 nm i 620 700 nm (*). (*) Informacji w sprawie zalecanego wyposażenia w sprzęt udzieli dział techniczny. 7.2. Rodzaj odczynników 7.2.1. Odczynniki gotowe do Odczynnik 1 (R1): Mikropłytka Każda ramka zawierająca 12 pasków zapakowana jest w aluminiową torebkę z zamknięciem strunowym. Torebkę należy przeciąć nożyczkami lub skalpelem 0,5 1 cm powyżej zamknięcia. Otworzyć opakowanie i wyjąć ramkę. Niewykorzystane paski umieścić z powrotem w torebce. Torebkę szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze +2 8 C. Odczynnik 6 (R6): Rozcieńczalnik próbki Przed użyciem zhomogenizować przez odwracanie. Odczynnik 7: Koniugat (R7) Przed użyciem zhomogenizować przez odwracanie.

7.2.2. Odczynniki wymagające rekonstytucji Odczynnik 2 (R2): Roztwór do płukania stężony (20X) Aby otrzymać gotowy do roztwór do płukania, rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:20. Przygotować 800 ml na jedną płytkę zawierającą 12 pasków. Odczynnik 8 (R8) + Odczynnik 9 (R9): Roztwór wykrywający reakcję Rozcieńczyć w stosunku 1:11 chromogen (R9) w buforze substratu (np. 1 ml odczynnika R9 + 10 ml odczynnika R8), biorąc pod uwagę, że 10 ml jest konieczne i wystarcza na 12 pasków. Dokładnie wymieszać. 7.3. Procedura Należy ściśle przestrzegać procedury. Stosować surowice kontrolne dodatnie i ujemne dla każdej serii oznaczeń w celu sprawdzenia jakości testu. Należy przestrzegać następujących zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: 1. Starannie ustalić plan rozkładu i identyfikacji próbek. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór do płukania R2 (patrz 7.2). 3. Wyjąć z ochronnej torebki ramkę i potrzebną liczbę pasków (R1). Włożyć niepotrzebne paski z powrotem do opakowania. Zamknąć opakowanie i umieścić w temperaturze +2 8 C. 4. Nanieść materiały do dołków w następującej kolejności (zalecany rozkład na płytce): 100 μl rozcieńczalnika próbki (R6) do każdego dołka, a następnie 50 μl kontroli ujemnej (R3) do dołka A1, 50 μl kontroli dodatniej (R4) do dołków B1, C1, D1, 50 μl próbki 1 do dołka E1, 50 μl próbki 2 do dołka F1, itd. Dokładnie wymieszać przez co najmniej 3 aspiracje pipetą lub wytrząsając mikropłytkę przez 5 sekund. Jeśli czas nanoszenia próbek przekracza 10 minut, zaleca się naniesienie kontroli ujemnej i dodatniej po dodaniu próbek. W zależności od wykorzystywanego systemu możliwe jest modyfikowanie pozycji i kolejności nanoszenia kontroli. UWAGA: po naniesieniu próbek dołki zawierające próbki (lub kontrole) zmieniają barwę z purpurowej na niebieską. Można zweryfikować obecność próbki w dołkach przez odczyt spektrofotometryczny przy 620 nm (patrz 7.7). 5. O ile to możliwe, zakryć szczelnie mikropłytkę nową folią adhezyjną. 6. Inkubować mikropłytkę przez 60 minut (± 5 min.) w temperaturze 37 C ± 1 C. 7. Jeśli to konieczne, zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość wszystkich dołków do pojemnika na płynne odpady. Do każdego dołka dodać minimum 0,370 ml roztworu do płukania. Zaaspirować ponownie i powtórzyć etap płukania minimum 4 razy (w sumie należy wykonać 5 cykli płukania). Pozostała objętość płynu nie może przekraczać 10 μl (w razie potrzeby osuszyć paski, kładąc je na bibule w pozycji odwróconej). Podczas płukania automatycznego należy zastosować ten sam cykl płukania. 8. Szybko nanieść 100 μl roztworu koniugatu (R7) do każdego dołka. Koniugat należy wstrząsnąć przed użyciem. Zakryć mikropłytkę nową folią (jeżeli to możliwe) i inkubować przez 30 minut (± 5 min.) w temperaturze 37 C ± 1 C. UWAGA: koniugat ma barwę zieloną. Można zweryfikować jego obecność w dołkach przez odczyt spektrofotometryczny przy 620 nm (patrz 7.7). 9. Kolejno, zdjąć folię adhezyjną, zaaspirować zawartość dołków i wykonać minimum 5 cykli płukania jak powyżej. 10. Przygotować roztwór wykrywający reakcję (odczynnik R8 + R9). 11. Szybko nanieść 80 μl roztworu wykrywającego reakcję do każdego dołka (R8 + R9). Pozostawić reakcję w ciemności na 30 minut (± 5 min.) w temperaturze pokojowej (18 30 C). Podczas tej inkubacji nie stosować folii adhezyjnej.

UWAGA: dodawanie roztworu wykrywającego reakcję, który ma barwę różową, jest kontrolowane wizualnie. (patrz 7.7). 12. Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego reakcję (R10), stosując tę samą kolejność i tempo dystrybucji jak dla roztworu wykrywającego reakcję. UWAGA: dodawanie roztworu zatrzymującego reakcję, który jest bezbarwny, jest kontrolowane wizualnie. Po dodaniu tego roztworu różowa barwa substratu w dołkach próbek ujemnych znika (brak koloru), natomiast dołki z próbkami dodatnimi zmieniają barwę z niebieskiej na żółtą. 13. Dokładnie wytrzeć spód mikropłytki. Po upływie co najmniej 4 minut od dodania roztworu zatrzymującego reakcję w ciągu 30 minut zmierzyć gęstość optyczną (przy długości fali 450/620 700 nm) za pomocą czytnika płytek. 14. Sprawdzić zgodność odczytu spektrofotometrycznego i wizualnego oraz kolejność odczytu z ustalonym na początku planem rozkładu i identyfikacji. 7.4. Kontrola jakości Stosuj kontrole dodatnie (R4) i kontrolę ujemną (R3) dla każdej serii oznaczeń w celu walidacji testu. (patrz 7.5). 7.5. Kryteria walidacji testu Test uznaje się za zwalidowany, jeśli przestrzegane są następujące warunki: 1. Dla kontroli ujemnej R3: Zmierzona wartość absorbancji musi być mniejsza niż 60% wartości cut off: OD < cut off x 0,6 2. Dla kontroli dodatniej przeciwciał R4: 0,800 Średnia wartość OD R4 2,700 Jeśli jedna z wartości kontroli dodatniej R4 różni się o więcej niż 30% od wartości średniej, należy ją pominąć i do obliczeń użyć dwóch pozostałych. 7.6. Obliczanie i interpretacja wyników Wartość cut-off jest określana za pomocą kontroli dodatniej R4: Obliczyć średnią zmierzoną wartość absorbancji dla kontroli dodatniej R4. Obliczyć wartość cut off (CO): CO = Średnia wartość OD R4 x 0,4 Obecność lub brak przeciwciał anty-hcv określa się poprzez porównanie odnotowanej absorbancji z obliczoną wartością cut-off dla każdej próbki. Dla każdej próbki obliczany jest następujący współczynnik: Współczynnik = OD próbki / wartość CO Próbki o gęstości optycznej niższej od wartości cut off są uznawane za ujemne (współczynnik < 1) w teście Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3. Wyniki tuż poniżej wartości cut-off (CO-10 % < OD < CO, współczynnik między 0,9 a 1) należy jednak interpretować ostrożnie. Zaleca się powtórzenie oznaczenia takich próbek w duplikacie, o ile pozwala na to system oraz procedury laboratoryjne.

Próbki o gęstości optycznej równej lub wyższej niż wartość cut off (współczynnik 1) zostają uznane za początkowo dodatnie w teście Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3. Przed ostateczną interpretacją muszą być ponownie oznaczone w duplikacie. Jeśli po powtórzeniu oznaczenia wartość współczynnika przynajmniej jednego z dwóch duplikatów jest większa lub równa 1, początkowy wynik jest powtarzalny, a próbka zostaje uznana za dodatnią w teście Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3. Jeśli wartość współczynnika dwóch duplikatów jest mniejsza niż 1, początkowy wynik nie jest powtarzalny, a próbka zostaje uznana za ujemną. Próbki zbadane dwukrotnie i uznane za ujemne w teście Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3, lecz w przypadku których jedna wartość jest zbliżona do wartości cut off (współczynnik między 0,9 a 1) należy rozpatrywać ostrożnie. Zaleca się zbadanie pacjenta inną metodą lub użycie do badania innej próbki. Jeśli gęstość optyczna badanych próbek jest bardzo niska (ujemne OD) oraz gdy kontrolowana jest obecność próbek i odczynnika, wyniki mogą zostać uznane za ujemne. Zaleca się potwierdzenie próbek dodatnich zgodnie z obowiązującymi zaleceniami i algorytmami krajowymi. 7.7. Spektrofotometryczna weryfikacja pipetowania próbki i koniugatu (opcjonalna) Weryfikacja pipetowania rozcieńczalnika próbki (R6) i próbki w pierwszym etapie Jednoczesną obecność rozcieńczalnika (R6) i próbki (lub kontroli) można potwierdzić za pomocą pomiaru automatycznego przy długości fali 620 nm. Wartość gęstości optycznej każdego dołka zawierającego jednocześnie rozcieńczalnik (R6) i próbkę (lub kontrolę) musi być wyższa niż 0,800. UWAGA: po dodaniu próbki rozcieńczalnik (R6) zmienia barwę z purpurowej na niebieską. Weryfikacja pipetowania koniugatu (R7) w drugim etapie Uwaga: koniugat (R7) ma barwę zieloną. Obecność koniugatu (R7) w dołkach można potwierdzić przez pomiar automatyczny przy długości fali 620 nm. Wartość OD każdego dołka powinna być wyższa niż 0,300 (wartość niższa wskazuje zazwyczaj na niedostateczne dodanie koniugatu). Weryfikacja pipetowania roztworu wykrywającego reakcję Obecność różowego roztworu wykrywającego reakcję w dołkach można zweryfikować przez pomiar automatyczny przy długości fali 490 nm. Gęstość optyczna dołka z roztworem musi być wyższa niż 0,100 (wartość niższa wskazuje na niedostateczne dodanie roztworu wykrywającego reakcję). Widać wyraźnie różnicę koloru, kiedy bezbarwne puste dołki stają się różowe po naniesieniu przygotowanego roztworu substratu chromogenu. 8. OGRANICZENIA TESTU Ze względu na zróżnicowanie reakcji immunologicznych występujących u pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C (szczególnie w trakcie serokonwersji) mogą wystąpić pewne różnice w wykrywaniu przeciwciał za pomocą testów w zależności od wykorzystywanych antygenów białkowych. Wynik ujemny w teście przesiewowym nie wyklucza zatem możliwości ekspozycji na HCV lub zakażenia HCV. Według dostępnego piśmiennictwa nosiciele HCV poddawani immunosupresji lub ze współistniejącym zakażeniem HIV-HCV mogą mieć szczególnie niskie poziomy przeciwciał, mieszczące się poniżej limitu wykrywalności testów HCV. We wszystkich testach ELISA można uzyskać wyniki fałszywie dodatnie. Zaleca się zweryfikowanie swoistości reakcji w przypadku próbek dodatnich w powtórnym badaniu, zinterpretowanych zgodnie z kryteriami testu Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3, za pomocą odpowiedniej metody: samym testem przesiewowym ELISA do wykrywania przeciwciał anty-hcv lub w połączeniu z testem immunoblot do wykrywania przeciwciał anty-hcv w celu potwierdzenia obecności przeciwciał anty-hcv. W razie konieczności można przeprowadzić badanie metodą biologii molekularnej w celu wykrycia genomu HCV.

Metoda kolorymetryczna służąca do sprawdzenia nanoszenia próbek i/lub koniugatu i/lub roztworu wykrywającego reakcję nie pozwala na oznaczenie objętości dodanej próbki i/lub koniugatu i/lub roztworu wykrywającego reakcję, lecz jedynie potwierdza ich obecność w dołkach. Poziom błędu tej metody jest ściśle związany z dokładnością używanego systemu (łączny współczynnik zmienności nanoszenia i odczyt wynoszący ponad 10% może znacznie obniżyć jakość weryfikacji). Testu Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 nie zatwierdzono stosowania do badania próbek zbiorczych lub próbek rozcieńczonych. W sporadycznych przypadkach w rozcieńczalniku próbek (R6) widoczna jest obecność drobnych cząstek, która w żaden sposób nie wpływa na jego jakość. 9. CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA 9.1. Pomiar precyzji Odtwarzalność i precyzję pośrednią oznaczono za pomocą próbek o różnych stężeniach przeciwciał anty-hcv. W celu określenia powtarzalności próbki badano 30 razy w tej samej serii oznaczeń. Próbki zbadano także w duplikacie w okresie 20 dni w 2 oznaczeniach każdego dnia. Obliczono średnie współczynników, odchylenia standardowe i współczynniki zmienności (CV). 9.1.1. Powtarzalność Próbki N Średnia współczynników Odchylenie standardowe CV % Ujemne 30 0,12 0,006 4,5 Słabo dodatnie pod względem przeciwciał anty-hcv Słabo dodatnie pod względem przeciwciał anty-hcv Silnie dodatnie pod względem przeciwciał anty-hcv 30 1,29 0,059 4,6 30 1,33 0,112 8,4 30 3,60 0,191 5,3 Wartości CV otrzymane dla próbek dodatnich wynoszą mniej niż 10%.

9.1.2. Precyzja pośrednia Próbki N Średnia współczyn ników Wewnątrztestowa Międzytestowa/ między operatorami Między poszczególnymi dniami Odtwarzalność całkowita SD CV % SD CV % SD CV % SD CV % Ujemne 120 0,13 0,009 7,3 0,011 8,5 0,005 3,9 0,015 11,8 Słabo dodatnie pod względem przeciwciał anty-hcv 120 1,40 0,053 3,8 0,119 8,5 0* N/d 0,130 9,3 Słabo dodatnie pod względem przeciwciał anty-hcv 120 1,48 0,082 5,6 0,120 8,1 0* N/d 0,145 9,8 Silnie dodatnie pod względem przeciwciał anty-hcv 120 3,57 0,141 4,0 0,173 4,8 0* N/d 0,223 6,2 * Szacunkowa ujemna wartość wariancji to 0. Wartości CV uzyskane dla próbek dodatnich wynoszą nie więcej niż 15%. 9.2. Charakterystyka kliniczna Działanie testu Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 sprawdzono, badając próbki pobrane od losowo wybranych dawców krwi, pacjentów hospitalizowanych, pacjentów z ostrymi i przewlekłymi zakażeniami wirusem HCV oraz pacjentów z klinicznymi objawami niezwiązanymi z zakażeniem HCV. Badania przeprowadzono w 2 ośrodkach krwiodawstwa, w szpitalu oraz w ośrodku Bio-Rad. 9.2.1. Swoistość diagnostyczna Badanie przeprowadzono z użyciem próbek surowicy i osocza EDTA pobranych od losowo wybranych dawców krwi w 2 ośrodkach krwiodawstwa. Badanie swoistości przeprowadzono także z użyciem próbek pobranych od pacjentów hospitalizowanych. Wszystkie próbki przebadano za pomocą testu anty-hcv ze znakiem CE.

Tabela 1: Badanie swoistości Populacja Ośrodek Dawcy krwi Pacjenci hospitalizo wani Rodzaj próbki Liczba Próbki reaktywne w pierwszym badaniu (IR) Powtórnie zbadane próbki reaktywne (RR) Swoistość (%) #1 surowica* 2,641* 2 2 2,636/2,638 #2 surowica 537 1 1 536/537 osocze 2002 4 1 2,001/2,002 Przedział ufności 95% #1+ #2 5,180* 7 4 99,92% 5,173/5,177 99,80 99,98 #3 surowica 502 0 0 100% 502/502 99,30 100,00 * Z obliczeń wykluczono 3 dawców, którzy w teście referencyjnym uzyskali wynik niejednoznaczny. 9.2.2. Czułość diagnostyczna Czułość diagnostyczną zbadano z użyciem 559 próbek pobranych od pacjentów zakażonych wirusem HCV. 465 z nich reprezentowało różne genotypy (1, 2, 3, 4, 5, 6). 25 próbek pochodziło od pacjentów, od których krew pobrano w okresie 24 godzin przed wykonaniem analizy. Tabela 2: Badane genotypy Genotypy 1 (1, 1a, 1a/b, 1b) 4 2 3 (4, 4a, 4a/c, (2, 2a/c, 2a, (3, 3a, 3b, 3c) 4a/c/d, 4c, 2b, 2b/3) 4e, 4h, 4n, 4r) 5 (5, 5a) 6 (6, 6a, 6a/b, 6n) Ogółem N 230 51 107 63 8 6 465 Czułość diagnostyczna dla wszystkich zbadanych próbek wynosi 100% (559/559) przy przedziale ufności na poziomie 95% z [99,3-100%]. Próbki od pacjentów z ostrym zakażeniem: Czułość kliniczną określono także, badając 38 komercyjnych paneli serokonwersji (w tym 9 profili kapsydowych, 10 profili NS3 oraz 19 profili mieszanych) oraz porównując ją z testem porównawczym ze znakiem CE. Spośród 38 serokonwersji 1 panelu nie wykryto ani w teście Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3, ani w teście porównawczym. Spośród 37 paneli wykrytych za pomocą testu Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 11 serokonwersji wykryto wcześniej, w przypadku 25 wykrycie było równoważne, a dla 1 próbki wykrycie nastąpiło później.

W teście Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 oznaczono 283 próbki potencjalnie interferujące, które zawierały przeciwciała przeciwko czynnikom zakaźnym (cytomegalowirus, wirus Epsteina Barra, wirus ospy wietrznej i półpaśca, wirus odry, wirus różyczki, wirus świnki, wirus opryszczki, wirus grypy, wirus zapalenia wątroby typu A, wirus zapalenia wątroby typu B, HIV 1/2, HTLV 1/2, kiła, toxoplasma gondii, denga, choroba Chagasa), próbki pobrane od pacjentów z grupy ryzyka (pacjenci dializowani, pacjenci z marskością pozawątrobową, kobiety w ciąży, wieloródki) lub próbki pobrane od pacjentów z zaburzeniami układu immunologicznego (autoprzeciwciała, czynniki reumatoidalne, przeciwciała anty-mysie i szpiczaki). Żadna z próbek nie została uznana za dodatnią w teście Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3. Swoistość obserwowana dla tej populacji wynosiła 100% (283/283) i była zbliżona do swoistości próbek klinicznych. 9.4. Zjawisko hook effect Obecność tzw. zjawiska hook effect sprawdzono, badając 5 próbek o wysokich mianach w różnych rozcieńczeniach. Równoważność wyników zaobserwowana między próbkami rozcieńczonymi i nierozcieńczonymi wskazuje na brak zjawiska hook effect. 10. PIŚMIENNICTWO ALBORINO F., BURIGHEL A., TILLER F.W., VAN HELDEN J., GABRIEL C., RAINERI A., CATAPANO R., STEKEL H. Multicenter evaluation of a fully automated third-generation anti-hcv antibody screening test with excellent sensitivity and specificity. Med. Microbiol. Immunol. 2011, 200: 77 83. BHARTIA A.R., LETENDREA S.L., WOLFSONA T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52: 328 332. CHEN-JI H., HWEI-LING P., CHIH-YU C. Improving Antigenicity of the Recombinant Hepatitis C Virus Core Protein via Random Mutagenesis. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 2011: 359042. CHING W.M., WYCHOWSKY C., BEACH M.J., WANG M., DAVIES C.L., CARL M., BRADLEY D.W., ALTER M.S., FEINSTONE S.M., WAI-KUO SMIM J. Interaction of immune sera with synthetic peptides corresponding to the structural protein region of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, April 1992, 89: 3190-3194. CHOO Q.L., RICHMAN K.H., HAN J.H., BERGER K., LEE C., DONG C., GALLEGOS C., COIT D., MEDINA-SELBY A., BARR P.J., WEINER A.J., BRADLEY D.W., KUO G. and HOUGHTON M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88: 2451-2455. EASL EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 2011, 55(2): 245-64. NASOFF M.S., ZEBEDEE S.L., INCHAUSPE G., PRINCE A.M. Identification of an immudominant epitope within the capsid protein of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, June 1991, 88: 5462-5466. RIDER P.J. and LIU F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10: 32. Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39: 1147-1171. WIDELL A., BUSCH M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: 1277-1281.

ZACHARY P., ULLMANN M., DJEDDI S., WENDLING M.-J., SCHVOERER E., STOLL-KELLER F., GUT J.-P. Evaluation of two commercial enzyme immunoassays for diagnosis of hepatitis C in the conditions of a virology laboratory. Pathologie Biologie, 2004, 52 (2004): 511 516.