ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII GAZOWEJ DO OZNACZANIA KWASU BENZOESOWEGO W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH 1. Wstęp * Sezonowe występowanie niektórych produktów spożywczych oraz ich mała trwałość, skłoniły człowieka do opracowania sposobów pozwalających na przedłużenia ich przydatności do spożycia. Od dawna w gospodarstwach domowych do utrwalania żywności stosowano: naturalne chłodzenie, suszenie, solenie, wędzenie czy też fermentację. Natomiast w miarę rozwoju cywilizacji doskonalono istniejące i wprowadzano nowe sposoby konserwacji żywności. Obecnie do najczęściej wykorzystywanych metod konserwacji żywności należą: metody termiczne (chłodzenie, zamrażanie, pasteryzacja, sterylizacja, tyndalizacja), metody osmoaktywne (zagęszczanie, cukrzenie, solenie, peklowanie), metody mikrobiologiczne, metody radiacyjne, oraz chemiczne utrwalanie żywności. Chemiczne utrwalanie żywności polega na zastosowaniu substancji chemicznych, które wywołują efektywne utrwalenie żywności przy stosunkowo małych dawkach. Substancje te zwane konserwantami zmniejszają szybkość lub całkowicie zahamowują procesy mikrobiologiczne powodujące psucie żywności. Działanie konserwantów może powodować u drobnoustrojów uszkodzenie błon cytoplazmatycznych i ścian komórkowych, czy inaktywację pewnych enzymów lub metabolitów ważnych w ich procesach życiowych. Wśród substancji dozwolonych do konserwowania żywności można znaleźć antybiotyki, azotany (III) i (V), tlenek siarki (IV) i siarczany (IV) oraz kwasy benzoesowy, mrówkowy, propionowy jak i ich sole. Kwas benzoesowy (E 210) oraz jego sole: sodu (E 211), potasu (E 212) lub wapnia (E 213), są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym do konserwacji żywności, gdyż hamują rozwój drożdży, pleśni i wielu gatunków bakterii. Działanie konserwujące benzoesanów polega na oddziaływaniu na błonę komórkową oraz hamowaniu reakcji enzymatycznych, zwłaszcza wywołanych przez dehydrogenazę glukozowo-fosforanową i L-mleczanową. Kwas benzoesowy jest drobnokrystalicznym, białym ciałem stałym, słabo rozpuszczalnym w wodzie, w przeciwieństwie do jego soli. Ze względu na rozpuszczalność w konserwacji żywności częściej stosuje się benzoesan sodu niż sam kwas benzoesowy. Kwas benzoesowy i jego sole mogą być stosowane do utrwalania przetworów owocowych (dopuszczalna zawartość: 0,5 g na kg produktu), warzywnych i różnych sałatek (<1 g/kg), *) - na podst. Instrukcji do ćwiczeń opracowanej w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. 1
koncentratu pomidorowego (1,5 g/kg), konserw rybnych (<1 g/kg), jak również napojów gazowanych (<0,15 g/litr). kwas benzoesowy (E 210) benzoesan sodu (E 211) Szkodliwość substancji chemicznych, które zostały dopuszczone do stosowania w przemyśle chemicznym, jest określana poprzez podanie dawek dopuszczalnego dziennego spożycia. Dopuszczalne dzienne spożycie (ang. Acceptabe Daily Intake ADI) wyraża ile mg danej substancji, w przeliczeniu na 1 kg masy ciała może dziennie pobierać człowiek, przez całe życie, bez szkody dla organizmu. Dla benzoesanu sodu ADI wynosi 0-5 mg/kg masy ciała. Benzoesanu sodu może powodować podrażnienia śluzówki żołądka, dlatego spożycie zawierających go produktów może u osób nadwrażliwych (np. chorych na chorobę wrzodową) powodować dolegliwości bólowe. W połączeniu z witaminą C (E300) może przekształcić się w rakotwórczy benzen, co ma znaczenie szczególnie w przypadku napojów gazowanych, w których stosuje się jednocześnie obie te substancje. Temperatura i naświetlenie to czynniki przyspieszające formowanie się benzenu. Spożywanie dużych ilości benzoesanu sodu może powodować uczulenia u astmatyków i alergików, a u osób wrażliwych na aspirynę zaburzenia przewodu pokarmowego. Organizm ludzki ma jednak zdolność wydalania kwasu benzoesowego i jego soli z moczem. Trzeba jednak pamiętać, że kwas benzoesowy występuje naturalnie u wielu gatunków roślin i zwierząt. Jest naturalnym produktem przemiany materii. Znaczne ilości tego związku znaleziono u jagód (żurawina, borówka czarna). W związku z tym jest on również naturalnie obecny w pożywieniu. W mleku kwas benzoesowy może występować w ilości do 6 mg/kg a w jogurcie nawet do 40 mg/kg. Stosunkowo mało znajduje się go w ziemniakach, fasoli, ziarniakach zbóż (do 0.2 mg/kg). W miodzie w zależności od kwiatów, z których był zbierany benzoesany występują w stężeniu 10-100 mg/kg. Chromatografia gazowa. Do oznaczania benzoesanów w produktach spożywczych najczęściej wykorzystuje się technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Jednak na potrzebę ćwiczeń do analizy benzoesanów zastosowana zostanie metoda chromatografia gazowej. Chromatografia jest metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku różnego ich podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu chromatograficznego. W 2
chromatografii cieczowej fazą ruchomą jest ciecz, a fazą nieruchomą ciało stałe (chromatografia adsorpcyjna). W chromatografii gazowej fazą ruchomą jest gaz (azot, hel lub wodór) a faza stacjonarna pokrywa cienką warstewką ściankę wewnętrzną kilkudziesięciometrowej kapilary, która stanowi kolumną rozdzielczą. Jest oczywiste, że technika chromatografii gazowej może być stosowana tylko do rozdzielania substancji lotnych i nierozkładających się w zakresie temperatur do ok. 300 C. Podstawowym parametrem identyfikacji substancji jest czas retencji tr czas mierzony od momentu wprowadzenia próbki na kolumnę do momentu pojawienia się na wyjściu z kolumny maksimum stężenia danego związku chemicznego czyli maksimum piku. Najważniejszymi czynnikami wpływającymi na czas retencji danej substancji jest rodzaj zastosowanej fazy stacjonarnej, wymiary kolumny, temperatura pieca chromatograficznego, rodzaj i prędkość przepływu gazu nośnego. Temperatura kolumny ma ogromny wpływ na analizę. Proces chromatograficzny można prowadzić w stałej temperaturze (tzw. analiza izotermiczna) lub metodą programowanej temperatury (analiza z programowaną temperaturą). Tę drugą opcję stosujemy wtedy, gdy składniki mieszaniny różnią się znacząco temperaturami wrzenia, np. węglowodory z ropy naftowej lub szereg homologiczny alkoholi. Dozowana próbka powinna być bardzo mała, ponieważ wówczas strefa startowa jest bardzo wąska. Próbka wprowadzona do kolumny nie może być większa od pojemności sorpcyjnej kolumny, ponieważ przeładowanie kolumny prowadzi do złego rozdzielenia składników próbki i powstawania niesymetrycznych, szerokich pików. Analizy w chromatografii gazowej przeprowadza się za pomocą chromatografu gazowego. Zasada pracy tego urządzenia jest następująca: gaz nośny (faza ruchoma) doprowadzony z butli Ryc. Schemat chromatografu gazowego. 3
płynie przez regulator przepływu do dozownika, a następnie przez kolumnę i detektor, skąd jest usuwany na zewnątrz do atmosfery. Kolumna umieszczona jest w termostacie. Temperatura dozownika, detektora i kolumny jest odpowiednio regulowana. Przy pomocy dozownika analizowaną substancję wprowadza się w strumień gazu nośnego, który to następnie przenosi ją do kolumny. Tam właśnie następuje rozdział chromatograficzny składników próbki. Po rozdzieleniu poszczególne składniki próbki kierowane są do detektora, a ten wykrywa je i reaguje sygnałem elektrycznym. Sygnały po wzmocnieniu zostają rejestrowane w komputerze bądź w rejestratorze w postaci chromatogramu. 2. Część doświadczalna Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie analiz chromatograficznych próbek standardowych oraz próbek napojów na zawartość benzoesanów. Przygotowanie próbki polega na ekstrakcji kwasu benzoesowego eterem etylowy i przeprowadzeniu go w lotną pochodną (ester metylowy). Analiza chromatograficzna estru metylowego kwasu benzoesowego (benzoesanu metylu) wykonana zostanie chromatografem firmy Perkin Elmer z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (GC-FID). Analiza ilościowa dokonana będzie dzięki zastosowaniu metody normalizacji wewnętrznej (zastosowanie wzorca wewnętrznego kwas 3-chlorobenzoesowy). Roztwory wzorcowe Przygotować roztwory wzorcowe kwasu benzoesowego i kwasu 3-chlorobenzoesowego o stężeniu 1 mg/ml. W tym celu odważmy 2-3 mg odczynnika i rozpuszczamy w odpowiedniej ilości metanolu w szklanej fiolce o poj. 15 ml. Roztwory przechowujemy w chłodnym i ciemnym miejscu. Przygotowanie próbek do analizy Analizie poddajemy próbkę kontrolną o znanej zawartości kwasu benzoesowego oraz dwie próbki napojów słodzonych. Próbkę kontrolną zawierającą 40 µg kwasu benzoesowego i 40 µg kwasu 3-chlorobenzoesowego w 4 ml wody przenieść do fiolki szklanej o pojemności 15 ml, dodać 1 ml 1 M HCl i 3 ml eteru dietylowego. Fiolkę zakręcić nakrętką wyłożoną teflonem i po upewnieniu się, że układ jest szczelny (aby uniknąć wycieku) zawartość wytrząsać przez ok. 2 minut, po czym pozostawić w spokoju przez następne kilka minut. Po rozwarstwieniu się układu, górną warstwę (eterową) przenosimy do osobnej fiolki a ekstrakcję dolnej fazy powtarzamy dodając dodatkowe 2 ml eteru. Połączone frakcje eterowe odparowujemy do sucha w strumieniu azotu a do pozostałości dodajemy ok. 300 µl odczynnika derywatyzującego (roztwór diazometanu w eterze etylowym) i 20 µl metanolu. UWAGA!!! Suszenie prób i dodawanie odczynnika derywatyzującego oraz wszystkie dalsze z nim manipulacje przeprowadzamy BEZWZGLĘDNIE 4
pod włączonym wyciągiem (dygestorium). Naczyńka reakcyjne szczelnie zakręcamy, wytrząsamy przez okres około 1 min i pozostawimy na okres 10-15 min w spokoju. Po tym czasie rozpuszczalnik odparowujemy do sucha w strumieniu azotu i dodajemy 0.2 ml metanolu. Tak uzyskaną próbkę poddajemy analizie chromatograficznej wg. zaprogramowanej wcześniej przez prowadzącego metody chromatograficznej (odpowiednie temperatury, przepływy gazów, itp). Celem analizy zawartości kwasu benzoesowego w badanych napojach pobieramy próbki o objętości 4 ml i każdą z nich poddajemy takim samym zabiegom, jakim poddawana była próbka kontrolna (czyli dodajemy 40 µg kwasu 3-chlorobenzoesowego, 1 ml 1 M HCl, 3 ml eteru, itd.). Analizę GC przeprowadzamy wg. osobnej instrukcji. Analizy oznaczane będą w komputerze jako: KOXY dla próby kontrolnej i BAXY i BBXY dla próbek napojów, gdzie X nr grupy (1 lub 2), a Y nr zespołu (1-4). Wyniki analizy zarejestrowane przez komputer zostaną wydrukowane przez prowadzącego lub dostarczone w postaci binarnej. Analiza chromatograficzna Analizie poddajemy 1 µl przygotowanej próby: - kolumna chromatograficzna: SE-54; 30 m; 0,25 mm średnica wewnętrzna; 0,25 µm grubość filmu fazy ciekłej; temp. początkowa kolumny 60ºC przez 1 min, narost 10ºC/min do 160ºC, następnie 20ºC/min do 280ºC, utrzymywanie temp. 280ºC przez 5 min. - temp. Dozownika - 240ºC; temp. detektora 280ºC - gaz nośny - wodór 1ml/min, split 1:25. Obsługa chromatografu gazowego (w skrócie) 1. Zaprogramować w komputerze analizę przez wybranie metody C:\TC4\GC\Metody\Benz_GC.mth, ścieżki zapisu danych C:\TC4\GC\Dane\Kurs2\ oraz nazwy analizy (j.w.). Po wprowadzeniu do komputera w/w poczekać na ustabilizowanie się warunków (komunikat READY). 2. Pobrać do mikrostrzykawki l µl próby do analizy i wprowadzić ją do dozownika chromatografu (Uwaga! Jest gorący!). Niezwłocznie nacisnąć przycisk RUN na klawiaturze chromatografu. 3. Opracowanie wyników Wyznaczyć powierzchnię pików wzorców kw. benzoesowego i 3-chlorobenzoesowego w próbce kontrolnej oraz w próbkach badanych. Na tej podstawie wyliczyć stężenie kwasu benzoesowego w badanych produktach spożywczych. Wynik podać w [mmol/l] oraz [g/l]. 4. Literatura M. Zina, Utrwalanie i przechowywanie żywności, Wydawnictwo Uniwersytetu Rzeszowskiego, Rzeszów 2008. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 2005. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa, 2002. 5
Ćwiczenie II Data: Godzina: Imiona i Nazwiska Grupa 1. 2. 3. Wzorzec kwasu benzoesowego Wzorzec kwasu 3- chlorobenzoesowego Próbka 1 Próbka 2 Próbka 3 Wnioski: Opis Powierzchnia piku Stężenie - 1 g/l - 1 g/l - - kw. benzoesowy kw. 3-chlorobeznoesowy - g/l mm g/l mm g/l mm 6