Oporność na ciprofloksacynę szczepów Neisseria gonorrhoeae izolowanych w Polsce w latach

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 99-104 Oporność na ciprofloksacynę szczepów Neisseria gonorrhoeae izolowanych w Polsce w latach 2012-2013 Resistance to ciprofloxacin of Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Poland in 2012-2013 Beata Młynarczyk-Bonikowska 1, Marlena Kujawa 2, Grażyna Młynarczyk 2, Magdalena Malejczyk 1, Sławomir Majewski 1 1 Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawski Uniwersytet Medyczny w Warszawie Ciprofloksacyna jest powszechnie stosowanym lekiem przeciwbakteryjnym stosowanym między innymi w leczeniu zakażeń dróg moczowych w tym często w empirycznym leczeniu zapalenia cewki moczowej. Celem pracy była ocena wrażliwości na ciprofloksacynę szczepów Neisseria gonorrhoeae izolowanych od chorych z rzeżączką na przełomie 2012 i 2013 roku. Wykazano, że tylko 38,5% szczepów było wrażliwych na ciprofloksacynę. Słowa kluczowe: Neisseria gonorrhoeae, ciprofloksacyna, oporność ABSTRACT Introduction: Ciprofloxacin is commonly used in Poland specially for the treatment of urinary tract infections including urethritis. Patients are often treated without pathogen identification and antimicrobial resistance tests. Neisseria gonorrhoeae infection is one of the most common causes of urethritis in Poland. The resistance of bacteria to a wide range of antibiotics including ciprofloxacine makes the therapy of gonorrhoea more difficult. The mechanism of ciprofloxacine action depends on inactivation of bacterial topoisomerase II (gyrase) and topoisomerase IV. A resistance to ciprofloxacine occurring in Neisseria gonorrhoeae is mainly due to mutations in bacterial gyra(encoding topoisomerase II) and/or parc (encoding topoisomerase IV )genes. High level resistance is an effect of combination of three or four mutations. Another, less important mechanism of ciprofloxacin resistance, that can coexist with mutations in gyra and parc genes related to the overproduction of membrane pumps proteins. Material and methods: 65 Neisseria gonorrhoeae strains isolated from patients of Department of Dermatology and Wenereology in Warsaw in the second half of 2012 and first

100 B. Młynarczyk-Bonikowska i inni Nr 2 of 2013 was investigated. The strains were cultured on chocolate agar plates in a 5% CO2 atmosphere at 37 C and identified by colony morphology, Gram stain and oxidase reaction, followed by carbohydrate utilization test. Ciprofloxacin susceptibility was determined by E-Tests (biomerieux). Bacteria were incubated at 35 C in 5% CO2 for 24 h on chocolate agar plates. Tests were performed according to producers recommendations. The results (sensitive or resistant) were interpreted according to EUCAST recommendations. Results: The MIC (Minimal inhibitory concentration) of Ciprofloxacin in investigated strains ranged from 0,002 to >32 mg/l, MIC 50 =8 mg/l, MIC 90 =>32 mg/l. It was shown that only 38.5% of the strains were sensitive to ciprofloxacin according to EUCAST criteria from 2013 year. Conclusions: Due to the high percentage of ciprofloxacin resistant Neisseria gonorrhoeae strains (more than 61%) the antibiotic should not be used for the treatment of gonorrhoea in Poland. Key words: Neisseria gonorrhoeae, resistance, ciprofloxacin WSTĘP Ciprofloksacyna jest syntetycznym lekiem przeciwbakteryjnym z grupy fluorochinolonów powszechnie stosowanym w Polsce, szczególnie w leczeniu zakażeń układu moczowego, w tym w zapaleniach cewki moczowej. Nierzadko leczenie włączane jest na podstawie objawów klinicznych (wyciek z cewki moczowej, dyzuria) bez identyfikacji patogenu wywołującego, a tym bardziej bez oznaczania wrażliwości bakterii na stosowany antybiotyk. Liczba zarejestrowanych przypadków rzeżączki w Polsce wynosiła wg danych NIZP- -PZH w 2012 roku 1,9 a w 2013 1,7 na 100 tys. jednak biorąc pod uwagę fakt, że większość przypadków nie jest zgłaszanych problem może być znacznie bardziej powszechny. Niewątpliwie rzeżączka obok zakażeń Chlamydia trachomatis jest jedną z najczęstszych przyczyn zapalenia cewki moczowej w Polsce. Leczenie utrudnia narastająca oporność N. gonorrhoeae na stosowane antybiotyki, w tym ciprofloksacynę. Mechanizm działania ciprofloksacyny polega na inaktywacji dwóch enzymów bakteryjnych: topoizomerazy II (gyrazy) i topoizomerazy IV odpowiedzialnych za superspiralizację DNA. Oporność N.gonorrhoeae na ciprofloksacynę może być warunkowana przez dwa mechanizmy: mutacje w genach gyra i parc, kodujących odpowiednio topoizomerazy II i IV oraz nadprodukcję białek pomp błonowych MtrCDE, MacA-MacB i NorM. U N.gonorrhoeae do tej pory nie odkryto acetylotransferaz ciprofloksacyny oraz białek aktywnie chroniących gyrazę, występujących u innych bakterii Gram-ujemnych (7,10, 11, 17, 21). Największe znaczenie mają mutacje w genach gyra i parc. O oporności decyduje zwykle kombinacja zmian jednocześnie w obu białkach. W obu białkach istnieje kilka najczęściej opisywanych substytucji, przy czym występują one z różną częstością w zależności od regionu geograficznego. W Polsce dane dotyczące poziomu wrażliwości szczepów N. gonorrhoeae na ciprofloksacynę są jak dotąd skąpe i dotyczą lat 2010 częściowo 2012 (13). Celem podjętych badań była ocena poziomu wrażliwości szczepów N. gonorrhoeae na ciprofloksacynę, izolowanych od pacjentów, zgłaszających się do poradni Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 2012-2013.

Nr 2 Lekooporność N. gonorrhoeae 101 MATERIAŁ I METODY Badano 65 izolatów Neisseria gonorrhoeae pochodzących z wymazów z cewki moczowej, szyjki macicy, gardła lub odbytu od chorych z Kliniki Dermatologii i Wenerologii. Były to szczepy izolowane w końcu 2012 roku, nie badane w poprzedniej pracy (13) oraz szczepy z 2013 roku. Bakterie hodowano na agarze czekoladowym (biomérieux), w atmosferze zawierającej 5% CO 2, w temperaturze 37 C i identyfikowano na podstawie morfologii kolonii, morfologii komórek w preparatach mikroskopowych barwionych metodą Grama, wyników testu oksydazowego, oraz testu fermentacji cukrów (API NH, biomérieux). Oceny wrażliwości zgromadzonych szczepów Neisseria gonorrhoeae na ciprofloksacynę dokonano przy użyciu pasków nasączonych gradientem stężenia leku (E-testów), (biomérieux). Oznaczenie wykonywano zgodnie z zaleceniami producenta. Dla każdego szczepu przygotowano zawiesinę w roztworze fizjologicznym NaCl o gęstości 0,5 w skali McFarlanda i rozprowadzono ją równomiernie na powierzchni agaru czekoladowego (14). Paski zawierające gradient antybiotyku nakładano po 10 minutach od wykonania posiewu. Inkubację prowadzono w temperaturze 37 C, w atmosferze wzbogaconej CO 2. Odczyt E- testów dokonywany był po 24 godzinach przy użyciu lupy. Obecność kolonii bakteryjnych wokół paska oznaczała oporność na dane stężenie antybiotyku. Wyniki interpretowano zgodnie z zaleceniami EUCAST. Tabela I. Porównanie kryteriów wrażliwości na ciprofloksacynę wg. EUCAST i CLSI oraz wartości MIC ciprofloksacyny określone dla 65 badanych szczepów N. gonorrhoeae. MIC Wrażliwość Liczba szczepów (mg/l) EUCAST 2013 CLSI 2013 >0,002 0 S S 0,002 2 S S 0,004 13 S S 0,008 5 S S 0,016 4 S S 0,032 1 S S 0,064 0 I S 0,125 0 R I 0,25 1 R I 0,5 0 R I 1,0 0 R R 2,0 3 R R 4,0 3 R R 8,0 3 R R 16,0 3 R R 32,0 1 R R >32,0 26 R R Objaśnienia: S-wrażliwy, I-średnio wrażliwy, R-oporny

102 B. Młynarczyk-Bonikowska i inni Nr 2 WYNIKI Mimo różnic w kryteriach wrażliwości na ciprofloksacynę opracowanych przez EU- CAST i CLSI, to w przypadku badanych szczepów, uzyskano podobne wyniki niezależnie od zastosowanego kryterium. Niewielka różnica wystąpiła tylko w przypadku jednego szczepu, który zgodnie z kryteriami CLSI był słabo wrażliwy, a w przypadku zastosowania kryteriów EUCAST był oporny. Wyniki przedstawiono w tabeli I. W tabeli II. obliczono wartości MIC50 i MIC90 ciprofloksacyny dla badanych szczepów. Tabela II. MIC 50 i MIC 90 ciprofloksacyny dla szczepów N.gonorrhoeae. Liczba szczepów Zakres MIC mg/l MIC 50 mg/l MIC 90 mg/l 65 0,002->32 8 >32 Liczba (%) szczepów wg EUCAST 2013 wg CLSI 2013 S I R S I R 25 (38,5) 0 40 (61,5) 25 (38,5) 1 (1,5) 39 (60,0) DYSKUSJA Prowadzone przez nas wcześniej badania obejmowały charakterystykę epidemiologiczną 218 szczepów N. gonorrhoeae izolowanych w naszym ośrodku w latach 2010-12 (13). Stwierdzono wówczas, że w roku 2010 dominowały następujące klony NG-MAST: 5421, charakteryzujący się wrażliwością na ciprofloksacynę (MIC 0,125-0,5), ST5421 (MIC 2-4) oraz oporny na ciprofloksacynę ST 225 (MIC16->32). W 2011 roku wśród najczęstszych typów NG-MAST należy wymienić wrażliwy na antybiotyki w tym na ciprofloksacynę ST2992 (MIC dla ciprofloksacyny 0,002-0,008). W 2011 stwierdzono ponadto podobną liczbę przedstawicieli typu ST 1407. Ten ostatni typ NG-MAST po raz pierwszy został wyizolowany w Polsce w czerwcu 2011, a w roku 2012 wyraźnie już dominował, stanowiąc 41,8 % wszystkich izolatów. ST 1407 charakteryzował się wartościami MIC ciprofloksacyny 8->32mg/L (13). Nie jest to jednak jedyny problem związany z ST 1407. Charakteryzuje się on mozaikową strukturą PBP2 (penicilin binding proteine 2), co wiąże się z obniżoną wrażliwością lub niską opornością na antybiotyki betalaktamowe, a w tym zalecany w leczeniu rzeżączki ceftriakson. Co więcej, jak wykazano uprzednio, wystarczy pojedyncza mutacja aby powstały szczepy o wysokiej oporności na ceftriakson; taki szczep opisano m. in. we Francji (18). Wśród innych typów NG-MAST wyizolowanych w Polsce w latach 2010 2012 szczepów dwoinek rzeżączki opornych na ciprofloksacynę (MIC>32), można wymienić m.in. ST 8379, ST 1861 i ST 1340 (13). Oporność Neisseria gonorrhoeae na ciprofloksacynę wśród obecnie badanych szczepów, pochodzących z lat 2012-2013, występowała u 61,5%. Jest to wynik bardzo zbliżony do wyników uzyskanych dla szczepów z lat wcześniejszych (61% opornych izolatów) (13). Uzyskane wyniki wskazują, że odsetek szczepów dwoinek rzeżączki opornych na ciprofloksacynę w Polsce w ostatnich latach (2010-2013) utrzymuje się na stałym, wysokim poziomie. Badania izolatów z innych krajów europejskich przeprowadzane w ramach

Nr 2 Lekooporność N. gonorrhoeae 103 EURO-GASP wykazały łącznie oporność wśród 52,7% w 2010 roku i 48,7 % w 2011 roku. Częstość występowania oporności na ciprofloksacynę wśród szczepów N. gonorrhoeae znacznie różniła się w poszczególnych krajach uczestniczącymi w EURO-GASP. W 2011 roku najwyższy odsetek szczepów opornych występował w Rumunii (80,8%) a najniższy w Irlandii (14,1%) (6). W Szwajcarii w latach 2009-12 ponad 73% szczepów wykazywało oporność na ciprofloksacynę (5). Badania przeprowadzane w Rosji w ramach RU-GASP wlatach 2008-2009 wykazały ponad 49% szczepów opornych na cipofloksacynę (9). Według badań przeprowadzanych w ramach GISP, odsetek szczepów N. gonorrhoeae opornych na ciprofloksacynę w USA w 2011 roku wynosił 13,3% (8). W rejonie Ameryki Południowej i Karaibów w 2011 roku opornych na ciprofloksacynę było 42,1% badanych izolatów (4). W niektórych rejonach Azji oporność na ciprofloksacynę dotyczy nawet 97% (Pakistan, Indie, Bhutan) (15) lub 100% (np. Shandong Chiny) izolowanych szczepów (22). Wśród opornych na ciprofloksacynę typów NG-MAST wymieniano w innych krajach szczególnie ST 1407 i 225 (3, 5). Spośród 97% szczepów o obniżonej wrażliwości na cefiksym, badanych w Anglii i Walii, 74% reprezentowało ST 1407 i 100% było opornych na ciprofloksacynę (3). Ze względu na wysoki odsetek szczepów opornych na chinolony, CDC już od 2003 roku wycofało rekomendacje dla ciprofloksacyny w leczeniu rzeżączki (20). Również IUSTI nie zaleca stosowania tego antybiotyku u chorych zakażonych N. gonorrhoeae (dopuszczona jest możliwość zastosowania tylko u chorych z ciężkim uczuleniem na cefalosporyny, po uprzednim wykazaniu in vitro, że dany szczep jest wrażliwy na ciprofloksacynę) (1). Przeprowadzone przez nas badania wykazują, że również w Polsce ciprofloksacyna nie powinna być lekiem rutynowo stosowanym w leczeniu rzeżączki. PIŚMIENNICTWO 1. Bignell C, Unemo M; European STI Guidelines Editorial Board.2012 European guideline on the diagnosis and treatment of gonorrhoea in adults. Int J STD AIDS 2013; 24: 85-92. 2. Chisholm SA, Alexander S, Desouza-Thomas L i inni. GRASP Collaborative Group. Emergence of a Neisseria gonorrhoeae clone showing decreased susceptibility to cefixime in England and Wales. J Antimicrob Chemother 2011; 66: 2509-12. 3. Chisholm SA, Unemo M, Quaye N i inni. Molecular epidemiological typing within the European Gonococcal Antimicrobial Resistance Surveillance Programme reveals predominance of a multidrug-resistant clone. Euro Surveill. 2013; 17: 18(3) pii: 20358. 4. Dillon JA, Trecker MA, Thakur SD. Gonococcal Antimicrobial Surveillance Program Network in Latin America and Caribbean 1990-2011.Two decades of the gonococcal antimicrobial surveillance program in South America and the Caribbean: challenges and opportunities. Sex Transm Infect 2013; 89 Suppl. 4:iv36-41. 5. Endimiani A, Guilarte YN, Tinguely R i inni. Characterization of Neisseria gonorrhoeae isolates detected in Switzerland (1998-2012): Emergence of multidrug-resistant clones less susceptible to cephalosporins. BMC Infect Dis 2014; 14: 106. doi: 10.1186/1471-2334-14-106. 6. European Centre for Disease Prevention and Control. Gonococcal antimicrobial susceptibility surveillance in Europe, 2011. Stockholm: ECDC; 2013. 7. Golparian D, Shafer WM, Ohnishi M, Unemo M. Importance of multidrug efflux pumps in the antimicrobial resistance property of clinical multidrug-resistant isolates of Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 3556-9.

104 B. Młynarczyk-Bonikowska i inni Nr 2 8. Kirkcaldy RD, Kidd S, Weinstock HS i inni. Trends in antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae in the USA: the Gonococcal Isolate Surveillance Project (GISP), January 2006-June 2012. Sex Transm Infect. 2013; 89 Suppl 4:iv5-10. doi: 10.1136/sextrans-2013-051162. 9. Kubanova A, Frigo N, Kubanov A i inni. The Russian gonococcal antimicrobial susceptibility programme (RU-GASP) - national resistance prevalence in 2007 and 2008, and trends during 2005-2008. Euro Surveill 2010; 8: 15(14). 10. Kulkarni S, Bala M, Sane S i inni. Mutations in the gyra and parc genes of quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates in India. Int J Antimicrob Agents 2012; 40: 549-53. 11. Lindback E, Rahman M, Jalal S, Wretlind B. Mutations in gyra, gyrb, parc, and pare in quinolone-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae. APMIS 2002; 110: 651-7. 12. Liu WB, Wang GJ, Jing L. The antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae in Weihai. China J Lepr Skin Dis 2006; 22: 204-6. 13. Młynarczyk-Bonikowska B, Serwin AB, Golparian D i inni. Gonorrhoea epidemiology, antimicrobial susceptibility/resistance and genetic characteristics of Neisseria gonorrhoeae isolates from Poland, 2010-2012. BMC Infect Dis 2014; 14: 65. doi: 10.1186/1471-2334-14-65. 14. National Committee for Clinical Laboratory Standards Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically. 7th ed. Approved standard NCCLS M7-A7. 2006; National Committee for Clinical LaboratoryStandards, Wayne. 15. Sethi S, Golparian D, Bala M i inni. Antimicrobial susceptibility and genetic characteristics of Neisseria gonorrhoeae isolates from India, Pakistan and Bhutan in 2007-2011.BMC Infect Dis 2013; 13: 35. doi: 10.1186/1471-2334-13-35. 16. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 4.0, 2014; http://www.eucast.org. 17. Uehara AA, Amorin EL, Ferreira M de F i inni. Molecular characterization of quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates from Brazil. J Clin Microbiol 2011; 49: 4208-12. 18. Unemo M, Golparian D, Nicholas R i inni. High-level cefixime- and ceftriaxone-resistant N. gonorrhoeae in France: novel pena mosaic allele in a successful international clone causes treatment failure. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56: 1273-80. 19. Wang B, Xu JS, Wang CX i inni. Antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae isolated in Jiangsu Province, China, with a focus on fluoroquinolone resistance. J Med Microbiol 2006; 55: 1251-5. 20. World Health Organization. Increases in fluoroquinolone resistant Neisseria gonorrhoeae among men who have sex with men-united States, 2003, and revised recommendations for gonorrhea treatment. Morb Mortal Wkly Rep 2004; 53: 335-8. 21. Xie GY, Ying CM, Zhou JH. Study on gene mutations of Neisseria gonorrhoeae resistant to fluoroquinolone. J Diagn Concepts Pract 2006; 5: 243-6. 22. Zhao LH, Zhao SP. Molecular basis of high-level ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains from Shandong Province, China. Braz J Microbiol 2013; 44: 273-6. Otrzymano: 22 VII 2014 r. Adres Autora: 02-008 Warszawa, ul. Koszykowa 82A, Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny