FLEX Przeciwciało Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone SP1 Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS151 Przeznaczenie Synonimy antygenu Podsumowanie i wyjaśnienie Odczynnik dostarczony Do badań diagnostycznych in vitro. Przeciwciało FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone SP1, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus), jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciała te moŝna uŝywać w immunohistochemii w półilościowej detekcji ludzkiego receptora estrogenowego w skrawkach tkankowych ludzkiego raka sutka. Informacje uzyskane po przeprowadzeniu testu, o którym mowa w niniejszym dokumencie, mogą ułatwić ocenę prawdopodobieństwa odpowiedzi na leczenie oraz rokowania i leczenia pacjentów z rakiem sutka. Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. ER α Receptory steroidowe wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla ligandów. Ludzki receptor estrogenowy (ER) jest białkiem dimerycznym o masie 65 kda, zlokalizowanym najczęściej w jądrze komórkowym. NaleŜy do klasy białek o działaniu trans pobudzających transkrypcję przez wiązanie z określonymi elementami DNA, określanymi równieŝ jako elementy odpowiedzi hormonalnej. PoniewaŜ po związaniu białka następuje indukcja receptora ER i stymulacja transkrypcji, receptor estrogenowy określa się mianem indukowalnego czynnika pobudzającego (1, 2). W badaniach z ubiegłych lat wykazano korelację stanu receptora estrogenowego ER z wynikami przypadków nieleczonych (np. prognozowanie dobrze zróŝnicowanego inwazyjnego raka sutka) i odpowiedzią na leczenie antyhormonalne, np. leczenie tamoksifenem. Stwierdzono, Ŝe estrogeny przede wszystkim koncentrowały się w narządach docelowych estrogenu zwierząt i ludzkim raku sutka oraz udokumentowano w stopniu dobrym mitogenny wpływ estrogenu za pośrednictwem receptora estrogenowego ER. Na podstawie badań mechanizmu biologicznego wzrostu raka sutka stwierdzono, Ŝe szybkość wzrostu zaleŝy od obecności estrogenu lub progesteronu oddzielnie lub razem w większości wystąpień raka sutka (2). Tak więc stan receptora estrogenowego w przypadku raka sutka jest uwaŝany za potwierdzony czynnik prognostyczny podczas postępowania z pacjentami w leczeniu antyhormonalnym (2, 3). Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Gotowe do uŝycia monoklonalne przeciwciało królicze dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym białko stabilizujące i azydek sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. Klon: SP1. Immunogen Syntetyczny peptyd otrzymany z końca C ludzkiego receptora estrogenowego α. Swoistość W testach Western blot lizatu komórek MCF-7 przeciwciało znakuje duŝe pasmo 67 kda odpowiadające oczekiwanej masie cząsteczkowej ER α (4). Środki ostroŝności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN 3) w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŝeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŝe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŝy stosować właściwe procedury postępowania. 4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŝy nosić odpowiednie osobiste wyposaŝenie ochronne. 5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami. (118835-003) 307726PL_004 p. 1/5
Przechowywanie Przygotowanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Procedura barwienia oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Interpretacja wybarwienia Charakterystyka działania Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie stosować po upływie terminu waŝności podanego na opakowaniu. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane powyŝej, uŝytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŝy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŝy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm. W przypadku stosowania Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101) wymagane jest przeprowadzenie obróbki wstępnej poprzez cieplne odmaskowanie antygenu (HIER). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŝytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŝyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x), (nr kat. K8010/K8004). Skrawki zatopione w parafinie: W przypadku utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków tkankowych zalecane jest przygotowanie próbek metodą 3-in-1 dla Dako PT Link. Postępuj według procedury obróbki wstępnej zamieszczonej w ulotce dołączonej do opakowania roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x), (nr kat. K8010/K8004). Uwaga: Po barwieniu, skrawki naleŝy poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania. Skrawki odparafinowane: Obróbka wstępna odparafinowanych, utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków tkankowych jest zalecana z uŝyciem Dako PT Link i według tej samej procedury, która została opisana dla skrawków zatopionych w parafinie. Po barwieniu szkiełka naleŝy nakryć za pomocą środka wodnego lub do trwałego zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako Autostainer/Autostainer Plus, przy uŝyciu następujących protokołów: Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µl dozowanych odczynników) lub 200FLEXRTU3 (300 µl dozowanych odczynników) Autoprogram: ER (bez barwienia kontrastowego) lub ERH (z barwieniem kontrastowym) Dla etapu Auxiliary naleŝy ustawić opcję rinse buffer w programach barwienia 10 szkiełek. W przypadku programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŝy ustawić na none. Zapewnia to porównywalne czasy płukania. Wszystkie procedury inkubacji naleŝy równieŝ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŝywanym systemie Dako Autostainer, naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną z uŝyciem EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŝy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŝyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować szyjkę macicy, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części Charakterystyka wydajnościowa. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Rabbit, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS600). Przeciwciała dają odczyn jądrowy. Występujące niekiedy barwienie cytoplazmy uwaŝa się za nieswoisty odczyn tła. Dodatni wynik badania definiuje się jako odczyn jądrowy w 1% komórek nowotworowych (5). Precyzja: Do badań zgromadzono seryjne skrawki z kaŝdego z trzech róŝnych, utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie bloków raka sutka. Badanie przeprowadzono w następujący sposób: Precyzja w obrębie serii: Zgodnie ze standardowym protokołem EnVision TM FLEX, High ph, za pomocą Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone SP1 wykonano barwienie trzech preparatów z kaŝdego bloku tkankowego. Jednocześnie, jeden preparat z kaŝdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną. Precyzja między seriami: Przeprowadzając barwienie jednego preparatu z kaŝdego bloku tkankowego, powyŝszą procedurę powtarzano przez dodatkowe dwa dni. Jednocześnie, jeden preparat z kaŝdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną. Eksperymenty określające precyzję przy stosowaniu przeciwciał Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone SP1 dały wyniki spójne z uzyskanymi w badaniach określających precyzję w serii i pomiędzy seriami. W trakcie badania utrzymywano identyczne wyniki testu a pomiędzy seriami testów odczynniki przechowywano w temperaturze 2-8 C. Odtwarzalność między laboratoriami: Badania i ocenę odtwarzalności między laboratoriami przeprowadzono w trzech, róŝnych lokalizacjach. Piętnaście próbek raka sutka (5 ujemnych (0% odczynu jądrowego w komórkach nowotworowych), 1 słabo dodatnia (1-9% odczynu jądrowego w komórkach nowotworowych) i 9 dodatnich (>10% odczynu jądrowego w komórkach nowotworowych)) zostało wybarwionych przeciwciałami Monoclonal Rabbit Anti- Human ER α, Clone SP1 i ocenionych w trzech lokalizacjach. Ocenę przeprowadzono z uŝyciem metody opisanej (118835-003) 307726PL_004 p. 2/5
przez Diaz et al. Pomiędzy parą porównawczą kaŝdej lokalizacji uzyskano całkowitą zgodność równą 100% (95% C.I.: 78,2 100%). Tkanki prawidłowe: Tabela 1 zawiera podsumowanie immunoreaktywności ER α w zalecanym panelu tkanek prawidłowych. Wszystkie tkanki były utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie oraz wybarwione przeciwciałami Anti-Human Estrogen Receptor α (ER α), Clone SP1 zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w ulotce dołączonej do opakowania. Tabela 1: Podsumowanie immunoreaktywności ER α tkanek prawidłowych (6) Rodzaj tkanki (liczba testowanych przypadków) Nadnercza (3) (0/3) Szpik kostny (3) (0/3) Gruczoły sutkowe (2) Mózg/móŜdŜek (2) (0/2) Mózg/mózgowie (3) (0/3) Szyjka macicy (2) Szyjka macicy (2) Jelito grube (2) (0/2) Przełyk (3) (0/3) Serce (3) (0/3) Nerki (3) (0/3) Wątroba (3) (0/3) Płuca (3) (0/3) Komórki międzybłonka (2) (0/2) Nerwy obwodowe (2) (0/2) Jajniki (2) Trzustka (3) (0/3) Przytarczyce (3) (0/3) Przysadka mózgowa (3) (0/3) Gruczoł krokowy (2) (0/2) Ślinianki (3) (0/3) Mięśnie szkieletowe (3) (0/3) Skóra (3) (0/3) Jelito cienkie (3) (0/3) Śledziona (3) (0/3) śołądek (3) (0/3) Jądra (3) (0/3) Grasica (3) (0/3) Tarczyca (2) (0/2) Migdałki (3) (0/3) Macica (2) Składniki komórkowe dające dodatni odczyn (2/2) Nabłonek przewodowy (1/2) Błona śluzowa (nabłonek płaski) i zrąb (1/2) Warstwa podśluzówkowa (1/2) Zrąb (2/2) Nabłonek gruczołowy śluzówki macicy, zrąb i mięśniówka macicy Tkanki nieprawidłowe: Badania utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków tkankowych raka sutka wykazały, Ŝe przeciwciała anty-er α, Clone SP1, są uŝyteczne w prezentacji statusu ER α. Do określenia dodatniego/ujemnego statusu ER przyjęto punkt odcięcia na poziomie 1% komórek dodatnich (8). Bezpośrednie badania porównawcze przeciwciał anty-er α, Clone SP1 i anty-er, Clone 1D5 przeprowadzono na utrwalonych w formalinie, zatopionych w formalinie mikromacierzach tkankowych, zawierających 272 próbki raka sutka oraz 119 raków sutka. W badaniu mikromacierzy tkankowej, odsetek wyników dodatnich dla SP1 wyniósł 78,68% w porównaniu do 69,85% dla 1D5. W całym badaniu próbek raka sutka uzyskano odsetek wyników dodatnich równy 84,03% dla SP1 i 78,15% dla 1D5 (7). Istnieją doniesienia wskazujące, Ŝe uŝycie przeciwciał anty-er α, Clone SP1 pozwala na uzyskanie informacji prognostycznych odnośnie odpowiedzi na terapię hormonalną (8). Porównanie metod: Badanie przeprowadzono w dwóch lokalizacjach. Badanie ER α, SP1 przeprowadzono przy uŝyciu EnVision TM FLEX i oceniono z wykorzystaniem metody opisanej przez Diaz et al, a badanie ER 1D5/2-123 przeprowadzono przy uŝyciu ER/PR pharmdx Kit i oceniono na podstawie wytycznych dotyczących przeprowadzania oceny Allred, zamieszczonych w ulotce dołączonej do opakowania. Dane uzyskane w wyniku (118835-003) 307726PL_004 p. 3/5
porównania metod przedstawiono w Tabelach 2 i 3. Tabela 2: Zgodność w lokalizacji badania 1 ER Clone SP1 Składnik ER ER/PR pharmdx Dodatni Ujemny Razem Dodatni 69 6 75 Ujemny 0 34 34 Razem 69 40 109 Współczynnik zgodności wyników dodatnich = (69)/(69+0) = 69/69 = 1,0, przy przedziale ufności 95%, w zakresie 0,9479-1,0. Współczynnik zgodności wyników ujemnych = (34)/(6+34) = 34/40 = 0,85, przy przedziale ufności 95%, w zakresie 0,7016-0,9429. Całkowity współczynnik zgodności = (69+34)/(69+6+0+34) = 103/109 = 0,9449, przy przedziale ufności 95%, w zakresie 0,8840-0,9795. Tabela 3: Zgodność w lokalizacji badania 2 ER Clone SP1 Składnik ER ER/PR pharmdx Dodatni Ujemny Razem Dodatni 27 1 28 Ujemny 7 84 91 Razem 34 85 119 Współczynnik zgodności wyników dodatnich = (27)/(27+7) = 27/34 = 0,7941, przy przedziale ufności 95%, w zakresie 0,6210-0,9130. Współczynnik zgodności wyników ujemnych = (84)/(1+84) = 84/85 = 0,9882, przy przedziale ufności 95%, w zakresie 0,9362-0,9997. Całkowity współczynnik zgodności = (27+84)/(27+1+7+84) = 111/119 = 0,9328, przy przedziale ufności 95%, w zakresie 0,8718-0,9705. Parametry kliniczne: Do określenia parametrów klinicznych działania przeciwciał Dako Monoclonal Rabbit Anti- Human Estrogen Receptor α (ER α), Clone SP1 wykorzystano badanie opublikowane w Journal of Clinical Oncology. Status receptora estrogenowego oceniono na podstawie pobranych od pacjentów, utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie 4150 próbek raka sutka, z uŝyciem przeciwciał anty-er α, Clone SP1 i anty-er α, Clone 1D5. Do określenia dodatniego/ujemnego statusu ER przyjęto punkt odcięcia na poziomie 1% komórek dodatnich. Współczynnik wyników dodatnich dla SP1 wyniósł 69,5% w porównaniu do 63,1% dla 1D5. Średnia waŝona współczynnika dziesięcioletniego przeŝycia raka sutka (BCSS) w przypadku odsetka barwienia jądrowego komórek nowotworowych na poziomie nie mniej niŝ 1% jest równa 76,5% (95% C.I.: 73,9-79,0%) a w przypadku odsetka barwienia jądrowego komórek nowotworowych na poziomie poniŝej 1% jest równa 65% (95% C.I.: 62-68%) (8). (118835-003) 307726PL_004 p. 4/5
Piśmiennictwo 1. Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen receptor. Cell 1987;51:941-51. 2. Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. In: Diseases of the Breast. Harris JR et al. eds. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins 2000:471-85. 3. Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer: College of American Pathologists consensus statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000; 124:966-78. 4. Huang Z, Zhu W, Szekeres G, Xia H. Development of new rabbit monoclonal antibody to estrogen receptor: Immunohistochemical assessment on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2005;13:91-5 5. Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing testing accuracy. [review] Adv Anat Pathol. 2005;12:10-19. 6. M3634 IHC003-149 Report on file. 7. Treaba DO, Hing AW, Goldstein LC, Barry TS, Kandalaft P, Gilks CB, et al. Significantly improved sensitivity for ER detection in breast cancer using a new rabbit monoclonal anti-er antibody (SP1). Modern Pathology 2005; 18, Suppl.1,p. 53A 8. Cheang MCU, Treaba DO, Speers CH, Olivotto IA, Bajdik CD, et al. Immunohistochemical detection using the new rabbit monoclonal antibody SP1 of estrogen receptor in breast cancer is superior to mouse monoclonal antibody 1D5 in predicting survival. J Clin Oncol 2006;24:5637-44. Wydanie 03/12 (118835-003) 307726PL_004 p. 5/5