Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 FUNGISTATYCZNE ODDZIAŁYWANIE SZCZEPU BACILLUS COAGULANS W PORÓWNANIU Z ODDZIAŁYWANIEM WYBRANYCH FUNGICYDÓW BARBARA STACHOWIAK 1, KRYSTYNA TROJANOWSKA 2, KRZYSZTOF GULEWICZ 3 Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego 1 Instytut Technologii Żywności Pochodzenia Roślinnego Wojska Polskiego 31, 60-624 Poznań bstach@au.poznan.pl 2 Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Wojska Polskiego 48, 60-627 Poznań 3 Polska Akademia Nauk Instytut Chemii Bioorganicznej Noskowskiego 12/14, 61-704 Poznań I. WSTĘP W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie możliwością wykorzystania w ochronie roślin niepatogennych mikroorganizmów, izolowanych ze środowisk naturalnych. Wśród nich, na szczególną uwagę zasługują tlenowe laseczki Bacillus, wykazujące dużą aktywność metaboliczną. Wiele gatunków z rodzaju Bacillus syntetyzuje pozakomórkowo antybiotyki, enzymy oraz inne substancje zdolne do rozkładu ściany komórkowej grzyba, np. glikoproteiny o małej masie cząsteczkowej (Phae i wsp. 1990; Podile i Prakash 1996; Folkman i wsp. 2003). Laseczki te wytwarzają również przetrwalniki oporne na niską i wysoką temperaturę, skrajne wartości ph, suszę i inne niekorzystne czynniki fizykochemiczne. W większości ich komórki są urzęsione, dzięki czemu mogą one łatwiej i szybciej penetrować środowisko naturalne (Święcicka i Hauschild 1996). Te zalety wyróżniają bakterie Bacillus wśród innych zasiedlających glebę mikroorganizmów. Celem badań było porównanie fungistatycznego oddziaływania szczepu Bacillus coagulans (nr 6) z oddziaływaniem wybranych fungicydów. II. MATERIAŁ I METODY Mikroorganizmy Szczep testowy. W doświadczeniach wykorzystano szczep B. coagulans (nr 6) wyizolowany z biologicznie aktywnych kompostów łubinowych (Gulewicz i Trojanowska 1995). Szczep ten wykazywał wysoką aktywność fungistatyczną (Czaczyk i wsp. 2001).
Fungistatyczne oddziaływanie szczepu... 339 Podłoże wzrostowe dla szczepu testowego stanowił 10% wyciąg marchwiowy wzbogacony dodatkiem glukozy, peptonu i chlorku sodu. Szczepy wskaźnikowe. Fungistatyczne oddziaływanie szczepu B. coagulans (nr 6) oraz wybranych fungicydów sprawdzano wobec następujących grzybów wskaźnikowych: Fusarium culmorum 724, Rhizoctonia solani 635, Sclerotinia sclerotiorum 648, Trichothecium roseum 635. Szczepy te pochodziły z Banku Patogenów Roślin Instytutu Ochrony Roślin w Poznaniu. Hodowle płytkowe grzybów wskaźnikowych prowadzono na podłożu Czapka, aż do uzyskania obfitego wzrostu grzybni (około 10 dni). Następnie wycinano korkoborem koreczki z grzybnią w celu wykonania oznaczeń. Fungicydy W badaniach wykorzystano pięć fungicydów: Topsin M 70 WP (koncentrat 70% tiofanatu metylu), Funaben T (proszek 20% karbendazymu i 45% tiramu), Ridomil MZ 72 WP (proszek 8% metalaksylu i 64% mankozebu), Previcur 607 SL (koncentrat propamokarb w postaci kompleksu z HCl 607 g/l), Ronilan (koncentrat winchlozolina 500 g/l). Z w/w fungicydów przygotowywano wodne zawiesiny, które wprowadzano do podłoża Czapka. Metoda oznaczania aktywności fungistatycznej szczepu B. coagulans (nr 6) i badanych fungicydów Aktywność fungistatyczną oznaczano metodą płytkową opisaną przez Boreckiego (1984). Wszystkie oznaczenia wykonano w trzech powtórzeniach. W hodowlach testowych do podłoża Czapka wprowadzano 24-godzinną hodowlę laseczek B. coagulans o gęstości 6,3 H 10 9 kom./ml w ilości 10% [v/v] lub wodne zawiesiny fungicydów. Kontrolę stanowiły hodowle grzybów wskaźnikowych na podłożach, które zamiast hodowli laseczek lub zawiesiny fungicydu zawierały wodę destylowaną. Wszystkie hodowle płytkowe prowadzono w temperaturze 30 C przez 14 dni. Po 7 i 14 dobach wyznaczano procent zahamowania wzrostu grzybów wskaźnikowych według następującego wzoru: Procent zahamowania wzrostu = (K 0 F/K 0 )100; gdzie: K 0 średnica hodowli w kombinacji kontrolnej, F średnica hodowli w kombinacji testowej. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Oddziaływanie szczepu B. coagulans oraz wybranych fungicydów na wzrost grzybów wskaźnikowych przedstawiono w tabelach 1. i 2. Najbardziej wrażliwe na oddziaływanie szczepu B. coagulans okazały się T. roseum, S. sclerotiorum i F. culmorum (tab. 1). Bez względu na ilość wprowadzonej hodowli laseczek do podłoża Czapka i czas inkubacji, wzrost T. roseum i S. sclerotiorum w hodowlach płytkowych zahamowany był całkowicie, a w przypadku F. culmorum w 86% w porównaniu z kontrolą. Najmniej wrażliwym na oddziaływanie szczepu B. coagulans okazał się grzyb Rhizoctonia solani. Jego wzrost zależał od ilości hodowli laseczek wprowadzonej do podłoża Czapka, natomiast nie zależał od czasu inkubacji. W hodowlach płytkowych zawierających % dodatek hodowli B. coagulans w podłożu Czapka [v/v] wzrost grzyba
340 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 zahamowany był jedynie o 20% w porównaniu z kontrolą. W przypadku dodatku hodowli bakteryjnej w ilości 1 10% zahamowanie wzrostu R. solani przekraczało 50%. Tabela 1. Wpływ hodowli Bacillus coagulans (nr 6) na wzrost grzybów wskaźnikowych Table 1. The influence of Bacillus coagulans (No. 6) on growth of indicator fungi Dodatek hodowli szczepu Bacillus coagulans do podłoża Czapka Addition of culture of Bacillus coagulans strain into Czapek medium 1,0 5,0 10,0 Czas inkubacji [dni] Incubation time [days] Zahamowanie wzrostu grzyba wskaźnikowego [%] Growth inhibition of indicator fungi [%] T. roseum R. solani S. sclerotiorum F. culmorum 7 100 20 100 86 14 100 20 100 86 7 100 54 100 86 14 100 54 100 86 7 100 54 100 86 14 100 54 100 86 7 100 60 100 86 14 100 60 100 86 Najsilniejsze oddziaływanie w stosunku do grzybów wskaźnikowych wykazywały trzy spośród pięciu testowanych fungicydów: Topsin M 70 WP, Ridomil MZ 72 oraz Funaben T (tab. 2). Hamowały one całkowicie wzrost wszystkich badanych grzybów wskaźnikowych bez względu na zastosowane stężenie i czas inkubacji. Tabela 2. Wpływ wybranych fungicydów na wzrost grzybów wskaźnikowych Table 2. The influence of selected fungicides on growth of indicator fungi Fungicyd Fungicide Stężenie fungicydu w podłożu Czapka Concentration of fungicide in Czapek medium [%v/v] Czas inkubacji [dni] Incubation time [days] Zahamowanie wzrostu grzyba wskaźnikowego [%] Growth inhibition of indicator fungi [%] T. roseum R. solani S. sclerotiorum F. culmorum 1 2 3 4 5 6 7 Ridomil MZ 72 WP 0,3 0,4
Fungistatyczne oddziaływanie szczepu... 341 1 2 3 4 5 6 7 Funaben T Topsin M 70 WP Ronila n Previcur 607 SL 0,2 0,5 0,05 0,25 0,5 7 100 50 100 50 14 100 0 100 20 7 66 57 77 54 14 54 37 63 0 7 89 63 86 57 14 69 46 77 40 T. roseum i S. sclerotiorum okazały się bardzo wrażliwe na oddziaływanie fungicydów: Ronilan i Previcur 607 SL, szczególnie gdy stężenie tego ostatniego w podłożu Czapka wynosiło 0,5% [v/v]. Oba fungicydy znacznie słabiej hamowały wzrost pozostałych grzybów wskaźnikowych. W hodowli R. solani z % dodatkiem fungicydu Ronilan po 14 dniach grzybnia całkowicie pokryła podłoże. Podobną sytuację obserwowano w przypadku F. culmorum rosnącym na podłożu z 0,25% dodatkiem fungicydu Previcur 607 SL. Pomimo wysokiej skuteczności fungicydów: Ridomil MZ 72 WP, Funaben T i Topsin M 70 WP w hamowaniu wzrostu wszystkich grzybów wskaźnikowych, należy podkreślić wysoką aktywność fungistatyczną szczepu B. coagulans (nr 6). Podobnie jak w/w fungicydy hamował on całkowicie wzrost T. roseum i S. sclerotiorum, a jego antagonistyczne oddziaływanie na wzrost badanych grzybów wskaźnikowych było silniejsze w porównaniu z fungicydami: Ronilan i Previcur 607 SL. IV. LITERATURA Borecki Z. 1984. Fungicydy Stosowane w Ochronie Roślin. PWN, Warszawa: 37 43. Czaczyk K., Stachowiak B., Trojanowska K. 2001. Antifungal activity of Bacillus sp. isolated from compost. Folia Microbiol. 45: 552 554. Folkman W., Lisiecka B., Stachowiak B., Trojanowska K., Gulewicz K. 2003. Studies on fungistatic activity of Bacillus coagulans against Trichothecium roseum and characteristics of the bacterial metabolites. J. Plant Protect. Res. 43: 121 132. Gulewicz K., Trojanowska K. 1995. Suppressive effect of preparations obtained from bitter lupin straw against plant pathogenic fungi. Sci. Legumes 2: 141 148.
342 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 Phae C.G., Sasaki M., Shoda M., Kubota H. 1990. Characteristics of Bacillus subtilis isolated from composts suppressing phytopathogenic microorganisms. Soil Sci. Nutr. 36: 576 586. Podile A.R., Prakash A.P. 1996. Lysis and biological control of Aspergillus niger by Bacillus subtilis AF1. Can. J. Microbiol. 42: 533 538. Święcicka I., Hauschild T. 1996. Rodzaj Bacillus występowanie i znaczenie w środowiskach naturalnych. Post. Mikrobiol. 35: 27 41. BARBARA STACHOWIAK, KRYSTYNA TROJANOWSKA, KRZYSZTOF GULEWICZ FUNGISTATIC ACTIVITY OF BACILLUS COAGULANS STRAIN IN COMPARISON TO ACTIVITY OF SELECTED FUNGICIDES SUMMARY The aim of this study was to compare fungistatic activity of Bacillus coagulans (No. 6) strain with activity of commonly applied fungicides on plant pathogens growth: Trichothecium roseum, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani and Fusarium culmormu. Apart from the high effectiveness of Ridomil, Funaben and Topsin in inhibition of all indicator fungi, the high fungistatic activity of Bacillus coagulans (No. 6) strain was also observed. It totally inhibited the growth of Trichothecium roseum and Sclerotinia sclerotiorum. Moreover its antagonistic activity against other indicator fungi was stronger as compared to Ronilan and Previcur 607 SL. Key words: Bacillus sp., biological activity, plant pathogens, fungicides