Wpływ przygotowania próbki na wynik pomiaru

Wpływ przygotowania próbki na wynik pomiaru Waldemar Korol, Jolanta Rubaj, Grażyna Bielecka, Sławomir Walczyński Instytut Zootechniki-PIB, Krajowe Laboratorium Pasz w Lublinie

Plan prezentacji przygotowanie próbki a wynik pomiaru na przykładzie pasz - Cel badań a wynik pomiaru (X±U) (raport SANCO) - Czynniki wpływające na miarodajność wyniku pomiaru: - pobieranie próbek - heterogeniczność (przykłady) - przygotowanie próbek heterogeniczność (przykłady) - ekstrakcja analitu i pomiar (przykłady) - Cykl pomiarowy od zlecenia do decyzji podejście procesowe (nowela ISO/IEC 1705) - Poprawność postępowania walidacyjnego (sprawdzającego) - Poprawność (miarodajność) niepewności

Przedstawianie wyników cel badań X±U (k = ) Ocena zgodności w obszarze regulowanym tak. Ocena zgodności z wymaganiami określonymi w przepisach prawa (np. dotyczącymi wartości progowych: (i) maksymalne zawartości substancji niepożądanych w żywności, paszach; (ii) maksymalne (minimalne) zawartości dodatków w mieszankach paszowych, żywności), (iii) deklaracja producenta na etykiecie (dodatki).

Przedstawianie wyników cel badań X±U (k = )? Ocena spełnienia wymagań producenta, zmienność produktu w czasie SD(ip) (odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna Rw) W przypadku oceny produktu, np. przy sprawdzaniu powtarzalności wybranych cech wyrobu w czasie, laboratorium powinno wykazać, że parametry metody/procedury są dostosowane do celu badań, np. dopuszczalne odchylenie badanego analitu do 5% nie może być badane przy wykorzystaniu metody o odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej 10% dla tego analitu.

Przedstawianie wyników cel badań X±U (k = )? Badania naukowe SD (odchylenie standardowe) W badaniach naukowych sprawdzana jest często różnica pomiędzy postępowaniem A (próbki A) a postępowaniem B (próbki B) i wtedy potrzebne jest tylko odchylenie standardowe (powtarzalność, SD) do oceny istotności różnic pomiędzy postępowaniami.

Przedstawianie wyników regulacje prawne, ocena zgodności, SANCO Na interpretację wyników i ocenę zgodności z wymaganiami wpływają następujące czynniki: - liczba cyfr znaczących - niepewność pomiaru - korekta odzysku Specyfikacja (wymaganie w zakresie max zawartości niezależnie od jednostek) Zakres zadowalających wyników 1 (Cd, As) od 0 do 1,4 1,0 od 0 do 1,04 1,00 od 0 do 1,004

Przykład 1. Interpretacji wyników badań zawartości azotynów DP = 15 mg/kg; odzysk 95%; U=15% (zalecenie SANCO)

Przykład 1. interpretacji wyników badań zawartości azotynów DP = 15 mg/kg, R=95%, U=15% (zalecenie SANCO; raport Eurachem 007) Sytuacja I 0,0 mg/kg (100% odzysk) 1,0 3, mg/kg - Wartości prawdziwe zawierają się w przedziale od 17,8 do 4, mg/kg i są wyższe od dopuszczalnego poziomu DP. Brak wątpliwości. Produkt niezgodny z przepisami. Sytuacja II 16,0 mg/kg (100% odzysk) 16,8,5 mg/kg -Wartość średnia powyżej DP lecz dolna granica przedziału niepewności poniżej DP. Zgodnie z nowymi wymaganiami nie można zakwestionować produktu. Sytuacja III 13,0 mg/kg (100% odzysk) 13,7,1 mg/kg Wartość średnia poniżej DP lecz górna granica przedziału niepewności powyżej DP. Zgodnie z nowymi wymaganiami nie można zakwestionować produktu. Sytuacja IV 10,0 mg/kg (100% odzysk) 10,5 1,6 mg/kg wartość średnia i przedział niepewności poniżej DP. Badany produkt spełnia wymagania.

Przykład Interpretacja wyników badania fluoru w fosforanie Fluor w fosforanie 300 ± 30 mg/kg MZ= 000 mg/kg. Niezgodność? Woda 1,5% (w dyr. 00/3/WE i rozp. MRiRW - MZ 1% wody 88% s.m.) Po przeliczeniu na 1% wody w fosforanie (88% s.m.) wynik 055 ± 05 mg/kg Produkt zgodny!

Czynniki wpływające na miarodajność wyniku pomiaru - pobieranie próbek Pobieranie próbek ma duży wpływ na miarodajność wyników pomiarów - Próbki pobiera laboratorium (akredytacja) - Próbki pobiera klient i wysyła do laboratorium - Dane dotyczące pobrania próbki powinny być podane w sprawozdaniu

Pobieranie próbek laboratorium Laboratorium powinno mieć procedury dotyczące zapisywania niezbędnych danych i czynności związanych z pobieraniem próbek, które stanowią integralną część realizowanego badania. Zapisy powinny obejmować: (i) zastosowaną procedurę pobierania próbek; (ii) identyfikację pobierającego próbki; (iii) rodzaj i ilość materiału/wyrobu z którego pobierana jest próbka; (iv) miejsce i czas pobrania próbki, inne warunki które mogły wpłynąć na pobranie próbki. Przykładem zapisów jest protokół pobrania próbki załączany do oficjalnych procedur próbkobrania, np. do rozp. Komisji 691/013. laboratoryjna, wymaga zwykle dalszego postępowania, jak podział, rozdrobnienie, zabezpieczenie (lab).

Pobieranie próbek pasze, żywność Rozporządzenie Komisji nr 691/013 nie wymaga określania niepewności pobierania próbki paszy; stwierdza, że próbka pobrana zgodnie z tym rozp. jest reprezentatywna dla ocenianej partii Wniosek Niepewność wyniku badania paszy nie musi zawierać niepewności pobierania próbki jeżeli była ona pobrana zgodnie z rozporządzeniem Komisji (UE) nr 691/013.

Pobieranie próbek pasz wg rozp. 691/013 Stosowany zapis w sprawozdaniach z badań (lab urzędowego nadzoru): niepewność wyniku nie zawiera niepewności pobierania próbki, zalecony przez PCA dokumentem DAB-07, nie jest brany pod uwagę przez PIW. Uzasadnienie: Przepisy i wymagania UE mówiące o niepewności wyniku badanego składnika paszy (żywności), dotyczą tylko niepewności pomiaru i, w uzasadnionych przypadkach (niejednorodność), niepewności przygotowania próbki (KE - Franz Verstrate, 014).

Szacowanie niepewności pomiaru Przykład: Standardowe niepewności pobierania próbek u s (%) składników mineralnych w sypkiej MPU oraz niepewności rozszerzone U uwzględniające składową przygotowania próbki (U p+a ) i niepewność całkowitą U T Składnik mineralny MPU sypka (10%) u s U U p+a U T = U s+p+a Wapń 4,9 7,1 9,1 13,4 Chlorki 3, 10,0 1,4 13,9 Cynk,9 10,0 14, 15, Miedź 5,1 15,0 0,0,4

Przygotowanie próbek badanie, walidacja Sposób postępowania z próbkami badanymi rutynowo powinien być taki sam jak przy walidacji opracowanej przez laboratorium procedury badawczej lub przy sprawdzaniu metody normatywnej lub oficjalnej.

Przygotowanie próbek Badane próbki stałe (sypkie - wieloskładnikowe mieszaniny) charakteryzują się skłonnością do segregacji. Dobrą metodą poprawy homogeniczności materiałów jest redukcja wielkości cząstek poprzez rozdrobnienie a następnie wymieszanie. Problem segregacja składników produktu podczas mieszania, zależnie od produktu, rodzaju mieszarki. Szeroki przegląd postępowania na etapie przygotowania próbki pasz, zależnie od właściwości fizykochemicznych materiału, uwzględniający redukcję wielkości cząstek materiału, stosowane rozdrabniacze, sposoby wydzielenia z próbki laboratoryjnej próbki do badań (50-100 g), stosowane dzielniki próbek podano w normie PN EN-ISO 6498

PN-EN ISO 6498:01P Pasze Wytyczne do przygotowania próbki (PL od 014 r.)

Jak określić niepewność przygotowania próbki laboratoryjnej? Niehomogeniczność próbki laboratoryjnej ocena zmienności zawartości składnika w próbkach przed mieszaniem rozkład losowy mieszanina idealna Współczynnik zmienności (CV h+a ) wyników badania składnika w kilku próbkach (n 6), o masie około 100 g, będący miarę niehomogeniczności (heterogeniczności) próbki, zawiera dwie zmienne, zmienną analityczną (CV a ) i zmienną techniczną (CV h ). Miarą heterogeniczności jest tylko zmienna techniczna (CV h ), którą można uznać za niepewność przygotowania próbki laboratoryjnej w budżecie niepewności pomiaru

Heterogeniczność próbki laboratoryjnej a niepewność przygotowania próbki CV h a CV h CV a CV h CV h a CV a Korol W., Bielecka G., Rubaj J., Walczyński S. (015) Uncertainty from sample preparation in the laboratory on the example of various feeds. Accred Qual Asur, 0:61-66 DOI: 10.1007/s00769-014-1096-x

Postępowanie z próbkami laboratoryjnymi Współczynnik zmienności technicznej CV h jest miarą niepewności przygotowania próbki i może być uznany jako standardowa niepewność przygotowania próbki (CV h = u h / n; gdzie n = liczna próbek wyodrębnionych z próbki laboratoryjnej) w budżecie niepewności pomiaru u h+a uwzględniającym niepewność przygotowania próbki laboratoryjnej i niepewność postępowania analitycznego i pomiaru, obliczonym wg wzoru: u h a u h n w którym u a jest niepewnością postępowania analitycznego i pomiaru. Niepewność rozszerzoną U H+A dla współczynnika rozszerzenia k= (P=95%) obliczano jak następuje: U H+A = u h+a. u a

Rozdzielacze laboratoryjne i zestaw sit (pomiar wielkości cząstek) Zestaw sit Rozdzielacz szczelinowy Rozdzielacz obrotowy

Sposób oceny niepewności przygotowania próbki do badań Se w MPU sypka (m=0,5 g)- przykład obliczeń Wyszczególnienie źródło danych Współczynnik zmienności CV h+a = 1,09% (dane lab) Powtarzalność obliczona z rozstępu wg Nortest (n=1) CV a = 3,74% (dane lab szablon Excel) Współczynnik zmienności technicznej CV h = 11,5% - wzór Standardowa niepewność badania Se (CRM); u = 7,5%; U (k=)=15,0% Standardowa niepewność badania Se z niepewnością przygotowania próbki w laboratorium u h+a = 13,7% (n=1); u h+a = 8,85% (n=6); wzór Niepewność rozszerzona U h+a = 7,4% (n=1); U h+a = 17,7% (n=6) CV u h h a CV u h a h n CV u a a

Obliczanie powtarzalności z rozstępu (Nordtest: 008 - Biuletyn POLLAB /51/008) 3 Powtarzalność obliczamy z rozstępu pomiędzy powtórzeniami: (X 1 X...X n ) Odchylenie standardowe, s obliczamy wg wzoru: s rozstep d gdzie d jest zależne od liczby powtórzeń (n)

Obliczanie powtarzalności z rozstępu (Nordtest: 008 - Biuletyn POLLAB /51/008) 4 Liczba powtórzeń Czynnik, d n= 1,18 n=3 1,693 n=4,059 n=5,36 n=6,534 n=7,704 n=8,847 n=9,970 n=10 3,078

5 Obliczanie powtarzalności z rozstępu (Nordtest: 008 - Biuletyn POLLAB /51/008)- przykład Ca w MPP gran (m=5 g), g/kg X1 X ŚREDNIA d r% 1 8,7 8,68 8,475-0,41 4,8378 8,51 8,31 8,41 0,,3781 3 8, 8,36 8,8-0,16 1,934 4 8,33 8,6 8,95 0,07 0,8439 5 8,7 8,51 8,605 0,19,08 6 8,13 8,1 8,115 0,03 0,3697 SD = 0,1711 CV m =,05% X = 8,3633,095 d = 1,18 S= 1,857

Ocena heterogeniczności próbki laboratoryjnej i niepewności przygotowania próbki w laboratorium na przykładzie witaminy A w sypkiej MPU Wyszczególnienie Współczynnik zmienności (n=1) CV h+a = 1,7% Powtarzalność obliczona z rozstępu wg [11] (n=6) CV a = 3,66% Współczynnik zmienności technicznej (heterogeniczność) i niepewności przygotowania próbki CV h = 11,8% = u h Standardowa niepewność badania witaminy A z budżetu niepewności u = 9,7%; U=19,4% Standardowa niepewność badania wit. A z niepewnością przygotowania próbki w laboratorium u h+a = 15,3% (n=1); u h+a = 10,85% (n=6); Niepewność rozszerzona U H+A = 30,6% (n=1); U H+A = 1,7% (n=6); Sposób obliczenia - wzory Dane z laboratorium - szablon Excel Dane z laboratorium - szablon Excel Wzór: Dane z walidacji metody Wzór: 15,3% x = 30,6% (n=1) 10,85% x = 1,7% (n=6)

Przykład. Wpływ homogeniczności na niepewność przygotowania próbki laboratoryjnej wybranych składników pokarmowych i dodatków paszowych w mieszance paszowej sypkiej i granulowanej Składnik paszy m, g X g/kg mg/k g CV h % MPU- sypka U % U H+A (n=1) % U H+A (n=6) % X g/kg mg/k g Granulowana m-ka paszowa CV h % U % U H+A (n=1) % U H+A (n=6) % Białko* 0,5 88 1,53 3,0 4,3 3,5 196 1,33 4,0 4,8 4,14 Popiół* 5 36,67 4,0 6,7 4,55 46,9 0,98 4, 4,6 4,7 Wapń* 5 15 3,59 9,6 1,0 10,0 8,36 1,47 9,6 10,0 9,67 Sód* 5 4,71 4,65 11,6 14,9 1, 1,50 1,53 11,6 1,0 11,7 Chlorki* 6,59 3,45 8,4 10,9 8,85 3,16 0,9 9,7 9,9 9,73 Cynk** 5 33 5,0 10,4 14,5 11, 198,5 10,4 11,6 10,6 Selen** 0,5 0,89 11,5 15,0 7,4 17,7 0,8 3,55 15,0 16,6 15,3 Molibd.** 0,5,40 11,5 0,0 30,5,1 1,86 5,9 0,0,6 0,5 Wit. A** 0 7,0 11,8 19,4 30,6 1,7,61 3,39 0,0 1,1 0, Wit. E** 0 37 1,96 13,1 13,6 13, 61,5 5,50 17,1 0,3 17,7 *g/kg; **mg/kg; Wit. A - w przeliczeniu na retinol; X zawartość; U niepewność rozszerzona (k=); odważka analityczna, g

Przykład. Wpływ rozdrobnienia premiksu na jednorodność (homogeniczność) i niepewność pomiaru Składnik premiksu Odw anal g Premiks bez rozdrab. a śred. cząstek 416 μm X g/kg CV h % U % U H+A % Premiks rozdrobniony, śred. cząstek 60 μm X g/kg CV h % Wapń 1 175 5.77 7.4 13.7 170 0.70 7.4 7.6 U % U H+A % Żelazo 1 13. 5.76 9.4 14.9 13. 1.67 9.4 10.0 Mangan 1 14. 7.07 10.4 17.6 14.0.56 10.4 11.6 Cynk 1 9. 10.1 10.0.5 9.85 3.88 10.0 1.7 Miedź 1 1.4 10.1 10.6.8 1.44 3.17 10.6 1.3 U niepewność rozszerzona (k=) wg GUM; CV h wsp. zmienności technicznej; U H+A niep. rozszerzona (k=) z niep. przygotowania próbki; a premiks o potwierdzonej homogeniczności w badaniach chlorków

Przygotowanie próbki ważny element cyklu pomiarowego Badanie lab ~ 500 g Ø < 6 mm, podział ~ 50-100 g rozdrabnianie Odważka analityczna, 0,-0 g Ekstrakcja, oczyszczanie, roztwarzanie Wynik, ocena X ± U (k=) Roztwór, Pomiar stężenia analitu

Cykl pomiarowy prezentowany na 5-tych Warsztatach Eurachem w Lizbonie, maj 014 wg dr V. Barwick LGC Standards, Wielka Brytania [Cykl postępowania analitycznego str. 67 Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów analitycznych, Red. P. Konieczka, J. Namieśnik, WNT 007]

Pomiar analityczny Pomiar analityczny (rozdział chromatograficzny, pomiar spektrometryczny, potencjometryczny, pomiar masy, objętości) nie jest krytycznym elementem cyklu pomiarowego. Możliwe źródła błędów i niepewności: - pobieranie próbek - przygotowanie próbek (heterogeniczność) - zanieczyszczanie próbek (cross-contamination) - Nieodpowiednia metoda (zależność analitu od metody - analiza podstawowa pasz, żywności: np. woda) - niecałkowita ekstrakcja, błędy na etapie oczyszczania (SPE) - błędny odczyt, wpływ warunków zewnętrznych (błędy osobowe) - poprawność wzorców i materiałów odniesienia - błędy przypadkowe (powtarzalność, precyzja pośrednia) - inne...

Niehomogeniczność - jak rozwiązać problem na etapie walidacji? Laboratorium powinno dążyć do poznania właściwości fizykochemicznych badanych materiałów i produktów, zwłaszcza niejednorodności (niehomogeniczność) analitów w badanym materiale / produkcie i uwzględnić sprawdzenie niehomogeniczności podczas walidacji metody.

Wykorzystanie sposobu przygotowania próbki laboratoryjnej podczas walidacji metody (końcowa) laboratoryjna (min 0,5 kg) CV h a CV h CV a U H+A = u h+a

Uwzględnienie sposobu przygotowania próbki laboratoryjnej podczas walidacji metody (końcowa) laboratoryjna (min 0,5 kg) R1 R R1 R R1 R R1 R R1 R R1 R R1 R R1 R CV h a CV h CV a U H+A = u h+a

Proponowany sposób szacowania niepewności podczas walidacji uwzględniający niepewność przygotowania próbki końcowa (laboratoryjna) (min 0.5 kg) R1,R,R3, R4,R5,R6, R7,R8... R1 R R1 R R1 R R1 R R1 R R1 R R1 R Powtarzalność (1 dzień, 1 oper.) Precyzja pośrednia? (kilka dni, oper.) Precyzja pośrednia (odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna) uwzględnia techniczną zmienność próbki

Szacowanie niepewności ocena podejść 1. Podejście modelowe wg GUM - budżetu składowych niepewności - przewodnik GUM; przewodnik EURACHEM /CITAC (III wydanie 01). Podejścia praktyczne CRM, PT/ILC - Zalety PT/ILC - duże podobieństwo materiałów testowych do rzeczywistych próbek badanych rutynowo w laboratorium.

Przykład PT Pasze 013 (org. KLP Lublin) MPP gran. (M/13). Masa próbki ~ 0,5 kg - laboratorium uczestniczące w PT samo rozdziela i rozdrabnia próbkę

Ocena poprawności niepewności & PT Wyniki badania miedzi (X±U, mg/kg) w próbce 38 MPP/13, X=19,5 mg/kg; H=1,9 38

Ocena poprawności niepewności - wyniki badania wilgotności (X±U, g/100g) w próbce M/14.

Wyniki badania białka ogólnego (X±U, g/100g) w próbce M/13; X=14,45 g/100g; SD=0,165; H=0,35 U= x SD = ±0,33 g/100g (±,8%) niepewność rozszerzona z PT z niepewnością przygotowania próbki

Wyniki szacowania energii metabolicznej EM N (X±U, MJ/kg) w próbce M/14. WP=9,9 MJ/kg SD=0,13 MJ/kg ROZPORZĄDZENIE KOMISJI nr 15/009 ±0,4 MJ/kg Nr laborat orium Wartość z-score u U=xu 10, 1,9 0,15 0,3 7 9,9 0,00 0,5 0,5 8 9,8-1,08 - - 9 9,9 0,00 0,5 1,0 10 9,9 0,00 0, 0,4 1 9,9 0,00 1,,3 17 10,1 1,17 0,3 0,6 19 9,8-1,08 0, 0,4 3 10,0 0,4 0, 0,4

Szacowanie obciążenia i niepewności pomiaru na podstawie wyników PT (podejście doświadczalne mlab) RT Eurolab Nr 1/007 (Biuletyn POLLAB Nr 1/48/007) Niezbędne dane: odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna s (precyzja pośrednia) obciążenie (bias) b na podstawie badania CRM lub PT (Nordtest TR 537, 01) ( s PT / n niepewność obciążenia) u PT niepewność wartości przypisanej, obliczona wg ISO 1358 (u PT =1.5 s PT / n) u s b b u PT s PT n Δ = ( bias i n )

Szacowanie niepewności na podstawie wyników PT/ILC podejście doświadczalne mlab Nordtest TR 537, Version 3, 008 (Biuletyn POLLAB Nr /51/008) Niezbędne dane: odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna s obciążenie (bias) b na podstawie badania PT (npt 6; nlab 30?) u s b b u PT Δ = ( bias i n )

Ocena precyzji PT i wykorzystanie wyników badania niektórych dodatków paszowych w paszach do obliczenia obciążenia (b,%) i niepewności pomiaru (u,%) Dodatek, zawartość średnia Wit A, n n H s w Eurolab TR 007 Nordtest TR 008 PT lab /PT śred. (%) b (%) u (%) U (%) b (%) u (%) U (%) 9 8 1,45 3,4 8,9 9,5 19,0 7,9 8,6 17, 000 jm/g Wit E, 8 g/kg 9 8 1,93 1,6 7,3 7,5 15,0 6,3 6,5 13,0 Liz, 19 g/kg 1 9 0,77 3,1 3,7 4,8 9,6 3,5 4,6 9, Met, 7 g/kg 9 8 1,01 5,4 5,6 7,7 15,4 5, 7,5 15,0 Tre, 1 g/kg 16 7 0,76,7 4,1 4,9 9,8 3,9 4,7 9,4 Mocznik, 38 g/kg 4 7 1,05,5 5,6 6,1 1, 5,4 5,9 11,8 44

Jednolity system szacowania niepewności 45dla laboratoriów urzędowego nadzoru Wytyczne EA-04/16 - dopuszczają wykorzystanie SD odtwarzalności z PT jako złożonej niepewności standardowej u (U = x u). Wartości SD z PT (s PT ), w których brały udział urzędowe laboratoria stosujące te same oficjalne metody mogą być wykorzystane do budowy jednolitego systemu szacowania niepewności pomiarów i budowy spójnego systemu interpretacji wyników (U = s PT ), (PT organizowane przez VDLUFA: próbka nie rozdrobniona 0,5 kg; s PT uwzględnia błędy przygotowania próbki przez laboratoria)

Podsumowanie Przygotowanie próbki ma istotny wpływ na wynik pomiaru Problem niehomogeniczności powinien być rozwiązany na etapie walidacji procedury badawczej lub weryfikacji (sprawdzania) metody normatywnej (oficjalnej) Niepewność przygotowania próbki stanowi istotną składową w budżecie niepewności pomiaru, zależnie od rodzaju matrycy i metody badania (masa odważki analitycznej)

Dziękuję za uwagę Pytania?