Dobór warunków dla poprawnego pomiaru widm emisji i wydajności kwantowych emisji

Dobór warunków dla poprawnego pomiaru widm emisji i wydajności kwantowych emisji Badania emisyjne są niezwykle cennym źródłem danych o właściwościach cząsteczek i kompleksów (różnego rodzaju), które one tworzą w stanach wzbudzonych. Ze względu na wyjątkowo dużą czułość metod emisyjnych są one szeroko wykorzystywane w analizie chemicznej. W wielu różnych badaniach fizykochemicznych, w tym układów biologicznych, spektroskopia emisyjna jest niezastąpioną metodą badawczą. Szczególnie duże możliwości badań zapewnia jednoczesne zastosowanie spektroskopii absorpcyjnej i emisyjnej. Metodyka badań emisyjnych jest jednak znacznie bardziej złożona aniżeli badań absorpcyjnych. Najważniejsze czynniki, na które należy zwrócić uwagę w pomiarach emisyjnych zostaną przedstawione poniżej. Szczególnie ważny wpływ na poprawność prowadzonych badań emisyjnych mają warunki wzbudzenia próbki i obserwacji jej emisji. Są one bezpośrednio związane z właściwościami absorpcyjnymi i emisyjnymi badanych związków. Dobrze ilustrują je przedstawione poniżej wyniki badań emisyjnych porfiryn. Z uwagi na własności spektroskopowe porfiryn, na mierzone ich widmo emisji i wyznaczane wydajności kwantowe fluorescencji silnie wpływają tzw. filtry wewnętrzne zarówno pierwszego, jak i z większym wkładem drugiego rodzaju. Dotyczą one rozkładu wzbudzonych cząsteczek w kuwecie pomiarowej oraz nakładaniu się ich widm absorpcji i emisji. Nieznajomość udziału tychże filtrów wewnętrznych na widmo emisji powoduje uzyskanie błędnych danych spektroskopowych i fotofizycznych. Filtr wewnętrzny pierwszego rodzaju Podczas stacjonarnych pomiarów emisyjnych zazwyczaj próbkę wzbudza się długością fali, odpowiadającą maksimum długofalowego pasma absorpcji. Ma to na celu poprzez dużą wartość zaabsorbowanego światła, uzyskanie dużej intensywności emitowanego światła, zgodnie z zależnością I em ~ I abs. Niestety proporcjonalność ta spełniona jest tylko do pewnej, granicznej wartości I abs i zależy głównie od układu optycznego używanego spektrofluorymetru (z jakiego obszaru kuwety rejestrowana jest przez detektor emisja próbki), a także stosowanej kuwety pomiarowej, nie zależy natomiast od własności spektralnych badanej próbki (Rys. 1). 1

16 14 0.514 0.6270.728 0.44 0.3250.38 I em [j.u.] 12 10 8 0.173 0.251 6 0.104 0.078 4 0.058 0.045 2 0.025 0.013 punkty pomiarowe (wartość absorbancji) 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 I abs Rys. 1: Przykładowy wykres zależności intensywności emisji od ilości zaabsorbowanego światła. dla spektrofluorymetru SPF-500. Powyżej wartości I abs 0.4 zależność przestaje mieć charakter liniowy. Efekt filtru wewnętrznego pierwszego rodzaju, jest wynikiem nierównomiernej absorpcji światła w próbce i nie wpływa na kształt widma emisji, a tylko na jego intensywność. Dlatego też w przypadku, kiedy pomiary widm emisji mają na celu np. wyznaczenie wydajności kwantowej emisji, porównanie widma emisji dla kilku stężeń itp, to należy tak dobrać wartość absorbancji próbki dla długości fali promieniowania wzbudzającego, aby spektrofluorymetr pracował w liniowym zakresie zależności I em od I abs. Na rysunku 2a schematycznie przedstawiona została sytuacja, w której padająca wiązka światła wzbudzającego została równomiernie zaabsorbowana (zazwyczaj jest to nieduża wartość absorbancji próbki A 0.05. W tych warunkach intensywność emisji w każdym miejscu wzbudzonej próbki będzie taka sama. Wówczas, niezależnie z jakiego obszaru kuwety rejestruje detektor tę emisję (patrz rysunek a, detektor 1 i detektor 2) będzie ona proporcjonalna do ilości zaabsorbowanego światła. Przypadek, kiedy intensywność absorbowanego promieniowania zmienia się wyraźnie na drodze padającego światła schematycznie przedstawia rysunek 2b. W tych warunkach absorbancja próbki dla promieniowania wzbudzającego jest znacząco większa od A> 0.1. W miarę wnikania promieniowania świetlnego, intensywność światła absorbowanego eksponencjalnie 2

Rys. 2: Schematyczne przedstawienie wpływu filtru wewnętrznego pierwszego rodzaju na intensywność emisji, gdy roztwór absorbuje a) mało, A(λ wzb )<0.05 i b) dużo A(λ wzb )>0.12 padającego promieniowania. b ) a) zmiana natężenia wiązki wzbudzającej D 1 D 1 D 2 D 2 wzbudzenie emisja D 1, D 2 detektor pierwszy i drugi (szczegóły w tekście) maleje, a zatem, więcej emitowanego światła przez wzbudzone cząsteczki będzie wychodziło z początku kuwety (patrząc od strony wiązki wzbudzającej) niż z jej końca. Jeżeli detektor nie widzi całego obszaru wzbudzonej próbki, a zazwyczaj tak właśnie bywa, że obserwowana jest emisja tylko ze środkowego fragmentu kuwety (patrz rysunek b, detektor 1 i detektor 2), to zmierzona wartość emisji zostaje zafałszowana zaniżona. W przypadku porfiryn efekt ten dotyczy głównie pasma Soreta i związany jest z jego wyjątkowo dużą wartością współczynnika molowego absorpcji (ε) w maksimum pasma, rzędu ε = 5 10 5 mol -1 dm 3 cm -1. Dla standardowo stosowanej kuwety 1 1 cm, już przy stężeniu 4 10-7 mol dm -3 absorbancja przekracza 0.2, co zgodnie z zależnością I abs = (1-10 - Aλwzb ) odpowiada I abs = 0.37. Dlatego, jeżeli badane mają być próbki o większym stężeniu, niż te podane powyżej, należy zastosować, albo cieńszą kuwetę (np. 0.1 cm), co zwiększa zakres badanych stężeń albo przesunąć długość fali wzbudzenia z maksimum pasma, na jego zbocze, co powoduje zmniejszenie wartości ε zarazem (co obniża intensywność sygnału emisji). Mimo iż problem związany z filtrem wewnętrznym pierwszego rodzaju jest uciążliwy w przypadku porfiryn, to można go jednak w prosty sposób wyeliminować. Filtr wewnętrzny drugiego rodzaju Informacje ogólne Filtr wewnętrzny pierwszego rodzaju występować może dla każdej badanej substancji, wystarczy tylko, że przekroczona zostanie pewna graniczna wartość absorbancji. Aby wystąpił przypadek filtru drugiego rodzaju, badany związek musi spełniać jeden podstawowy warunek widmo emisji, musi nakładać się na długofalowe pasmo widma absorpcji. W takim 3

przypadku obserwować się będzie zjawisko reabsorpcji emisji, czyli powtórnej absorpcji emitowanego promieniowania. W języku angielskim istnieje oprócz określenia reabsorption pojęcie selfabsorption, które nie stosuje się w języku polskim. Dla znacznej większości związków nakładanie to istnieje, ale zazwyczaj tylko drobna część widma absorpcji i emisji nakłada się na siebie (z reguły są to ogony pasm, dla których efekt filtru wewnętrznego drugiego rodzaju jest znikomy, tak że w praktyce nie wnosi istotnego wpływu na mierzone widmo emisji). Zjawisko reabsorpcji emisji jest bardzo proste do wytłumaczenia i schematycznie przedstawione zostało na rysunku 3. Rys. 3: Schematyczne przedstawienie zjawiska reabsorpcji. a)prawie nienakładające się i b) nakładające się silnie widmo absorbancji i emisji a) absorbancja emisja 1 2 b) 1 2 3 4 a) po wzbudzeniu (1) następuje akt emisji (2), który nie zostanie powtórnie zaabsorbowany; b) po wzbudzeniu (1) emisja może nastąpić w miejscu (2), wówczas z uwagi na to, że w tym obszarze długości fal widmo emisji i absorbancji nakłada się, może dojść do absorpcji (3) kwantu (2), energia zaabsorbowanego kwantu (3) może (nie musi) zostać oddana poprzez emisję (4). W tym przypadku kwant (2) nie dotrze do detektora (bo zostanie zaabsorbowany) i tym samym zmieni kształt widma w tym obszarze (zmniejszy się intensywność emisji). Jeżeli wzbudzona zostanie próbka do pewnego pasma absorpcji i np. z tego samego pasma zachodzi emisja, to w przypadku silnego nakładania się absorpcji i emisji, pewna część emitowanego światła znajduje się jeszcze w zakresie pasma absorpcji. Z tego względu dojdzie do kolejnego aktu absorpcji, tym razem spowodowanego nie poprzez bezpośrednie wzbudzenie zewnętrznym źródłem światła, ale poprzez emitowane promieniowanie. Po ponownej absorpcji znów dochodzi do emisji i ponownie może dojść do zaabsorbowania części promieniowania emitowanego. Filtr wewnętrzny drugiego rodzaju powoduje nie tylko zmniejszenie wydajności kwantowej emisji (nie każdy ponownie zaabsorbowany kwant energii spowoduje emisję promieniowania, np. dla wydajności kwantowej emisji 10-3 będzie to co tysięczny kwant) tak jak miało to miejsce w poprzednim przypadku, ale także powoduje silną zmianę kształtu mierzonego widma emisji, które w wyniku reabsorpcji przesuwa się długofalowo. 4

Dla porfiryn reabsorpcja emisji wpływa zarówno na emisję ze stanu S 1 jak i S 2. W przypadku emisji z pierwszego singletowego stanu wzbudzonego eliminacja reabsorpcji jest sprawą stosunkowo prostą. Natomiast dla emisji ze stanu S 2 bardzo trudno pozbyć się wpływu reabsorpcji emisji. Stosowanie standardowego i zmodyfikowanego spektrofluorymetru W większości laboratoriów znajdują się spektrofluorymetry określone w tej pracy, jako standardowe. Spektrofluorymetry takie posiadają następujące cechy: źródłem światła wzbudzającego jest lampa (najczęściej ksenonowa), wzbudzenie jest szerokie zarówno spektralnie jak i geometrycznie, wzbudzenie próbki następuje poprzez oświetlanie środka kuwety (rys. 4a), poprawa stosunku sygnału do szumu poprzez: zwiększenie stężenia roztworu, zwiększenie szczelin monochromatorów. Rys. 4: Geometria wzbudzenia w przypadku: standardowego spektrofluorymetru (a) i układu z laserowym wzbudzeniem (b). a) b) wzbudzenie emisja Wszystkie z wymienionych powyżej elementów, a zwłaszcza drugi i trzeci, powodują, że wpływ reabsorpcji emisji jest znaczący i nawet dla małych stężeń niezaniedbywalny. Dlatego też należało zmodyfikować układ do pomiarów widm emisji w taki sposób, aby zminimalizować udział reabsorpcji w mierzonym widmie emisji. W tym celu posłużono się innym spektrofluorymetrem z wzbudzeniem laserowym i specjalnym ustawieniem kuwety (rys. 4b). Zalety takiego rozwiązania wyszczególnione zostały poniżej: laser jako źródło światła (duża intensywność wiązki wzbudzającej, niestety pewne zakresy długości fali wzbudzenia są niedostępne patrz rozdział: Aparatura), wzbudzenie wąskie spektralnie i geometrycznie, wzbudzenie w kuwecie może być w dowolnym miejscu (rys. b), odpowiedni stosunek sygnału do szumu nawet gdy: stężenie roztworu jest niskie ( 10-6 mol dm -3 ), 5

wąska szczelina emisji (koło 0.9 nm), stosowano kuwety o drodze optycznej 1 0.2 mm. Zastosowanie przedstawionego powyżej układu pozwoliło nie tylko na wyeliminowanie wpływu filtru wewnętrznego pierwszego rodzaju, ale na zmierzenie niezniekształconego reabsorpcją widma emisji porfiryny ze stanu S 2, dla stężeń porfiryny < 10-6 mol dm -3, zaś dla wyższych stężeń bardzo znaczne zmniejszenie udziału reabsorpcji. Nie było to możliwe przy użyciu standardowych spektrofluorymetrów nawet o najwyższej jakości (np. firmy SPEX). Eliminacja reabsorpcji emisji dla stanu S 1 Jak już zostało wspomniane wcześniej, możliwe jest zmierzenie widma emisji ze stanu S 1 porfiryny w taki sposób, aby nie zostało ono zniekształcone przez reabsorpcję. Należy pamiętać tylko o tym, żeby nie stosować próbek o zbyt dużej absorbancji i to nie tylko dla długości fali wzbudzenia (widmo może zostać zniekształcone poprzez wpływ filtru wewnętrznego pierwszego rodzaju), ale w całym zakresie pasma S 1, gdzie widmo absorpcji i emisji pokrywają się. Im będzie mniejsza absorbancja we wspólnym zakresie, tym mniejszy będzie efekt reabsorpcji emisji. W przypadku emisji ze stanu S 1 jest łatwy do spełnienia ten warunek, ponieważ wydajność kwantowa fluorescencji wynosi ~ (2 3) 10-2, współczynnik molowy absorpcji w maksimum tego pasma dla ZnTPP w etanolu wynosi około 20000 mol -1 dm 3 cm -1. Sprawia to, że dobrej jakości widmo emisji można uzyskać dla próbek dla których wartości absorpcji nie są zbyt duże. Przykładowy wpływ reabsoprcji emisji dla widma emisji ze stanu S 1 -ZnTPP w etanolu w zależności od stężenia badanej próby przedstawiony został na rysunku. Jak widać, widmo emisji w miejscu gdzie nie pokrywa się z widmem absorbancji nie jest zniekształcone, ani zmniejszone. Natomiast w zakresie, gdzie oba te widma się nakładają, następuje nie tylko zmniejszenie intensywności emisji, ale także przesunięcie położenia maksimum tego pasma w kierunku długofalowym. Przesunięcie to, wywołane jest tylko i wyłącznie poprzez wpływ reabsoprcji emisji (emisja krótkofalowa zostaje zjedzona ), a nie poprzez wpływ stężenia na badaną próbę. 6

Rys.5: Wpływ reabsorpcji emisji na widmo emisji ze stanu S 1 ZnTPP w etanolu dla dwóch znacząco różniących się stężeń. Absorbancja 0.27 0.24 0.21 0.18 0.15 0.12 0.09 zmniejszenie intensywności i przesunięcie maksimum pasma jest wynikiem reabsorpcji emisji w zakresie, gdzie nakładają się widmo absorpcji i emisji 2250 2000 1750 1500 1250 1000 7500 0.06 emisja 5000 0.03 c ~ 10-6 mol dm -3 absorbancja c ~ 10-4 mol dm -3 2500 0.00 0 540 560 580 600 620 640 660 680 700 Długość fali [nm] Udział reabsorpcji emisji nie zależy od stosowanej kuwety pomiarowej, jeżeli stosowane jest standardowe wzbudzenie, to znaczy zastosowana jest kuweta np. o wymiarach 1 1 cm, a wzbudzenie następuje na środku kuwety. Taki sam efekt reabsorpcji emisji będzie, gdy zastosowana zostanie kuweta o rozmiarach 0.4 1 cm (zwrócona węższą stroną w kierunku detektora), co schematycznie przedstawia rysunek 6 a,b. Istnieje jednak w położeniu a) większe prawdopodobieństwo wpływu filtru pierwszego rodzaju. Rys. 6: Porównanie drogi optycznej dla emisji (a tym samym wpływu reabsorpcji emisji) dla różnych, standardowo stosowanych kuwet pomiarowych. a) b) c) ta sama droga optyczna dla emisji wzbudzenie emisja krótsza niż w a) i b droga optyczna dla em Jeżeli kuweta np. 1 0.4 cm zostanie ustawiona węższą stroną w kierunku wzbudzenia, to oczywistym jest, że efekt reabsorpcji emisji, będzie mniejszy niż, w ustawieniu węższą strona w kierunku detektora (rys. 6 c). Nie jest to jednak ustawienie kuwety zwyczajowe, ponieważ w pomiarach widm emisji, ustawiona zostaje szczelina emisji jak najwęższa (aby jak najbardziej odzwierciedlić prawdziwy kształt widma), natomiast szczelina wzbudzenia na tyle szeroka, aby intensywność światła wzbudzającego była duża, a dzięki temu, aby intensywność emisji była wystarczająco duża, tzn. aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu. Powoduje to, że szczelina wzbudzenia geometrycznie może mieć rozmiar większy 7

niż ma roztwór znajdujący się w kuwecie. Oczywiście można w celu zminimalizowania wpływu reabsorpcji emisji zastosować kuwety o nietypowych rozmiarach. Eliminacja reabsorpcji emisji dla stanu S 2 Wydajność kwantowa emisji ze stanu S 2 dla ZnTPP w etanolu jest o rząd wielkości mniejsza niż ze stanu S 1, a współczynnik molowy absorpcji wynosi w maksimum pasma około 750000 mol -1 dm 3 cm -1 (~ 37.5 razy większy niż dla stanu S 1 ). Te dwie wielkości sprawiają, że wyeliminowanie reabsorpcji emisji dla stanu S 2 jest bardzo trudne i nie wystarcza zastosowanie małych stężeń, jak to miało miejsce dola stanus 1. Biorąc pod uwagę naturę procesu reabsorpcji najważniejszą rzeczą jaką należy wykonać, aby zminimalizować wpływ powtórnej absorpcji emitowanego światła jest jak największe skrócenie drogi, jaką w roztworze musi przebyć emitowane światło. Można było efekt ten uzyskać na dwóch drogach: (i) zmniejszyć wymiary geometryczne kuwety zmniejszyć ilość roztworu lub (ii) przesunąć kuwetę względem wiązki wzbudzającej w taki sposób, aby do wzbudzenia dochodziło jak najbliżej ścianki, poprzez którą emisja dochodzi do detektora (rys. 6 c). O ile pomysł pierwszy jest możliwy do wykonania na każdym spektrofluorymetrze o tyle drugi sposób wymagał pewnych modyfikacji układu (np. zmiana stolika z uchwytem na kuwety, na taki aby była możliwość manipulowania jego położeniem). Zmniejszenie wymiarów kuwety pomiarowej zmniejsza udział procesu reabsorpcji jednocześnie jednak powoduje znaczne zmniejszenie intensywności emisji. Na rysunku zauważyć można wyraźny wpływ na położenie, kształt i intensywność widma emisji ze stanu S 2 porfiryny. Wpływ ten jest zgodny z przewidywaniami, tzn, że jeśli droga emisji w roztworze jest krótka (a na pewno jest ona krótsza dla kuwety 0.15 0.15 cm niż dla 0.4 1 cm), to udział reabsorpcji też jest mniejszy i rejestrujemy większą część widma, ponieważ mniej emisji jest powtórnie reabsorbowana. Jednak zastosowanie mniejszej kuwety pomiarowej prowadzi do uzyskania widma kiepskiej jakości mocno zaszumionego. Na tym prostym układzie można jednak zauważyć jak znaczący wpływ na widmo emisji porfiryn ze stanu S 2 ma reabsorpcja. 8

Intensywność [j.u.] Intensywność [j.u.] 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 400 420 440 460 480 500 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 c~10-6 mol dm -3 absorbancja emisja spektrofluorymetr standardowy kuweta 0.4 1cm kuweta 0.15 0.15cm spektrofluorymetr z laserowym wzbudzeniem kuweta 0.4 1cm 0.0 400 420 440 460 480 500 Długość fali [nm] Rys.7: Widma emisji ze stanu S 2 ZnTPP w etanolu zmierzone na spektrofluorymetrach: standardowym i z laserowym wzbudzeniem (szczegóły w tekście). U góry rzeczywiste stosunki intensywności; na dole, widma unormowane do stałej intensywności. Znacznie lepsze rezultaty uzyskuje się wykorzystując spektrometr z laserowym wzbudzeniem. Układ ten, jak przedstawiono w rozdziale Aparatura, jest układem zbudowanym z poszczególnych elementów i nie stanowi zwartej konstrukcji, co powoduje, że można go łatwo konfigurować w taki sposób jaki jest potrzebny. Dodatkowo uchwyt na kuwety znajduje się na wózku, który można dowolnie przesuwać w stosunku do wiązki wzbudzającej, która ma bardzo małą średnicę, wynoszącą mniej niż 0.5 mm. Dzięki temu udało się ustawić wiązkę wzbudzającą bardzo blisko ściany kuwety (rys 6 b) i uzyskać widmo emisji dla stężenia ZnTPP w etanolu ~ 10-6 mol dm -3 takie jak przedstawione na rysunku 7 (czerwony kolor linii). Jak widać jest ono najbardziej przesunięte krótkofalowo w stosunku do pozostałych widm emisji, najmocniej nakłada się na widmo absorpcji i ma największą intensywność (pole pod krzywą, jako miara wydajności kwantowej emisji, jest w tym przypadku największa). Uzyskana różnica położeń pomiędzy maksimum widma absorbancji i widma emisji jest najmniejsza i wynosi mniej niż 200 cm -1 (w pozostałych przypadkach było to odpowiednio 470 i 730 cm -1 ). Ponadto zastosowanie spektrofluorymetru z laserowym wzbudzeniem, pozwoliło dzięki dużej intensywności wiązki wzbudzającej użyć wąską szczelinę emisji (Δλ < 1 nm), dzięki czemu mierzone widma emisji jest dobrej jakości, a zarazem nie jest zniekształcone przez 9

zbyt szeroką szczelinę (odzwierciedlają rzeczywisty kształt widma emisji). Użycie do wzbudzenia wiązki laserowej umożliwiło rejestrację początku widm emisji przesuniętego zaledwie o 2 nm w stosunku do długości fali wzbudzenia. W rezultacie zastosowanie opisanego w rozdziale Aparatura układu pomiarowego oraz geometrii wzbudzenia i obserwacji emisji po raz pierwszy dla porfiryn cynkowych pozwoliło na zarejestrowanie całego niezniekształconego widma fluorescencji pochodzącego z pasma Soreta bezpośrednio przy wzbudzeniu do tego pasma. Ponadto umożliwiło to nie tylko zaobserwowanie dużej części widma emisji przy niskim pobudzeniu wibracyjnym, ale także przeprowadzenie badań wpływu długości fali wzbudzenia w ramach pasma Soreta zarówno na kształt i położenie obserwowanej emisji, jak i jej wydajność kwantową. Ze względu na stwierdzona w ostatnich latach obecność co najmniej dwóch stanów elektronowych w zakresie pasma Soreta przeprowadzenie ilościowych badań emisyjnych w zakresie tego pasma jest szczególnie ważne. Procedury wyliczające wkład reabsorpcji Stosując opisaną powyżej metodę, reabsorpcja emisji ma minimalny wpływ na mierzone widma emisji, dla stężeń ~10-6 mol dm -3, ale już dla stężeń ZnTPP > 10-5 mol dm -3 wpływ ten jest na tyle duży, że należy dodatkowo zastosować odpowiednią procedurę analizy wyników. Analizę tą można przeprowadzić dwoma drogami: (i) wyeliminować matematycznie wpływ reabsoprcji (uzyskać widmo niezniekształcone przez wpływ reabsorpcji), (ii) wymodelować jaki powinien być wpływ reabsorpcji emisji na widmo i porównać z widmem zmierzonym (sztucznie dodać wpływ reabsorpcji). Założenia w obydwu drogach są takie same i obie korzystają z tego samego równania początkowego. Jeżeli nie ma wpływu reabsorpcji, to obserwowana emisja I obs jest równa rzeczywistej emisji próbki I em : obs ( λ ) I ( λ ) równanie powyższe można zapisać w postaci: I obs I = 1 em ( λ ) T ( λ ) I ( λ ) = 2 gdzie T jest wartością transmisji emitowanego światła w próbce. Jeśli nie ma reabsorpcji, tzn, że całe emitowane światło przechodzi przez roztwór, to wtedy T = 1, jeśli część emitowanego światła zostanie zaabsorbowana, to oznacza, że T < 1. Jak wiadomo transmisja z absorpcją (A) powiązana jest zależnością: em a absorpcja z absorbancją (ABS): T = 1 A 3 10

po podstawieniu daje to: A = 10 ABS 1 4 a zatem równanie przyjmie postać: lub T I I ABS ABS ( 1 10 ) = = 1 10 5 obs em ABS ( λ ) ( λ ) = I ( λ ) 10 6 em ABS ( λ ) ( λ ) I ( λ ) = 10 7 W zależności od sposobu zapisania powyższego równania można eliminować (równanie 7), lub też modelować (równanie 6) wpływ reabsorpcji emisji. Wzory te oznaczają, że każdy punkt widma emisji musi zostać przemnożony przez wartość absorbancji odpowiadającej danej długości fali emisji. W obu przypadkach pojawia się poważny problem, dotyczący wartości absorbancji na drodze emisji. Wartość ta nie jest znana ponieważ nie jesteśmy w stanie bezpośrednio określić drogi optycznej w próbce (lub w roztworze) przez jaką przechodzi promieniowanie emitowane (odległość pomiędzy ścianką wewnętrzną kuwety, a światłem wzbudzającym) w kierunku detektora. Można jednak wyliczyć tą wartość. Potrzebna jest znajomość wartości absorbancji ABS próbki, na znanej drodze optycznej, którą można zmierzyć za pomocą spektrofotometru, w kuwecie o znanej grubości l. Następnie jeśli eliminujemy wpływ reabsorpcji potrzebujemy kilku widm emisji o różnym udziale reabsorpcji. W przedstawionym tutaj przykładzie, będą to widma emisji ze stanu S 2 ZnTPP w etanolu dla różnych stężeń roztworu. Najlepiej byłoby, aby przynajmniej jedno ze zmierzonych widm emisji nie było obarczone wpływem reabsorpcji. Następnie każde ze zmierzonych widm mnożymy zgodnie ze wzorem: em obs ( ) ( λ ) = ABS λ l I ( λ ) x I 10 8 gdzie l x jest czynnikiem określającym drogę optyczną emitowanego promieniowania w roztworze: ABS = ε c l ABS l = ε c obs ( l ) x l x Za wartość l x podstawiamy dowolną liczbę i sprawdzamy, czy przemnożone widma emisji pokrywają się ze sobą, ponieważ jak wiadomo zmiana kształtu i intensywności następuje poprzez wpływ reabsorpcji, który staramy się wyeliminować. Zatem, dla pewnej wartości l x (która powinna być taka sama dla wszystkich widm emisji, przy założeniu, że używamy taką samą pod względem geometrycznym kuwetę i ustawiamy ją powtarzalnie) powinno uzyskać 9 11

się jednakowy kształt wszystkich zmierzonych widm. Jeśli natomiast modelujemy wpływ reabsorpcji, potrzebne jest niezniekształcone widmo emisji, do którego poprzez użycie zależności: obs ( ) ( λ ) = ABS λ l I ( λ ) x I 10 10 będziemy dodawali wpływ reabsorpcji. Jeżeli wcześniej (podczas eliminacji wpływu reabsorpcji) wyznaczono wartość l x dla danej serii pomiarowej, można tą wartość użyć również w tym przypadku. Po przemnożeniu widm emisji przez wartości absorbancji i l x powinniśmy otrzymać widmo, takie same jak eksperymentalnie zmierzone widmo emisji dla danej absorbancji, które było obarczone wpływem reabsorpcji. Jeśli nie została wcześniej wyliczona wartość l x należy ją oszacować w taki sposób, żeby po przemnożeniu widma emisji bez wpływu reabsorpcji otrzymać eksperymentalnie zmierzone widmo emisji z pewnym (zakładanym z wartości absorbancji) udziałem reabsorpcji. Przedstawione powyżej metody zostały użyte nie tylko do wyeliminowania i wysymulowania wpływu reabsoprcji na mierzone widma emisji ze stanu S 2 ZnTPP w etanolu, ale także do zbadania wpływu stężenia w zakresie od 2.3 do 152 10-6 mol dm -3 (Rys. 8 ) na kształt i położenie widm emisji z pasma Soreta, a także wydajność kwantową emisji. Jedną z charakterystycznych właściwości porfiryn jest łatwość tworzenia przez nie dimerów, a nawet wyższych merów. Obserwuje się to już dla tak małych stężeń jak 10-5 10-6 mol dm -3, a w szczególnych przypadkach nawet dla mniejszych stężeń. Choć właściwość ta jest dobrze znana, to jednak z reguły w badaniach emisyjnych porfiryn przyjmuje się, że obserwowana emisja, zarówno ze stanu S 1 jak i S 2 pochodzi wyłącznie od wzbudzonych monomerów. Biorąc pod uwagę opisane wyżej trudności w pomiarze rzeczywistych widm fluorescencji pochodzących z pasma Soreta nie może dziwić, że do tej pory nie przeprowadzono takich pomiarów emisyjnych w szerokim zakresie stężeń porfiryny cynkowej. Zastosowana w niniejszej pracy metoda pomiarów widm emisji i procedura ich analizy pozwoliła na ilościowe zbadanie wpływu stężenia na obecność dimerów w roztworze ZnTPP i zbadanie ich właściwości emisyjnych. em 12

Intensywność [j.u.] Bardzo silny 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 wpływ reabsorpcji 1.0 zmniejszanie intensywności (wydajności kwantowej) emisji i położenia maksimum 420 430 440 450 460 470 480 490 500 Długość fali [nm] c [mol dm -3 ] 10-6 2.3 5.5 13.3 38.6 152.0 Intensywność [j.u.] 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 420 430 440 450 460 470 480 490 500 Długość fali [nm] Rys.8: Zmiana kształtu, położenia maksimum i intensywności widm emisji ze stanu S 2 ZnTPP w etanolu w funkcji stężenia. U góry rzeczywiste różnice intensywności (wydajności kwantowych) emisji, na dole widma unormowane do stałej intensywności. Można pokazać, że widmo emisji o najmniejszym stężeniu (2.3 10-6 mol dm -3 ), jest widmem dla którego wpływ reabsorpcji jest pomijalnie mały. Poprzez wyeliminowanie wpływu reabsorpcji emisji zgodnie z równaniem 7 otrzymano widma emisji przedstawione na rysunku (górny rysunek), wartość l x dla takiego przypadku wyniosła AA, co w rezultacie dało drogę optyczną jaką przebywa emitowane promieniowanie w roztworze BB. Widać zatem, że mimo iż emisja w roztworze przebywa tak krótką drogę to reabsorpcja emisji ma znaczący wpływ na widmo. Podobną analizę wykonano korzystając ze wzoru (rys. dół). W obu przypadkach uzyskuje się podobne wyniki. Podczas eliminacji wpływu reabsorpcji dla stężenia ZnTPP w etanolu poniżej ~ 13*10-6 mol dm -3 widma emisji mają dokładnie taki sam kształt i intensywność, natomiast powyżej tego stężenia zachowany zostaje tylko kształt, a intensywność jest zmniejszona. Podobnie podczas modelowania, krzywe wysymulowane (cienkie linie) zgadzają się co do kształtu i intensywności ze zmierzonymi widmami emisji (pogrubione linie) poniżej stężenia ~ 13 10-6 mol dm -3, a powyżej tego stężenia widoczna jest różnica intensywności, ale nie kształtu widm. Oznaczać to może, że powyżej stężenia ~ 13 10-6 mol dm -3 w roztworze obecne są również dimery, które obniżają wartość emisji. 13

Intensywność [j.u.] Intensywność [j.u.] 5 4 3 2 1 0 5 4 3 2 1 0 eliminacja reabsorpcji 420 430 440 450 460 470 480 490 500 Długość fali [nm] 420 430 440 450 460 470 480 490 500 Długość fali [nm] c [mol dm -3 ] 10-6 2.3 5.5 13.3 39.6 152.0 modelowanie reabsorpcji zmierzone widma emisji symulowany wpływ reabsorpcji Podsumowując, należy stwierdzić, że mimo iż stosuje się układ pomiarowy ze specjalną geometrią wzbudzenia, to efekt reabsorpcji emisji na paśmie Soreta porfiryny jest na tyle duży, że należy dodatkowo zastosować odpowiednią analizę danych, dzięki, której można uzyskać widma nie zniekształcone powtórną absorpcją emitowanego promieniowania, a korzystając z nich wyznaczyć poprawne wartości wydajności kwantowej emisji porfiryn ze stanu S 2 Rys.9: Eliminacja (góra) i symulowanie (dół) wpływu reabsorpcji emisji dla widm emisji ze stanu S 2 ZnTPP w etanol 14