OBLICZENIA BIOCHEMICZNE Praca w laboratorium biochemicznym wymaga umiejętności obliczania stężeń i rozcieńczeń odczynników stosowanych do doświadczeń. W podstawowym kursie biochemii nie ma czasu na przygotowywanie odczynników przez studentów. Trzeba jednak zdawać sobie sprawę z tego, że ćwiczenia, które Państwo wykonują nie udałyby się, gdyby roztwory nie były przygotowane w odpowiednich stężeniach. Większość ćwiczeń wymaga ilościowego przedstawienia wyników. Tak jest w przypadku obliczania ilości produktu powstałego w wyniku przeprowadzenia reakcji enzymatycznej. Aby móc to zrobić, trzeba znać sposoby obliczania stężenia substancji na podstawie natężenia barwy powstałego produktu, lub na podstawie wartości współczynnika pochłaniania światła właściwego dla danego związku chemicznego. Zanim przystąpimy do eksperymentów nauczmy się obliczać stężenia. Bez tych umiejętności, praca w laboratorium jest niemożliwa. Sposoby wyrażania stężeń Stężenia procentowe W pracowni biochemicznej najczęściej mamy do czynienia z roztworami wodnymi, choć używamy także innych rozpuszczalników. Stężenie roztworu można określić w rozmaity sposób na przykład w procentach wagowych tj. liczbą gramów substancji rozpuszczonej w 100 gramach roztworu. I tak 37% HCl zawiera 37 g cholorowodoru (gazowego HCl) w 100 g roztworu (63 g wody). Procentowość roztworu można wyrazić w procentach wagowoobjętościowych tzn. liczbą gramów substancji rozpuszczonej w 100 mililitrach (ml) roztworu. Ten sposób wyrażania procentowości roztworów jest rozpowszechniony w biochemii. Przykład 1. Ile gramów NaCl i ile ml wody potrzeba do sporządzenia 500 g 10% w/w roztworu oraz 500 ml 10% w/o roztworu. Rozwiązanie: W 100 g 10% w/w roztworu i w 100 ml 10% w/o roztworu znajduje się 10 g NaCl, więc w 500 jest 50 g NaCl. Dla sporządzenia 500 g 10% w/w roztworu należy odważyć 50 g NaCl i rozpuścić je w 450 g (ml) wody, a dla sporządzenia 500 ml 10 % w/o roztworu należy taką samą naważkę rozpuścić w przybliżeniu w 400 ml wody i uzupełnić wodą do 500 ml. Przykład 2. Przygotować 300 ml 20% w/o roztworu Na 2 SO 4 mając do dyspozycji sól uwodnioną Na 2 SO 4 10 H 2 O. Rozwiązanie: Najpierw należy obliczyć potrzebną ilość soli bezwodnej. 100 ml 20% w/o Na 2 SO 4 20 g Na 2 SO 4 300 ml 20% w/o Na 2 SO 4 60 g Na 2 SO 4 Potem przeliczyć ilość g soli bezwodnej na sól uwodnioną: masa cząsteczkowa Na 2 SO 4 wynosi 142 zaś 322 soli uwodnionej Na 2 SO 4 10 H 2 O 142 g Na 2 SO 4 322 g Na 2 SO 4 10 H 2 O. 60 g x x = 136 g Należy odważyć 136 g Na 2 SO 4 10 H 2 O, rozpuścić w około 200 ml wody po czym uzupełnić objętość do 300 ml.
Stężenia molowe (M) Stężenie roztworów wyraża się też liczbą moli rozpuszczonej substancji. Mol (gramocząsteczka) to ilość substancji odpowiadająca jej masie cząsteczkowej na przykład dla NaCl wynosi 58 g. Dwa mole NaCl to 116 g. Stężenie molowe (M) określa liczbę moli w jednym litrze (1000 ml) roztworu, a stężenie molarne liczbę moli rozpuszczonych w 1 litrze (1000 ml) rozpuszczalnika. Trzeba pamiętać, że w literaturze angielskojęzycznej stężenie zapisywane mianem M nosi nazwę molar concentration. Przykład 3. Sporządzić 100 ml 10-4 M roztworu hemoglobiny (m.cz. 64000). Rozwiązanie: Gramocząsteczka hemoglobiny wynosi 64000 g czyli 10-4 M wynosi 6.4 g. 1000 ml 10-4 M 6,4 g Hb 100 ml 10-4 M 0,64 g Hb Należy naważkę 0,64 g hemoglobiny rozpuścić w wodzie i uzupełnić nią do 100 ml. Przykład 4. Sporządzić 0,5 litra 0,25 M roztworu NaOH (m.cz. 40). Rozwiązanie: Gramocząsteczka wynosi 40 g. Jeśli na 1 litr 1 M NaOH trzeba 40 g zasady to na 500 ml 0,25 M trzeba 0,5 0,25 40 = 5 g. Należy 5 g NaOH rozpuścić np. w 400 ml wody i uzupełnić nią do 500 ml. Nie wolno obliczać objętości wody z różnicy (500 5) i rozpuszczać 5 g w 495 ml wody. Przykład 5. Ile gramów siarczanu żelazowego Fe(III) (m. cz. 400) potrzeba do sporządzenia 0.3 litra 0,5 M roztworu? Rozwiązanie: Gramocząsteczka Fe 2 (SO 4 ) 3 wynosi 400 g, więc potrzebna ilość siarczanu wynosi 0,3 0,5 400 = 60 g. Sporządzanie roztworów z roztworów stężonych kwasów. Roztwory procentowe Stężenie stężonych roztworów kwasów jest zawsze wyrażone w procentach wagowych (w/w). Chcąc przyrządzić z nich roztwór procentowy wagowo-objętościowy (w/o) przez rozcieńczenie wodą należy uprzednio przeliczyć % w/w stężonego roztworu na % wagowoobjętościowy. 100 ml (cm 3 ) stężonego H 2 SO 4 waży 1,84 g/cm 3 100 = 184 g. W tych 184 g jest 96% czystego kwasu czyli 184 0,96 =176,6 g. Czyli stężenie procentowe w/o stężonego H 2 SO 4 wynosi 176,6%. W praktyce zamiast najpierw mnożyć przez 100, a potem dzielić przez 100 (bo mnożymy przez ułamek dziesiętny 0,96), wystarczy pomnożyć % w/w przez gęstość stężonego kwasu (1,84 g/cm 3 ). Przykład 6. Mamy sporządzić 400 ml 15% w/o roztworu H 2 SO 4 ze stężonego roztworu kwasu siarkowego o gęstości d = 1,84 g/cm 3 i stężeniu 96% (oczywiście w/w). Rozwiązanie: Musimy 96% w/w pomnożyć przez 1,84 co równa się 176,6. Przy wszystkich rodzajach rozcieńczeń stężonych roztworów wodą można wyjść z zależności, że iloczyn stężenia roztworu (%, M,) i jego ilości (g, ml, l) jest wielkością stałą, czyli: c A v A = c B v B. W tym przypadku: % A V A = % B V B czyli 15% 400 ml = 176,6% B ml. Obliczone B wynosi: 6000 : 176,6 = 34 ml 34 ml stężonego kwasu siarkowego trzeba do sporządzenia 400 ml 15% w/o roztworu. Ze względu na zjawisko kontrakcji trzeba obliczyć potrzebną ilość wody z różnicy. Należy wziąć 366 ml wody i dodać 34 ml stężonego kwasu siarkowego.
Przykład 7. Rozcieńczyć 50 ml stężonego roztworu HCl (37%, (d = 1,19 g/cm 3 ) dla uzyskania 20% w/o roztworu. Rozwiązanie: Trzeba przeliczyć procent w/w na procent w/o, czyli 37 1,19 = 44% w/o. Następnie 44% 50 ml = 20 y ml z czego obliczyć y = 2200 : 20 = 110 50 ml stężonego roztworu HCl uzupełnić wodą do 110 ml. Roztwory molowe Przykład 8. Ile ml stężonego roztworu H 2 SO 4 (96%, d = 1,84 g/cm 3 ) potrzeba do sporządzenia 1 litra 1 M roztworu. Rozwiązanie: Musimy najpierw obliczyć ile czystego kwasu znajduje się w 1ml stężonego kwasu siarkowego: 1, 84 100% x 96% 1,84 96 = 176,64 176,4 : 100 = 1,764 Następnie trzeba obliczyć ilość ml stężonego kwasu siarkowego, w której znajduje się potrzebna ilość gramów czystego H 2 SO 4. Masa cząsteczkowa H 2 SO 4 wynosi 98 czyli 1 litr 1 M roztworu zawiera 98 g czystego kwasu. Jeśli w 1ml stężonego kwasu jest 1,764 g czystego H 2 SO 4 to 98 g znajduje się w 98 : 1,764 = 55,55 ml stężonego kwasu siarkowego. Przeliczanie stężenia procentowego na molowe Przykład 9. Jaka jest molowość 96% w/w roztworu H 2 SO 4 o gęstości 1,84 g/cm 3. Masa cząsteczkowa kwasu wynosi 98. Rozwiązanie: Obliczyć liczbę g H 2 SO 4 w 1000 ml roztworu czyli w 1840 g. Jeśli 100 g 96% w/w H 2 SO 4 zawiera 96 g H 2 SO 4 to 1840 g zawiera 1766 g. Po podzieleniu tej wartości przez 98 g (gramocząsteczkę) obliczamy molowość roztworu, która wyniesie 18 moli/litr roztworu. Obliczyliśmy, że stężony kwas siarkowy jest 18 M. Przeliczanie stężenia molowego na stężenie procentowe Przykład 10. Jakie jest stężenie % w/w 12 M roztworu HCl (d = 1,19 g/cm 3, masa cząsteczkowa 36,5) Rozwiązanie: Trzeba obliczyć liczbę gramów HCl w 1000 ml roztworu 12 36.5 = 438 g HCl / litr. Następnie trzeba obliczyć liczbę gramów HCl w 100 g roztworu: jeśli w 1000 ml jest 1190 g tzn. że 1190 g roztworu zawiera 438 g HCl. Zatem 100 g roztworu zawiera 37g, co znaczy, że 12 M kwas solny jest 37% w/w. Przykład 11. Jakie jest stężenie procentowe w/o 4 M roztworu NaOH. (m. cz. NaOH = 40) Rozwiązanie: Trzeba obliczyć liczbę gramów NaOH w 1000 ml roztworu: 4 40 g = 160 g/l, a potem w 100 ml roztworu: 160 : 10 = 16 g/ml. 4 M roztwór NaOH jest 16% w/o. Rozcieńczanie roztworów Przykład 12. Należy otrzymać 8% w/o roztwór z roztworu 40% w/o. Ogólna zasada jest następująca: Trzeba wziąć taką ilość ml roztworu stężonego, która równa jest wartości stężenia roztworu żądanego i uzupełnić wodą do ilości ml równych wartości stężenia roztworu rozcieńczanego. Zatem trzeba wziąć 8 ml 40% roztworu i uzupełnić wodą do 40 ml, uzyskując w ten sposób 40 ml 8% w/o roztworu. Można też wykonać obliczenie zauważając, że dla otrzymania tak rozcieńczonego roztworu trzeba roztwór 40% rozcieńczyć 5 krotnie:
40 : 8 = 5. Należy wziąć 4 części wody i jedną część roztworu 40%. Na przykład zgodnie z powyższym poleceniem 8 ml roztworu i 32 ml wody, 16 ml roztworu i 64 ml wody itd. Przykład 13. Ile ml 20% roztworu NaOH potrzeba do sporządzenia 500 ml 5% roztworu. Rozwiązanie: wiemy już, że c A v A = c B v B. Po podstawieniu: 20 % x ml = 5% 500 ml obliczamy, że x równa się 125 ml. Należy 125 ml 20% roztworu uzupełnić wodą do 500 ml. Przykład 14. Do jakiej objętości należy rozcieńczyć 20 ml 3 M roztworu NaOH aby uzyskać stężenie 0,15 M. Rozwiązanie: 3 M 20 ml = 0,15 M x ml. Obliczamy x, które wynosi 400 ml. Należy 20 ml 3 M roztworu uzupełnić wodą do 400 ml. Przykład 15. Obliczyć molowe stężenie roztworu po dodaniu 90 ml wody do 30 ml 3M roztworu. Rozwiązanie: Obliczenie jest analogiczne jak w Przykładzie 13 czyli: c A v A = c B v B. Po podstawieniu danych mamy: 3 M 30 ml = x M 120 (30 + 90). Obliczone x = 0,75 M. Mieszanie roztworów Przykład 16. Ile ml 20% i 4% (w/o) roztworu (NH 4 ) 2 SO 4 należy zmieszać w celu otrzymania 400 ml 10% roztworu? Rozwiązanie: Układa się liczby w kwadracie (jak poniżej), gdzie po lewej stronie pisze się w kolumnie liczby wyrażające stężenia procentowe roztworów (20%, 4%), a na przecięciu przekątnych stężenie procentowe, jakie należy otrzymać (10%). Następnie po przekątnej odejmuje się od większej liczby mniejszą (10 4) i (20 10), zaś różnicę wpisuje się w przeciwległym kącie kwadratu tzn. 6 ml 20% i 10 ml 4%. 20 6 ml 20% 10 4 10 ml 4% Z tego zapisu widać, że 6 ml 20% należy wziąć do przygotowania 16 ml żądanego roztworu, to x ml 20% do przygotowania 400 ml x = ( 6 400) : 16 = 150 ml Należy zmieszać 150 ml 20% roztworu i 250 (400-150) ml 4% roztworu żeby otrzymać 400 ml 10% roztworu (NH 4 ) 2 SO 4. Punktem wyjścia do obliczeń może też być 10 ml 4% roztworu. Dla rozwiązania tego zadania można też ułożyć równanie z jedną niewiadomą w taki sposób: (20 x) + 4 (400 x) = 400 10 20x + 1600 4x = 4000 16x = 4000 1600 16x = 2400 x = 150 ml trzeba wziąć 150 ml 20% roztworu i (400 150) ml 4% roztworu do przygotowania 400 ml 10% roztworu (NH 4 ) 2 SO 4.
Przykład 17. Zmieszano 3 litry 2 M roztworu i 1 litr 3 M roztworu NaCl. Obliczyć molowość uzyskanego roztworu. Można korzystać z następującej zależności: v 1 M 1 + v 2 M 2 = (v 1 + v 2 ) M x 3 l 2 M + 1 l 3 M = ( 3 + 1) x 6 + 3 = 4x x = 9 : 4 = 2,25 M, tyle wynosi molowość nowego roztworu. Obliczanie rozcieńczenia preparatów enzymatycznych i produktów reakcji Często w obliczeniach aktywności enzymów mamy do czynienia z rozcieńczaniem preparatów enzymów i z rozcieńczaniem produktów reakcji w celu możliwości wykonania oznaczenia z odpowiednią dokładnością. Na przykład, z preparatu enzymatycznego bierzemy tylko 1/20. Potem po zakończeniu reakcji do pomiaru ilości powstałego produktu bierzemy 1 ml z 5 ml mieszaniny reakcyjnej. Aby obliczyć aktywność enzymu musimy pamiętać o tych manipulacjach i aktywność obliczona na końcu oznaczenia musi zostać pomnożona przez (20 5), czyli przez 100. Kolorymetria Kolorymetria to metoda analityczna pozwalająca na ilościowe oznaczenie nawet bardzo małych ilości substancji w roztworze na podstawie prostej zależności między intensywnością zabarwienia roztworu (absorpcja światła o określonej długości fali), a stężeniem zawartej w nim substancji. Metodami kolorymetrycznymi można mierzyć zarówno stężenia substancji posiadających własną barwę, jak i substancji bezbarwnych, które za pomocą odpowiednich reakcji chemicznych przeprowadza się w związki zabarwione. Obserwowane zabarwienie jest dopełnieniem barwy promieniowania absorbowanego i odwrotnie. Przepuszczanie przez dany roztwór tylko tej części widma świetlnego, która jest maksymalnie absorbowana sprawia, że zmniejszenie natężenie tego światła po przejściu przez barwny roztwór nie jest zakłócane światłem o innej długości fali. Dlatego w oznaczeniach kolorymetrycznych należy używać światła monochromatycznego (jednobarwnego). W spektrofotometrach uzyskuje się światło ściśle monochromatyczne przez zastosowanie pryzmatów lub siatek dyfrakcyjnych. W prostszych aparatach fotokolorymetrach używanych na ćwiczeniach zastosowane filtry dają światło tylko w przybliżeniu jednobarwne. Do roztworu o kolorze zielonym dobiera się filtr czerwony, który pochłania promienie świetlne o długości fali odpowiadającej barwie zielonej, a przepuszcza odpowiadające barwie czerwonej, absorbowane w maksymalnym stopniu przez roztwór o kolorze zielonym. W przypadku, kiedy żaden z rodzajów promieni widzialnych nie ulegnie pochłonięciu przez substancję odnosi się wrażenie światła białego, a roztwory takie są bezbarwne. Podstawowe prawo kolorymetrii, prawo Lamberta Beera mówi, że absorbancja (efektywność pochłaniania/absorbcji) światła monochromatycznego jest wprost proporcjonalna do grubości warstwy i stężenia roztworu: A = k l c Miano i wartość współczynnika absorpcji k zależy od jednostek stężenia i grubości warstwy absorbującej. W przypadku wyrażenia stężenia w molach na litr (M) nosi on nazwę molowego współczynnika absorpcji ε. Liczbowo równa się on absorpcji, jaką daje roztwór 1M o grubości warstwy 1 cm. Molowy współczynnik pozwala obiektywnie ocenić czułość
reakcji (im jego wartość większa tym reakcja czulsza, jeśli ε < 1000, metoda jest mało czuła). Z jego wartości można również obliczyć stężenie substancji w molach na litr: c = A : (ε l) Ponieważ większość pomiarów kolorymetrycznych w pracowni biochemicznej przeprowadza się w 1 cm kuwetach, to obliczenie stężenia substancji sprowadza się do podzielenia wartości absorbancji przez wartość ε. Znając absorbancję roztworu i jego stężenie można obliczyć molowy współczynnik absorpcji dla danej substancji. Przykład 18. Roztwór ATP (adenozyno 5`-trójfosforanu) o stężeniu 3 10 5 M wykazuje w kuwecie 1 cm absorbancję A = 0,462. Obliczyć molowy współczynnik absorpcji ε dla ATP. Ponieważ pomiar odbywa się w kuwecie 1 cm to ε = A : c, czyli 4,62 10-1 : 3 10-5 = 1,54 10 4 = 15400. Pamiętając, że ε równa się absorpcji 1 M roztworu można ten sam wynik otrzymać z proporcji: 0,462 3 10-5 M x 1M x = 0,462 : 3 10-5 = 1,54 10 4 Z prawa Lamberta-Beera wynika że przy zachowaniu jednakowej długości drogi światła absorbancja A jest proporcjonalna do stężenia (c), czyli A próby badanej : A wzorca = c próby badanej : c wzorca. Można więc obliczyć stężenie próby badanej dzieląc: A próby badanej przez A wzorca i mnożąc ten iloraz przez c wzorca. Stężenie wzorca musi być wyrażone w takich samych jednostkach jak stężenie próby. Roztwory wzorcowe (standardowe) zawierają określoną ilość substancji w określonej objętości np. w 1 ml. Na przykład 10 μg białka w 1 ml; 1 mg glukozy w 1 ml itd. Niemożliwe jest zważenie 10 μg substancji ani nawet 1 mg z dokładnością odpowiadającą wymogom oznaczenia kolorymetrycznego. W takich przypadkach należy odważyć wielokrotność żądanej masy, a potem rozcieńczyć taki roztwór odpowiednio do potrzeb analizy. Np. odważamy 10 mg białka, rozpuszczamy w 10 ml rozpuszczalnika i otrzymujemy w ten sposób roztwór 1mg/ml (1000μg/ml). Z tego roztworu posługując się sposobem tzw. szeregu rozcieńczeń sporządzamy roztwór 10-krotnie rozcieńczony (100 μg/ml), a z niego roztwór 10- krotnie rozcieńczony, który będzie zawierał już żądaną ilość białka 10 μg/ml. Również roztwór glukozy warto zrobić przynajmniej 10-krotnie bardziej stężony (10 mg/ml) i rozcieńczyć go 10 razy. Przykład 19. Jakie jest stężenie glukozy w próbie badanej, jeśli absorbancja tej próby wynosi 0,450, natomiast wzorzec o stężeniu 0,5 mg/ml wykazuje absorbancję 0,150. Rozwiązanie: Można skorzystać z zależności: A próby badanej : A wzorca = c próby badanej : c wzorca obliczyć c próby badanej: (0,450 : 0,150) 0.5 = 1.5 mg/ml. Można też ułożyć proporcję 0,5 mg 0,150 x mg 0,450 x = (0,5 0,450) : 0,150 co da ten sam wynik: 1,5 mg/ml i
Krzywa wzorcowa dla roztworu stosujęcego się do prawa Lamberta-Beera Krzywa wzorcowa dla roztworu nie stosującego się do prawa Lamberta-Beera Absorbancja 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 Stężenie [µ M] A Absorbancja 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 Stężenie [µ M] B Gdy roztwór nie stosuje się do prawa Lamberta-Beera (wartości absorbancji nie wzrastają proporcjonalnie do stężeń) należy posługiwać się krzywą wzorcową, która nie jest wtedy linią prostą. Krzywa wzorcowa (kalibracyjna) przedstawia zależność między absorbancją i stężeniem i w przypadku zgodności z prawem Lamberta-Beera ma postać linii prostej przechodzącej przez punkt przecięcia osi współrzędnych. W celu przygotowania krzywej wykonuje się pomiary absorbancji dla kilkunastu stężeń roztworów wzorcowych (maksymalna absorbancja nie powinna przekraczać wartości 1) i wykreśla się krzywą odkładając na osi X stężenia, a na osi Y odpowiednie wartości absorbancji. Należy tak dobierać podziałkę na osiach żeby krzywa była nachylona do osi pod kątem mniej więcej 45. Stężenie próby badanej odczytuje się z krzywej wzorcowej przez interpolację biorąc pod uwagę absorbancję tej próby. Dla prostoty, obliczanie stężeń na podstawie roztworów wzorcowych lub krzywej wzorcowej wymaga żeby końcowe objętości, w których przeprowadzamy reakcję dla wzorców i próby badanej były sobie równe. Na ćwiczeniach korzystamy z krzywej wzorcowej, bo dzięki temu widać, w jakim zakresie wartości absorbancji są wprost proporcjonalne do stężenia. Wykreślanie krzywej niezbędne jest również dla oceny zakresu stężeń, w jakich można przeprowadzać oznaczenia. Z krzywej na rysunku B widać, że powyżej stężenia 50 μm odczyty z krzywej są już mało dokładne, ponieważ wzrost absorbancji jest tylko minimalny pomimo dużego wzrostu stężenia. Stężenie rozcieńczonych roztworów jest wyrażane w milimolach, mikromolach itd., gdzie: 1 mmol = 10-3 mola; 1μmol = 10-6 mola; 1nmol = 10-9 mola; 1 pmol = 10-12 mola. Gdy wyrażamy stężenia w tych jednostkach, to musimy wiedzieć, że roztwór 1 mm = 10-3 M = 1mmol/litr = 1μmol/ml, roztwór 1μM = 10-6 M = 1μmol/litr = 1nmol/ml, a roztwór 1nM = 1nmol/litr = 1 pmol/ml. Jeśli stężenie jest wyrażane w gramach, to 1g = 1000 mg, 1mg = 1000 μg, 1 μg = 1000 ng, 1 ng = 1000 pg. Zatem, jednostki układają się w kolejności: mili-, mikro-, nano-, piko-, co oczywiście trzeba pamiętać. No to do tablicy!