Impaktor kaskadowy serii 10-8xx do zanieczyszczeń mikrobiologicznych Tisch Environmental, Inc WPROWADZENIE Badanie zawartości mikrobiologicznej powietrza znacząco rośnie w przeciągu ostatniej dekady z uwagi na oczywistą potrzebę środowiska wolnego od zanieczyszczeń. Aerozole biologiczne zostały zdefiniowane, jako mikrobiologiczne zanieczyszczenia powietrza występujące w postaci cząstek stałych lub ciekłych. Cząstki te mogą różnić się wielkością począwszy od wirusów o średnicy mniejszej od 0,1 mikrona do zarodników grzybów o średnicy 100 lub więcej mikronów. Mogą występować w postaci pojedynczych organizmów niezwiązanych lub agregatów. SZEŚCIOSTOPNIOWY PRÓBNIK CZĄSTEK ZANIECZYSZCZEŃ MIKROBIOLOGICZNYCH Sześciostopniowy próbnik cząstek zanieczyszczeń mikrobiologicznych jest wielootworowym impaktorem kaskadowym stosowanym do pomiaru stężenia i składu granulometrycznego bakterii tlenowych, glonów i grzybów w powietrzu otoczenia. Przyrząd jest powszechnie stosowany do liczenia cząstek mikroorganizmów w aerozolach mikrobiologicznych. Cząstki mikrobiologiczne mogą być zbierane na wielu agarach mikrobiologicznych i podlegać inkubacji in situ celem przeliczenia i identyfikacji. Próbnik został poddany kalibracji w taki sposób, że wszystkie i zebrane cząstki bez względu na wielkość fizyczną, kształt lub gęstość są klasyfikowane aerodynamicznie i mogłyby podlegać osadzaniu w ludzkich płucach. OPIS DZIAŁANIA PRÓBNIKÓW MIKROORGANIZMÓW: a. Szalki Petriego przygotowywane są poprzez septyczne naniesienie pipetą 27 ml sterylnego biologicznie agaru (45-50ºC). Nie należy używać innych szalek niż dostarczone, ponieważ mogą wpłynąć na zmianę odległości pomiędzy otworem dyszy i powierzchnią zbierającą. b. Pojedynczą szalkę bez pokrywy wsuwa się do każdego stopnia impaktora c. d. Próbka powietrza wchodzi do stożka wlotowego, kaskadowo przechodzi przez kolejne otwory stopni, ze stale rosnącą prędkością w otworach, od stopnia 1. do stopnia 6. Stopniowo coraz mniejsze cząstki wskutek bezwładności uderzają w agar płyt zbierających i się na nich zatrzymują, a powietrze usuwane jest przez wąż na zewnątrz impaktora.. Stały przepływ (28.3 litrów/min) zapewniony jest ciągłą pracą pompy próżniowej. Zaleca się okresową kalibrację (patrz rozdział Kalibracja). e. Po zakończeniu próbkowania, rejestruje się czas próbkowania i usuwa się szalki z agarem. Każdą szalkę Petriego przykrywa się pokrywką i oznakowuje numerem próby i numerem stopnia impaktora (np. 1-1, 1-2, 1-3, itp.). f. Płyty agarowe umieszcza się w inkubatorze w 35ºC na 18 do 24 godzin. Płyty mogą być inkubowane w temperaturze pokojowej, gdy zbierane są glony lub bakterie, których optymalna temperatura wzrostu jest niższa od temperatury ciała lub przy 20º do 25ºC.
g. h. Po inkubacji zlicza się liczbę kolonii na każdej płycie za pomocą standardowego licznika kolonii bakterii lub mikroskopu. Znając natężenie przepływu próbkowanego powietrza i czas próbkowania, można obliczyć średnią liczbę mikrobów (bakterie aerobowe i/lub grzyby) na jednostkę objętości powietrza I procent lub liczbę cząstek w każdym przedziale wielkości. KLASYFIKACJA AERODYNAMICZNA CZĄSTEK Założenie koncepcyjne próbnika Tisch dla mikroorganizmów polega na następujących zasadach: Układ oddechowy człowieka jest aerodynamicznym systemem klasyfikacji cząstek zawieszonych w powietrzu. Urządzenie próbkujące może być użyte, jako zamiennik układu oddechowego i urządzenie zbierające cząstki zawieszone w powietrzu i jako takie powinno odtwarzać do odpowiedniego stopnia penetrację płuc przez te cząstki. Udział wdychanych cząstek zatrzymanych w układzie oddechowym i miejscu osiadania zmienia się wraz z fizycznymi własnościami (wielkość, kształt, gęstość) lub cząstek, które zmieniają wymiary aerodynamiczne (Rysunek 1.). Ponieważ określona jest wielkość cząstek mikroorganizmów zebranych na poszczególnych stopniach próbnika, rozkład zebranego materiału wskazuje zasięg, do jakiego cząstka penetruje układ oddechowy w funkcji wielkości cząstek (Rysunek 1): w rejonach nosowo-gardłowych, tchawicowo-oskrzelowych i płucnych. Duże cząstki osiadają głównie w rejonach nosowo-gardłowych, natomiast cząstki o wielkościach submikronowych osiadają głównie w rejonach płuc. Liczne małe okrągłe dysze wpływają na polepszenie skuteczności zbierania (zderzania) i zapewniają ostrzejszy rozdział wielkości cząstek na każdym stopniu impaktorów bezwładnościowych. Dlatego sześciostopniowy próbnik z 400 małymi okrągłymi dyszami przypadającymi na jeden stopień, spełniają wszystkie kryteria dla skutecznego zbierania mikroorganizmów zawieszonych w powietrzu. Separacja wstępna 10 mikronów i powyżej Stopień 0 9,0-10 mikronów Stopień 1 5,8-9,0 mikronów Stopień 2 4,7-5,8 mikrona Gardło Stopień 3 3,3-4,7 mikrona Stopień 4 2,1-3,3 mikrona Stopień 5 1,1-2,1 mikrona Stopień 6 0,65-1,1 mikrona Tchawica i oskrzela główne Oskrzela drugorzędowe Oskrzela końcowe Pęcherzyki płucne Stopień 7 0,43-0,65 mikrona Pęcherzyki płucne
Separacja wstępna 10 mikronów i powyżej Rysunek 1. Próbnik TISCH symuluje układ oddechowy człowieka OPIS SZEŚCIOSTOPNIOWEGO PRÓBNIKA ZANIECZYSZCZEŃ MIKROBIOLOGICZNYCH Próbnik cząstek mikrobiologicznych zbudowany jest z sześciu aluminiowych stopni połączonych za pomocą sprężystych zatrzasków i uszczelnionych gumowymi uszczelkami pierścieniowymi (Rysunek 2). Każdy stopień impaktora posiada wiele precyzyjnie wywierconych otworów. Gdy powietrze przechodzi przez próbnik, dysze powietrzne kierują niesione strumieniem powietrza cząstki na pokrytą agarem płytę zbierającą danego stopnia. Każda cząstka nieprzechwycona na pierwszym stopniu wędruje ze strumieniem powietrza przez krawędź szalki Petriego do następnego stopnia. Każdy stopnień posiada 400 otworów dysz, których średnica zawiera się w przedziale 1,18 mm na pierwszym stopniu do 0,25 mm na szóstym stopniu. Każdy stopień posiada wyjmowaną szklaną szalkę Petriego z metalową pokrywą. Przekrój wylotu każdego stopnia ma o około 19 mm większą średnicę od szalki Petriego co pozwala nie przechwyconym cząstkom okrążyć szalkę i przejść do następnego stopnia. Stały przepływ powietrza o natężeniu 28,3 l/min przez próbnik zapewniony jest przez pompę próżniową o ciągłym trybie pracy. Zawór regulacyjny natężenia przepływu przy pompie, wymaga okresowej kalibracji.
Rysunek 2. Sześciostopniowy próbnik Tisch zanieczyszczeń mikrobiologicznych Wymiary otworów dysz I klasy granulometryczne cząstek dla poszczególnych stopni: Stopień Otwór dyszy (mm) Klasa granulometryczna cząstek (mikrony) 1 2 3 4 5 6 1.18 0.91 0.71 0.53 0.34 0.25 7.0 i powyżej 4.7-7.0 3.3-4.7 2.1-3.3 1.1-2.1 0.65-1.1 MONTAŻ Stopnie dysz powinny być czyszczone i dezynfekowane każdorazowo po użyciu przyrządu. Do czyszczenia należy używać łagodnego detergentu i ciepłej wody. Mydło może być usuwane poprzez umieszczenie stopni pod strumieniem ciepłej bieżącej wody lub przez zanurzenie w myjce ultradźwiękowej wypełnionej czystą wodą. Każdy stopnień należy skontrolować czy otwory dysz nie zostały zanieczyszczone badanym materiałem. Jeśli otwory są zatkane należy przedmuchać je strumieniem suchego powietrza. Przed użyciem należy wszystkie powierzchnie przetrzeć gazą zwilżoną 70% roztworem izopropylu. Kompletny zespół impaktora składa się ze stożka wlotu głównego, sześciu stopni (łącznie z 6 zapasowymi szalkami). Stopnie są opisane liczbami 1, 2, 3, 4, 5 i 6. Każdy stopień zawiera uszczelkę pierścieniową. Uszczelki te należy kontrolować regularnie wymieniać, jeśli nie zapewniają szczelności.
Montaż impaktora sześciostopniowego rozpoczyna się od umieszczenia odsłoniętej płyty agarowej na płycie podstawy w taki sposób, żeby szalka Petriego spoczęła na trzech wystających metalowych trzpieniach. Stopień 6. należy umieścić na szalce Petriego. Drugą szalkę Petriego umieścić należy na górze stopnia 6 i kontynuować te czynności do momentu, gdy wszystkie sześć płyt agarowych zostanie umieszczonych w próbniku. Stożek wlotowy umieszczony powinien być na górze stopnia 1. Wszystkie płyty agarowe powinny posiadać temperaturę pokojową zanim zostaną włożone do przyrządu próbkującego. Po zmontowaniu próbnika należy połączyć króciec wylotowy w płycie podstawy do pompy próżniowej lub źródła próżni. POBÓR PRÓBEK Gdy próbnik jest gotowy do pracy, należy włączyć pompę próżniową i strumień o natężeniu 28,3 l/min zaczyna płynąć przez próbnik. Rysunek 3 pokazuje występowanie uderzeń na styku dyszy i płyty zderzeniowej. Normalny przedział próbkowania dla aerozoli z mikrobami może wynosić od paru minut do 30 minut w zależności od celu, dla jakiego próbka jest pobierana i rodzaju powietrza środowiska, jakie poddane jest próbie. Ważne jest żeby zebrać dostateczną ilość mikroorganizmów w każdej próbie, żeby była istotna ze względów statystycznych i była reprezentatywna, aczkolwiek napotyka się trudności w zliczaniu płyt agarowych zawierających więcej niż 250-300 kolonii. Przepływ próbki z dużą prędkością w poprzek płyt agarowych powoduje dehydrację i prawdopodobnie uszkadza zebrane mikroorganizmy. Dlatego nie zaleca się wydłużone czasy zbierania (ponad 30 minut). Jeśli potrzebne są próbki o dużej objętości, lepiej jest użyć dwa przyrządy pracujące równolegle lub usunąć płyty agarowe przedstawiające jedną próbkę i wsunąć nową płytę dla drugiej próbki. Rysunek Schemat stopnia impaktora