Poznań, 07.08.2016 Prof. dr hab. Henryk Jeleń Wydział Nauk o Żywności i Żywieniu Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu RECENZJA rozprawy doktorskiej Pana mgr Mariusza Czyżniejewskiego pt. Zmiany profili metabolitów wybranych traw z kompleksu Lolium-Festuca w odpowiedzi na stresy abiotyczne wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab. Piotra Kachlickiego w Instytucie Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu. Recenzja składa się z oceny następujących elementów: 1. Dobór i znaczenie tematu 2. Układ pracy, bibliografia, wymogi formalne 3. Koncepcja rozwiązania problemu naukowego 4. Zastosowane metody badań 5. Przedstawione wyniki i prawidłowość wnioskowania 6. Ocena końcowa Ad.1) Dobór i znaczenie tematu Trawy (Wiechlinowate) obejmują ponad 600 rodzajów w obrębie rodziny. Wśród udomowionych są zboża. Trawy pastewne, istotne z punktu widzenia użytkowego, obejmują między innymi życice (rodzaj Lolium), kostrzewy (Festuca), a także odmiany mieszańcowe (Festulolium). Zmiany klimatu, które występują w ostatnich latach charakteryzuje między innymi podwyższenie średnich temperatur i wzrost częstości występowania susz. Jednocześnie malejąca pokrywa śnieżna zimą powoduje większe prawdopodobieństwo przemarzania roślin. Dlatego też prowadzone są badania mające na celu uzyskanie roślin o pożądanych cechach użytkowych, takich jak odporność na stresy abiotyczne - głównie niską temperaturę, suszę i zasolenie gleby. Badania nad mieszańcami traw prowadzone są także w Instytucie Genetyki Roślin. W wyniku prowadzonych badań zarejestrowano szereg odmian traw mieszańcowych z rodzaju Festulolium. Biorąc pod uwagę istotność problemu zmian klimatycznych dla rolnictwa, produkcji roślinnej, specyfikę naszego klimatu, a także duże doświadczenie jednostki w badaniach nad pozyskiwaniem nowych odmian wybrana tematyka doktoratu jest jak najbardziej uzasadniona, interesująca z naukowego punktu widzenia, mająca także potencjalnie duże 1
znaczenie dla praktyki. Praca ta była realizowana w ramach dwóch projektów, finansowanych przez Narodowe Centrum Nauki. Ad. 2) Układ pracy, bibliografia, wymogi formalne Przedstawiona do oceny praca napisana jest w tradycyjnym układzie. Część literaturowa, w pracy cała pod nazwą Wstęp obejmuje 5 podrozdziałów poświęconych kolejno trawom, reakcjom roślin na stresy abiotyczne, metabolomowi i metodom jego analizy za pomocą technik separacyjnych i spektroskopowych, a także rozdział poświęcony wieloskalowym analizom metabolomicznym. Część ta liczy 44 strony. Po części literaturowej określono cel pracy (2 strony) i opisano materiały i metody wykorzystywane w pracy (20 stron). Obszerna część wynikowa pracy obejmuje ogółem 86 stron z czego 66 strony to opis wyników, a 20 stron to ich dyskusja. Pracę kończy 8 wniosków. Część literaturowa zawiera 143 pozycje, przy czym tylko 38 to prace starsze niż 10 lat, co po części jest wynikiem nowości metabolomiki jako obszaru badań. W celu zwiększenia przejrzystości pracy autor zdecydował się na umieszczenie części wyników w załącznikach. 7 załączników w formie wykresów obrazuje zmiany metabolitów pierwotnych w eksperymentach prowadzonych w latach 2013-14 (załączniki 1-4) oraz metabolitów fenolowych w tych badaniach (załączniki 5-7). Ostatnim załącznikiem jest tabela, w której scharakteryzowano zidentyfikowane metabolity fenolowe podając parametry retencji, dokładną masę, skład elementarny oraz dane dotyczące fragmentacji (MS). W rozdziale poświęconym reakcji roślin na stresy abiotyczne opisano mechanizmy tworzenia reaktywnych form tlenu (ROS), mechanizmów obrony przed działaniem ROS, mechanizm stresu chłodu, zasolenia i suszy. Kolejny rozdział poświęcony jest metabolomowi. Omówiono w nim podział metabolitów na pierwotne i wtórne, poświęcając dużo miejsca na omówienie metabolicznej odpowiedzi na stres chłodu, zasolenia i suszy. Z uwagi na charakter pracy omówiono także w skrócie metody analizy metabolomu oparte na technikach separacyjnych/łączonych wraz z obróbką danych. Specyfika pracy - duża liczba monitorowanych związków, a co za tym idzie duża liczba często złożonych rycin powoduje, że opisanie szczególnie wyników poszczególnych eksperymentów jest trudne tak, by zachować przejrzystość prezentowanych danych. Śledzenie wyników poszczególnych eksperymentów wymaga uwagi. Pomimo bardzo dużej liczby wyników (szczególnie jeśli chodzi o monitorowanie metabolitów) praca pod względem edytorskim jest opracowana dobrze, choć niektóre ze stwierdzeń wymagałyby w mojej opinii korekty. Główne uwagi zamieszczono poniżej: Definicja chromatografii gazowej (str. 47) podana przez autora w której pisze, że związki rozdzielane są w kolumnie o wypełnieniu stałym, którym najczęściej jest żel krzemionkowy (nb. pokryty fazą), pochodzi z czasów, gdy do rozdziałów wykorzystywano kolumny pakowane i w dzisiejszych warunkach jest nieaktualna. 2
Określenie zbyt mała dynamika pracy detektora (str. 54) powinno być zastąpione zbyt małym zakresem dynamicznym detektora Opis wypełnienie silica gel-db-5 o uziarnieniu 0.25µm (str. 67) jest błędne w odniesieniu do kolumny do GC przepływ przedmuchu przegrody powinno być zastąpione przemywaniem membrany gazem nośnym Rozwiązano częściowo struktury związków obecnych w 62 wierzchołkach chromatograficznych (str 103) nie jest zdaniem dobrze napisanym Autor w niektórych miejscach nie uniknął pojęć żargonowych/anglicyzmów np.: binowanie danych (str 72) (ang. data binning/bucketing), jony z tabeli po alignmencie (str. 74). W całej pracy opisy tabel znajdują się pod tabelami, a powinny być umieszczone nad nimi. Powyższe uwagi mają charakter edytorski i nie wpływają na meritum pracy. Ad 3) Koncepcja rozwiązania problemu naukowego W literaturze opisano zmiany zawartości różnorodnych związków niskocząsteczkowych w tkankach roślin w odpowiedzi na stresy abiotyczne. Najczęściej wymienianymi są niektóre cukry, aminokwasy, aminy czy związki fenolowe. Ponieważ w dostępnych publikacjach ilość informacji poświęconych zmianom zawartości metabolitów pierwotnych oraz związków fenolowych w liściach traw w reakcji na stres jest ograniczona, podjęto opisane w pracy badania. Dodatkową zaletą planu badań było kompleksowe podejście, w którym na tych samych genotypach badano wpływ różnych czynników stresowych, stawiając hipotezę, że odpowiedź rośliny na różne abiotyczne czynniki stresowe jest zróżnicowana. W celu weryfikacji tej hipotezy zbadano odpowiedź metaboliczną wybranych genotypów traw z kompleksu Lolium-Festuca na stres chłodu, suszy i zasolenia. Badania prowadzono na dobrze dobranych trawach, o różnej tolerancji na czynniki stresowe, którymi były: kostrzewa trzcinowa (Festuca arundinacea) odmiana Kord, życica trwała (Lolium perenne) odmiana Solen oraz mieszaniec międzyrodzajowy (F. pratensis i L. Multiflorum) Festulolium odm. Felopa. Eksperymenty prowadzono w latach 2013 i 2014, przy czym nie wszystkie rodzaje stresów były przedmiotem badań w obu latach. Monitorowano zmiany metabolitów pierwotnych i wtórnych, przy czym szczególny nacisk położono na glikozydowe pochodne związków fenolowych i identyfikację charakterystycznych metabolitów drugorzędowych. Praca jest przykładem kompleksowego podejścia do analizy metabolomu za pomocą wysublimowanych, choć w tym obszarze badań standardowych, metod analitycznych. Dobór materiału roślinnego pozwala na obserwację metabolitów charakterystycznych dla badanych stresów. 3
Ad 4) Zastosowane metody badań Do izolacji metabolitów z materiału roślinnego wykorzystano ekstrakcję 80% metanolem, gdzie próbki liści homogenizowano za pomocą kulek stalowych, a następnie poddano procesowi sonikacji. Choć ekstrakcja metanolem jest jedną z najczęściej stosowanych metod izolacji metabolitów w opisie nie podano źródła literaturowego metodyki ekstrakcji lub odniesienia do wcześniejszych eksperymentów dotyczących optymalizacji tego procesu. Przygotowanie próbek do analiz techniką GC-MS obejmowało etap derywatyzacji stosowanej w celu zmniejszenia polarności/zwiększenia lotności analizowanych związków. Wykorzystanie do detekcji spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości umożliwiało oprócz uzyskania typowych widm EI dla identyfikowanych związków także dokładne oznaczenia mas monoizotopowych badanych związków. Do analiz próbek analizowanych w roku 2014 wykorzystywano także zestaw do kompletnej dwuwymiarowej chromatografii gazową ze spektrometrią mas (GCxGC-ToFMS), choć z opisu metody wynika, że aparat działał w trybie chromatografii jednowymiarowej (opis tylko jednej kolumny). W analizach metabolitów techniką LC-MS do identyfikacji metabolitów wykorzystywano spektrometr z analizatorem typu pułapki jonowej (do wielokrotnej spektrometrii mas przy ustalaniu struktur związków w oparciu o widma fragmentacyjne) oraz wysokorozdzielczy spektrometr mas Q-Exactive. Wyniki uzyskane za pomocą obu spektrometrów były wobec siebie komplementarne. Oprócz spektrometrów mas różnego typu do monitorowania zmian profilu metabolitów fenolowych wykorzystywano detektor z listwą diodową, rejestrując pasma absorpcji charakterystyczne dla związków fenolowych i flawonoidów/kwasów hydroksycynamonowych). W badaniach wykorzystano także chromatografię kolumnową (preparatywną) na kolumnie wypełnionej poliamidem do uzyskania większej ilości materiału do identyfikacji metabolitów. Z uwagi na specyfikę badań metabolomicznych dużą rolę odgrywa w nich przetwarzanie danych. Wykorzystano do tego celu zarówno programy producentów/źródeł zewnętrznych (Target Search, Golm Metabolome Database), jak i dostarczone ze sprzętem (ChromaTOF). Dane uzyskane z detektora fotodiodowego (UV-VIS) poddano analizie umożliwiającej porównanie dużej liczby danych (profili) chromatograficznych w oparciu o procedury opracowane w IGR (głównie odnoszące się do wyrównania/ujednolicenia chromatogramów (COW) i detekcji sygnałów. Warsztat analityczny wykorzystywany do realizacji pracy obejmował najnowocześniejsze urządzenia, oraz techniki i metody stosowane w badaniach nad metabolomem w najlepszych laboratoriach. Ad 5) Przedstawione wyniki i prawidłowość wnioskowania Część wynikową pracy ujęto w 4 podrozdziałach, w których omówiono kolejno i) - parametry fizjologiczne, ii) zmiany profili metabolitów pierwotnych, iii) identyfikację struktur metabolitów wtórnych oraz iv) analizy zmian profili metabolitów wtórnych. Zaobserwowano statystycznie istotne różnice w poziomie ocen odrostu pomiędzy kostrzewą trzcinową, życicą trwałą i mieszańcem międzyrodzajowym po stresie chłodu. Dla 4
próbek kostrzewy trzcinowej po stresie solnym nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w poziomie względnej zawartości wody (RWC), wykazano statystycznie istotne różnice między traktowanymi i kontrolnymi próbkami życicy trwałej. Statystycznie istotne różnice w poziomie względnej zawartości wody zaobserwowano pomiędzy roślinami traktowanymi a kontrolnymi dla roślin poddanych stresowi suszy. Monitorując zmiany metabolitów pierwotnych (GC-MS) identyfikowano związki w oparciu o indeksy retencji, porównanie widm masowych i charakterystycznych jonów, następnie do porównań statystycznych wykorzystywano tylko zidentyfikowane związki. Monitorując zmiany będące wynikiem stresu chłodu (2013) dla 54 sygnałów (związków?) dla próbek nierozcieńczonych (spośród 89) i dla 40 dla próbek rozcieńczonych (spośród 59) zaobserwowano statystycznie istotny efekt traktowania. Rozcieńczenia próbek (1:4) prowadzono w celu wyeliminowania wysycenia detektora. Z uwagi na dużą liczbę wyników identyfikowane związki starano się pogrupować, by uprościć interpretację wyników, choć np. rozróżnienie związków grupy I (25 związków) i II (9 związków) nie jest dla mnie jasne(str. 85-6). Najliczniejszą grupą związków były metabolity, których poziom wzrastał w trakcie aklimatyzacji w stosunku do kontroli. W roku 2014 monitorowano metabolity pierwotne tylko dla stresu solnego i stresu suszy. Liczba związków identyfikowanych w stresie solnym była znacznie większa niż w stresie chłodu z 2013 (163). Mogło to mieć związek także (oprócz oczywiście odmiennego rodzaju stresu) z korzystaniem w roku 2014 z aparatu o innej specyfice działania (bardzo szybki ToF wyposażony w bardzo dobry program do dekonwolucji widm). Autor pisze, że stres chłodu badano w roku 2013 oraz 2014, natomiast w części wynikowej dotyczącej monitorowania metabolitów pierwotnych nie przedstawiono wyników z roku 2014. Identyfikacja struktur metabolitów wtórnych (za pomocą LC-MS) to trzecia część materiału wynikowego, opisująca głównie procedury związane z identyfikacją związków na podstawie widm po jonizacji ESI z wykorzystaniem pułapki jonowej i aparatu o wysokiej rozdzielczości (Orbitrap). Zidentyfikowano 62 metabolity dla kostrzewy trzcinowej i życicy trwałej, przy czym 16 zostało zidentyfikowanych wyłącznie u kostrzewy, a 15 wyłącznie u życicy. Część pracy poświęcona identyfikacji metabolitów jest bez wątpienia jej najmocniejszą stroną. Identyfikację kwasów hydroksycynamonowych oparto na analizie widm UV, a w przypadku kwasu chlorogenowego poszczególne izomery, różniące się miejscami estryfikacji rozróżniano w oparciu o różnice w parametrach retencji, przydatnej m.in. do rozróżniania izomerów cis/trans i sposobie fragmentacji. Nie podano, czy tożsamość związków została potwierdzono analizą standardów, ale z części pracy opisującej wykorzystane odczynniki można domniemać, że nie. Analiza widm masowych po fragmentacji w pułapce jonowej, rzetelnie przeprowadzona, jednoznacznie wskazuje na obecność izomerów 3,4, i 5 kwasu kawochinowego. Dla pochodnych ferulochinowych 5
zidentyfikowano izomery 3,4,5 u obu badanych gatunków traw, a dla pochodnych parakumarochinowych izomery 3 i 5. Kolejną grupą, będącą przedmiotem zainteresowania doktoranta były flawonoidy. Identyfikowane związki z tej grupy były podstawione cząsteczkami cukrów (heksozy, pentozy), a także kwas glukuronowy lub acylowane kwasem malonowym lub kawowym. Badając aglikony flawonoidów za pomocą GC/MS z uwagi na ograniczenia metodyczne nie uściślono tożsamości podstawników cukrowych. Identyfikację aglikonów przeprowadzono w oparciu o widma UV, a także (głównie, podobnie jak w przypadku związków fenolowych) widma fragmentacjyjne (MS). Pozwoliły one na identyfikację połączeń C-glikozydowych i O- glikozydowych. W oparciu o widma zidentyfikowano mono-, dwu- i trójglikozylacje cukrami. Identyfikacja tych metabolitów jest bardzo dobrze udokumentowana. W próbkach zidentyfikowano także acylowane (kwasem malonowym i kawowym) pochodne flawonoidów, a także lignany (w liściach kostrzewy trzcinowej). Identyfikacje prowadzone za pomocą spektrometru typu pułapki jonowej zostały uzupełnione i potwierdzone za pomocą wysokorozdzielczej spektrometrii mas (dokładny pomiar masy w rezultacie określenia wzoru sumarycznego związków). Ostatnią częścią rozdziału poświęconego analizie wyników jest monitorowanie zmian profili metabolitów wtórnych. Podobnie jak w przypadku metabolitów pierwszorzędowych przyjęty sposób prezentacji wyników (skala logarytmiczna) pozwolił na łatwą identyfikację zachodzących zmian. Zmiany profili metabolitów wtórnych prowadzono dla stresu chłodu w latach 2013 i 2014. Wykazano istotne zmiany w 10 związkach identyfikowanych w próbkach kostrzewy trzcinowej, a także 22 dla życicy trwałej. Wyniki dla tego testu umieszczone w pracy w Załączniku 5 mogły być umieszczone w rozdziale temu poświęconym. Obserwując dane z testu chłodu pochodzące z roku 2014 dla liści kostrzewy statystycznie istotne zmiany występowały w 9 związkach, aczkolwiek większość z nich nie pokrywała się ze związkami identyfikowanymi w roku 2013, co po części jest wynikiem zmiany sposobu zbierania próbek. Analogiczną sytuację obserwowano dla próbek życicy. Dla wybranych metabolitów wtórnych monitorowanie ich zmian w eksperymentach zasolenia i suszy jest opracowane bardzo rzetelnie. Zidentyfikowano większość związków zmieniających się w zależności od czasu zbioru próbek i traktowania. Wyniki te dały dużo informacji odnośnie zmian profili metabolitów wtórnych - związków fenolowych. Na etapie opracowywania wyników, można było wziąć pod uwagę czy wykorzystanie statystycznej analizy wielowymiarowej (MVA) nie ułatwiłoby porównania analizowanych próbek i wyselekcjonowanie najbardziej istotnych markerów dla badanych stresów. Dyskusja otrzymanych wyników jest mocną stroną pracy, stanowi odrębną od wyników doświadczeń część, i została napisana w sposób przejrzysty i jasny. W wyniku analiz metabolitów pierwotnych i wtórnych w tego typu badaniach sama rejestracja zmian zawartości związków ma ograniczoną wartość, gdy nie zostanie powiązana z wpływem na szlaki metaboliczne zachodzące w roślinie. Uzyskane wyniki wskazują na wpływ stresów na 6
szereg szlaków metabolicznych, a zmiany w zawartości metabolitów pierwszo i drugorzędowych są bardzo dokładnie porównane z doniesieniami literaturowymi. Ad 6) Ocena końcowa Praca doktorska pana mgr Mariusza Czyżniejewskiego została przygotowana w sposób rzetelny. Zawiera bardzo dużo wyników, efektem jej jest poznanie szeregu metabolitów pierwotnych i (szczególnie) wtórnych, charakterystycznych dla stresów chłodu, zasolenia i suszy, co niewątpliwie przyczyni się do lepszego poznania metabolizmu traw w reakcji na stresy abiotyczne. Stwierdzam, że oceniana przez mnie rozprawa spełnia wszystkie wymagania stawiane pracom doktorskim. W związku z powyższym zwracam się do Rady Instytutu Genetyki Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu o dopuszczenie pana mgr Mariusza Czyżniejewskiego do dalszych etapów postępowania o ubieganie się o nadanie stopnia naukowego doktora. Prof. dr hab. Henryk Jeleń 7