Powiązanie glikolizy z regulacją replikacji DNA w komórkach eukariotycznych

Powiązanie glikolizy z regulacją replikacji DNA w komórkach eukariotycznych Aleksandra Konieczna Robert Łyżeń Grzegorz Węgrzyn Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, Gdańsk Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Wita Stwosza 59, 80-308 Gdańsk; tel.: (58) 523 60 24, faks: (58) 523 55 01, e-mail: grzegorz.wegrzyn@biol.ug.edu.pl Artykuł otrzymano 24 października 2015 r. Artykuł zaakceptowano 29 października 2015 r. Słowa kluczowe: glikoliza, cykl komórkowy, replikacja DNA Wykaz skrótów: ALDO aldolaza; ATP adenozynotrójforsforan; CCM Centralny metabolizm węgla; CDK kinazy cyklino zależne; CKI inhibitory kinaz zależnych od cyklin; CMG kompleks Cdc45-MCM- -GINS; DDK zależna od Dbf4 kinaza Cdc7; ENO enolaza; Fru-2,6-BP fruktozo-2,6- -bisfosforan; GAPDH dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego; GPI izomeraza glukozo-6-fosforanowa; HIF czynnik indukowany hipoksją; HK heksokinaza; MCM białka licencjonujące replikację; NADH dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy; NADPH forma zredukowana NADP + ; ORC kompleks naznaczający miejsca inicjacji replikacji; PCNA antygen jądrowy proliferujących komórek; PEP fosfoenolopirogronian; PFK fosfofruktokinaza; PFKFB3 6-fosfofrukto-2-kinaza; PGAM fosfogliceromutaza; PGK kinaza fosfoglicerynianowa; PK kinaza pirogronianowa; PPP szlak pentozo fosforanowy; Pre-IC kompleks reinicjujący; pre-rc kompleks przedreplikacyjny; R5p rybozo-5-fosforan; RFC replikacyjny czynnik C; TPI izomeraza triozo fosforanowa; VDAC zależny od potencjału kanał o selektywności anionowej. STRESZCZENIE Rozwój komórki eukariotycznej odbywa się poprzez kolejne, zachodzące po sobie etapy cyklu komórkowego, podczas którego dochodzi do jej wzrostu, powielenia materiału genetycznego oraz podziału na dwie komórki potomne. Wiele czynników środowiskowych, jak również wewnątrzkomórkowych decyduje o tym, czy komórka przejdzie przez kolejne fazy cyklu komórkowego, czy też wejdzie w stan spoczynku. Przebieg cyklu zależy również od prawidłowego funkcjonowania procesów metabolicznych, w tym centralnego metabolizmu węgla oraz replikacji DNA. Jednym z podstawowych procesów centralnego metabolizmu węgla jest glikoliza. Stanowi ona główną drogę przemian glukozy w komórkach, prowadzącą do jej przekształcenia w pirogronian. Do niedawna uważano, że metabolizm węgla oraz replikacja DNA są ze sobą powiązane tylko w sposób pośredni, głównie poprzez dostarczaną energię, niezbędną do powielenia materiału genetycznego, jak i wytwarzanie prekursorów substratów w postaci deoksyrybonukleotydów. Jednak najnowsze wyniki badań, opisane i dyskutowane w tym artykule, sugerują istnienie dużo bardziej złożonych zależności, być może także bezpośrednich, pomiędzy tymi dwoma procesami. WPROWADZENIE CYKL KOMÓRKOWY Cyklem komórkowym określa się szereg procesów oraz zmian biochemicznych zachodzących wewnątrz komórki pomiędzy kolejnymi jej podziałami. Jest on podstawą wzrostu, rozwoju, dziedziczenia i ewolucji organizmów. Klasyczny cykl komórkowy u organizmów eukariotycznych składa się z czterech faz: faza G 1 określana mianem fazy wzrostu, faza S, podczas której chromosomowy DNA ulega replikacji, faza G 2, w trakcie której komórka przygotowuje się do mitozy oraz faza M, podczas której dochodzi do kondensacji i segregacji chromosomów. Cytokineza jest ostatnim etapem cyklu komórkowego, w wyniku którego powstają dwie komórki potomne [1]. Cykl komórkowy hodowanych w kulturze komórek eukariotycznych trwa zwykle od 16 do 24 godzin [2]. Występowanie różnic w długości cyklu komórkowego w większości przypadków wynika z długości czasu trwania fazy G 1. W warunkach in vivo niektóre komórki całkowicie zaprzestają podziałów i wchodzą w stan spoczynkowy, zwany zablokowaniem w fazie G 0. Do takich komórek należą na przykład neurony, których maszyneria białkowa biorąca udział w replikacji w dorosłych komórkach nerwowych pełni inne, niezwiązane z replikacją DNA funkcje [3]. Wiele czynników środowiskowych, jak również wewnątrzkomórkowych decyduje o tym, czy komórka przejdzie przez kolejne etapy cyklu komórkowego, czy też nie będzie się dzielić [4]. Głównym molekularnym mechanizmem odpowiedzialnym za przeprowadzenie komórki przez poszczególne fazy cyklu komórkowego, a także decyzję czy komórka podzieli się, zróżnicuje, czy też ulegnie starzeniu komórkowemu lub umrze, są białka cyklinozależnych kinaz Cdk (ang. cyclin dependent kinases) aktywowanych zarówno przez wewnętrzne, jak i zewnętrzne sygnały. Obecnie znanych jest ponad 20 białek zaliczanych do rodziny Cdk [5]. Kinazy Cdk działają razem z cyklinami będącymi regulatorowymi podjednostkami odpowiedzialnymi za ich aktywność oraz specyficzność substratową. Uważa się, że kinazy Cdk odpowiadają za progresję cyklu komórkowego, natomiast cykliny biorą udział w przejściu pomiędzy jego poszczególnymi fazami. Aktywność kompleksów Cdk/cyklina jest ściśle regulowana przez inhibitory Cdk (CKI), które wpływają na zatrzymanie cyklu w momencie pojawienia się niekorzystnych warunków [5]. Schemat cyklu komórkowego wraz z jego podstawowymi elementami regulatorowymi przedstawiono na rycinie 1. Działanie czynników chemicznych oraz fizycznych zagrażających integralności genomu powoduje aktywację szlaków sygnalizacyjnych organizujących punkty kontrolne cyklu komórkowego. Ich rolą jest zatrzymanie cyklu komórkowego oraz regulacja ekspresji genów i rekrutacja czynników biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA. Punkty kontrolne występują najczęściej na granicy pomiędzy fazami cyklu komórkowego. Przejście przez kolejne punkty 444 www.postepybiochemii.pl

Na poziomie komórkowym za taką regulację odpowiadają geny kodujące enzymatyczne izoformy o różnej katalitycznej aktywności oraz czynniki regulacyjne. Dostępność tych białek kontrolowana jest na poziomie transkrypcji, splicingu, stabilności mrna oraz translacji. Wpływ na regulację metabolizmu mają również potranslacyjne modyfikacje oraz małe cząsteczki wywierające allosteryczny efekt na enzymy, jak fenyloalanina, ATP czy AMP [10]. GLIKOLIZA ROLA PROCESU GLIKOLIZY W KOMÓRCE Rycina 1. Schemat cyklu komórkowego wraz z jego podstawowymi elementami regulatorowymi: CDK kinazy cyklinozależne, CKI inhibitory kinaz zależnych od cyklin, w tym białka należące do rodziny CIP/KIP (p21, p27, p57) oraz INK (p19, p18, p16, p15) (na podstawie [6], zmodyfikowane). kontrolne bez zatrzymania zależne jest między innymi od wielkości komórki, dostępności składników odżywczych czy integralności DNA, a także od samego typu komórek czy też organizmu [7]. Dla przykładu zatrzymanie widełek replikacyjnych aktywuje punkt kontrolny podczas fazy S, zaś uszkodzenia DNA podczas fazy G 2. Odpowiedzi te są kluczowe dla stabilności genomu oraz przetrwania komórki. Zaburzenia w ich funkcjonowaniu prowadzą do nagromadzenia nieprawidłowości genetycznych, bardzo często związanych z procesem nowotworzenia [8]. CENTRALNY METABOLIZM WĘGLA (CCM) Centralny metabolizm węgla (CCM, ang. central carbon metabolism) ogólnie uznany jest jako zbiór szlaków biochemicznych odpowiadających za transport i utlenianie głównych źródeł węgla w komórce [9]. Podstawę szlaków metabolizmu węgla stanowią: glikoliza, glukoneogeneza, cykl kwasów trikarboksylowych (cykl Krebsa) oraz szlak pentozofosforanowy. Zwykle funkcjonowanie jednego ze szlaków metabolicznych jest uzależnione od pozostałych. Biochemiczne reakcje zachodzące w tych szlakach mają na celu zapewnienie komórce stanu równowagi poprzez optymalną produkcję pochodzącej ze składników odżywczych energii oraz jej wykorzystanie w zależności od warunków wzrostu. Centralny metabolizm węgla obejmuje skomplikowany szereg reakcji enzymatycznych prowadzący do przemiany cukrów do metabolicznych prekursorów. Prekursory te są następnie używane do wygenerowania całej biomasy w komórce [10]. Niemniej jednak kluczową rolą CCM jest wytworzenie energii, w większości w postaci adenozynotrójfosranu (ATP) oraz czynników redukujących. Głównym źródłem energii jest glukoza, metabolizowana w procesie glikolizy do pirogronianu. W warunkach tlenowych pirogronian przekształcany jest do acetylo-koenzymu A (acetylo-coa), który włączany jest do cyklu Krebsa generującego ATP oraz NADH. Natomiast powstające NADH stanowi źródło elektronów niezbędnych do wytworzenia energii w szeregu reakcji łańcucha oddechowego [11]. Ponieważ potrzeby metaboliczne poszczególnych typów komórek różnią się w zależności od ich funkcji oraz środowiska, organizmy wykształciły systemy odpowiadające za regulację metabolizmu zarówno na krótki, jak i długi okres. Kompletny szlak glikolizy został opisany w latach trzydziestych XX wieku i nazywany jest również szlakiem Embden-Meyerhof-Parnasa na cześć biochemików mających ogromny wkład w wyjaśnienie tego procesu [12]. Głównym substratem szeregu tych reakcji jest glukoza, cukier będący podstawowym źródłem węgla oraz energii. Glikoliza zachodzi we wszystkich komórkach, a enzymy tego szlaku są obecne w cytosolu. W samym szlaku glikolizy można wyróżnić trzy fazy [13]. Pierwsza to faza wymagająca energii, nazywana fazą rozpoczynającą (ang. priming phase), podczas której dochodzi do fosforylacji glukozy do glukozo-6-fosfornau przez enzym heksokinazę lub glukokinazę. Reakcja ta jest nieodwracalna i wymaga ATP oraz Mg 2+, podobnie jak wymagająca kolejnej cząsteczki ATP fosforylacja fruktozo-6-fosforanu przez fosfofruktokinazę. Druga to faza rozdziału, dekompozycji (ang. splitting phase), podczas której w wyniku kilku reakcji enzymatycznych dochodzi do wytworzenia dwóch cząsteczek aldehydu 3-fosfoglicerynowego. Trzecia to faza wytwarzania energii (ang. energy-generation phase) prowadząca do wytworzenia czterech cząsteczek ATP oraz dwóch NADH. Glikoliza może przebiegać zarówno w obecności tlenu, jak i jego braku (beztlenowo), przy czym końcowym produktem beztlenowej glikolizy jest mleczan. Natomiast w warunkach dostępu tlenu powstaje pirogronian, który następnie w cyklu Krebsa utleniany jest do CO 2 i H 2 O [14]. W reakcjach szlaku glikolitycznego bezpośrednio powstają tylko dwie cząsteczki ATP na jedną cząsteczkę glukozy. Sumaryczna reakcja przekształcenia glukozy w pirogronian wygląda następująco: glukoza + 2P i + 2ADP + 2NAD + 2 cząsteczki pirogronianu + 2ATP + 2NADH + 2H + + 2H 2 O Enzymy glikolityczne są zachowywane w procesie ewolucji, a sam szlak należy do najstarszych procesów przemian metabolicznych. Metabolizm glukozy z udziałem glikolizy, mający służyć produkcji energii, rozwinął się już u archaicznych beztlenowych form życia. Nawet po pojawieniu się tlenu atmosferycznego, który umożliwił dalsze utlenianie pirogronianu, sam szlak oraz enzymy biorące w nim udział niewiele się zmieniły [15]. Glikoliza w odniesieniu do samej produkcji ATP jest nieefektywna, ponieważ generuje powstanie tylko dwóch cząsteczek ATP na jedną cząsteczkę glukozy. Natomiast cał- Postępy Biochemii 61 (4) 2015 445

kowite utlenienie jednej cząsteczki glukozy w oksydacyjnej fosforylacji umożliwia wytworzenie aż 36 cząsteczek ATP [14]. W przypadku braku tlenu, NAD + regenerowany jest ze zredukowanego NADH przez konwersję pirogronianu do mleczanu. Alternatywnie glukoza może ulec przekształceniu do jej polimerycznych postaci (glikogen, skrobia), które w wielu organizmach są formami magazynowania tego węglowodanu. Pomimo niskiej wydajności w produkcji energii, dzięki tlenowej glikolizie oraz zwiększeniu tempa reakcji komórka może wyprodukować więcej ATP niż podczas fosforylacji oksydacyjnej [16]. U ssaków względne znaczenie glikolizy i innych szlaków zależne jest od rodzaju tkanki lub typu komórki w tkance. W większości komórek ssaczych istnieje możliwość metabolizmu glukozy poprzez alternatywne ścieżki, jak szlak pentozofosforanowy czy biosyntezy heksozaminy [17]. W fizjologicznych warunkach dostępności i metabolizmu glukozy, ok. 30% energii w postaci ATP pochodzi z glikolizy, natomiast reszta wytwarzana jest w procesie fosforylacji oksydacyjnej [16]. Jednak w komórkach, w których nie występują mitochondria, glikoliza jest głównym szlakiem odpowiadającym za wytwarzanie ATP, np. w erytrocytach czy rogówce. Również mózg, siatkówka, skóra, rdzeń nerek i nabłonki przewodu pokarmowego czerpią większość swojej energii właśnie z tego procesu [13]. W komórkach zachodzi stała ekspresja genów kodujących enzymy glikolityczne niezbędne do przemiany glukozy. Co ciekawe, skoordynowane zwiększenie ich ekspresji może nastąpić na przykład w warunkach niedotlenienia. Istotną rolę w tym procesie odgrywa czynnik indukowany hipoksją (HIF, ang. hypoxia inducible factor) [18]. Rycina 2. Schemat szlaku glikolizy wraz z enzymami katalizującymi ten proces: heksokinaza (HK), izomeraza glukozo-6-fosforanowa (GPI), fosfofruktokinaza (PFK1), aldolaza (ALDO), izomeraza triozofosforanowa (TPI), dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH), kinaza fosfoglicerynianowa (PGK), fosfogliceromutaza (PGAM), enolaza (ENO) oraz kinaza pirogronianowa (PK) (na podstawie [14]). W przeciwieństwie do zdrowych komórek, większość komórek nowotworowych używa glikolizy jako głównego mechanizmu wytwarzania energii niezależnie od obecności tlenu [19]. Zjawisko beztlenowej glikolizy w komórkach nowotworowych określane jest efektem Warburga od imienia uczonego, który jako pierwszy opisał je w 1926 roku. W normalnych komórkach produkcja energii zachodzi głównie poprzez utlenianie pirogronianu w mitochondriach. Natomiast komórki nowotworowe preferują, nawet w obecności dostatecznie dużych ilości tlenu, oddychanie beztlenowe. Metabolizują one do dziesięciu razy więcej glukozy do mleczanu niż normalne tkanki [19]. Dzięki temu, w zależności od rodzaju komórek/tkanki oraz warunków doświadczalnych, udział glikolizy w produkcji ATP wynosi 0,3 64% [20]. Ma to związek z nadekspresją genów szlaku glikolizy, która zachodzi co najmniej w 24 klasach nowotworów reprezentujących ponad 70% przypadków raka na świecie [21]. Ponadto komórki nowotworowe jako źródło węgla, poza glukozą, mogą także wykorzystywać glutaminę. Wynika to z ich zwiększonego zapotrzebowania na związki pośrednie dla cyklu Krebsa, które w normalnych komórkach zapewnia glukoza [16]. Należy również pamiętać, że metabolizm mleczanowy bywa preferowany także w niektórych zdrowych tkankach, takich jak mięsień sercowy czy mózg, którego astrocyty są zasadniczo glikolityczne [22]. Proces ten wykorzystywany jest również przez wiele szybko rosnących organizmów jednokomórkowych, takich jak drożdże Saccharomyces cerevisiae, które nawet w warunkach tlenowych preferują fermentowanie glukozy do etanolu. To z kolei przekłada się na ich znacznie szybszy wzrost [23]. Innym przykładem są intensywnie dzielące się mysie fibroblasty, w których poziom wychwytu glukozy oraz wytwarzania mleczanu jest najwyższy podczas wykładniczej fazy wzrostu [24]. ENZYMY SZLAKU GLIKOLIZY Glikoliza stanowi główną drogę przemian glukozy w komórkach, prowadząc do przekształcenia jej w pirogronian. Szlak ten jest źródłem energii komórkowej, a także związków pośrednich wykorzystywanych w pozostałych szlakach metabolicznych. Dziesięć enzymów katalizuje reakcje biochemiczne tego szlaku (Ryc. 2). Trzy spośród nich mają charakter nieodwracalny. W dalszej części artykułu przed- 446 www.postepybiochemii.pl

stawione zostały poszczególne enzymy biorące udział w glikolizie oraz przeprowadzane przez nie reakcje. Heksokinaza (HK) Pierwszą, a przy tym nieodwracalną, reakcją szlaku glikolizy jest fosforylacja glukozy do glukozo-6-fosforanu katalizowana przez heksokinazę. W tkankach ssaków występują aż cztery jej izoenzymy HK 1, 2, 3 i 4 (glukokinaza) [25]. Różnice między nimi dotyczą zarówno subkomórkowej lokalizacji, sposobu ekspresji, jak i samych właściwości. HK1 jest powszechnie występującym enzymem, szczególnie w erytrocytach oraz jedyną heksokinazą występującą w mózgu [25,26]. HK2 jest dominującą formą w tkance mięśniowej, ulega również syntezie w tkankach wrażliwych na insulinę oraz zaobserwowano znacznie podwyższony jej poziom w komórkach nowotworowych [25,27] W odróżnieniu od pozostałych dwóch izoenzymów, HK1 oraz HK2, dzięki hydrofobowej α-helisie, związane są z błoną mitochondrialną a poprzez oddziaływanie z kanałem VDAC odgrywają istotną rolę w hamowaniu apoptozy zachodzącej ścieżką mitochondrialną [28]. Aktywność pozostałych dwóch izoenzymów ograniczona jest do specyficznych tkanek. HK3 funkcjonuje w wątrobie, płucach i nerkach [29]. Natomiast HK4, mająca niskie powinowactwo do glukozy, aktywna jest jedynie w wątrobie i trzustkowych komórkach B [27]. Izomeraza glukozo-6-fosforanowa (GPI) Izomeraza glukozo-6-fosforanowa jest cytosolowym enzymem metabolizmu podstawowego (ang. housekeeping enzyme). W cytoplazmie dimeryczna forma tego białka katalizuje odwracalną izomeryzację glukozo-6-fosforanu (aldoza) do fruktozo-6-fosforanu (ketoza) [30]. Enzym ten może również prowadzić do przekierowania glukozy do szlaku pentozofosforanowego w celu wytworzenia NADPH i pentozy [14]. GPI jest białkiem wielofunkcyjnym (ang. moonlighting protein), które na drodze ewolucji nabyło również inne dodatkowe funkcje [15]. Na zewnątrz komórki, monomeryczne białko kodowane przez gen GPI może pełnić trzy różne funkcje: neuroleukiny działającej jako czynnik neurotroficzny (NLK, ang. neuroleukin) dla komórek rdzenia kręgowego oraz neuronów czuciowych, cytokiny wzmagającej mobilność komórek nowotworowych (AMF, ang. autocrine motility factor) oraz czynnika dojrzewania (MF, ang. maturation factor) [31]. 6-fosfofruktokinaza 1 (PFK1) W komórkach ssaków obecne są trzy izoenzymy fosfofruktokinazy: wątrobowy (PFK-L), mięśniowy (PFK-M) oraz płytkowy (PFK-P) [32], występujące specyficznie w różnych tkankach i organach w formie tetramerów. Enzym ten przeprowadza nieodwracalną reakcję fosforylacji fruktozo-6-fosforanu do fruktozo-1,6-bisfosforanu. Jest to reakcja zależna od ATP i ma ona kluczowe znaczenie w regulacji szybkości glikolizy. Dzięki allosterycznym właściwościom PFK1 podlega aktywacji przez 2,6-bisfosforan fruktozy (Fru-2,6-BP), metabolit zdolny do zniesienia hamującego działania ATP na jego aktywność [33]. Aldolaza (ALDO) W tkankach ssaków istnieją trzy różne rodzaje aldolazy fruktozobisfosforanu (ALDO), nazywane aldolazą A, B i C. Wszystkie występują w cytosolu w formie homotetrameru. Aldolaza A jest aktywna w mięśniach oraz w czerwonych krwinkach. Wątrobowa aldolaza B obecna jest również w jelicie cienkim oraz nerkach. Natomiast aldolaza C jest specyficzna dla mózgu, tkanki nerwowej oraz mięsni gładkich [34]. Enzym ten rozszczepia cząsteczkę fruktozo-1,6-bisfosforanu na dwie cząsteczki: fosfodihydroksyaceton i aldehyd 3-fosfoglicerynowy. Przy czym tylko aldehyd 3-fosfoglicerynowy jest wykorzystywany w dalszych etapach glikolizy. Poza cytosolem, aldolaza A obecna jest również w jądrze komórkowym. Dotyczy to zarówno komórek nowotworowych, jak i proliferujących zdrowych komórek [35]. Izomeraza triozofosforanowa (TPI1) Produkt genu TPI1 człowieka jest enzymem metabolizmu podstawowego obecnym we wszystkich tkankach. W aktywnej postaci występuje jako homodimer. Jego sekwencja aminokwasowa jest najlepiej zachowaną ewolucyjnie pośród wszystkich znanych białek TPI. TPI katalizuje odwracalną reakcję przekształcania fosfodihydroksyacetonu do aldehydu 3-fosfoglicerynowego [36]. Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH) Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH) katalizuje fosforylację oksydacyjną aldehydu 3-fosfoglicerynowego do 1,3-bisfosfoglicerynianu z użyciem fosforanu nieorganicznego i NAD +. W cytoplazmie enzym ten występuje w formie tetrameru zbudowanego z identycznych podjednostek. Może być także w niewielkiej ilości umiejscowiony w jądrze komórkowym w formie monomeru oraz w mitochondriach w postaci dimeru [37]. Gen GAPDH zaliczany jest do genów metabolizmu podstawowego, a kodowane przez niego białko GAPDH stanowi ponad 15% wszystkich rozpuszczalnych białek komórkowych [38]. Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego jest białkiem wielofunkcyjnym (ang. moonlighting protein), bezpośrednio zaangażowanym w wiele procesów zachodzących w komórce, jak na przykład regulacja ekspresji genów, naprawa DNA, odpowiedź na stres oksydacyjny czy apoptoza [37,39]. W ludzkim genomie odkryto wiele homologicznych do GAPDH genów, które w większości uważane są za pseudogeny. Dotychczas opisano ich aż 67 [40]. Kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) Kinaza fosfoglicerynianowa katalizuje konwersję 1,3-bisfosfoglicerynianu do 3-fosfoglicerynianu. W komórkach ludzkich obecne są dwa izoenzymy: PGK1 i PGK2. PGK1 jest powszechnie występującą formą produkowaną w większości komórek, podczas gdy PGK2 jest unikalną tylko dla mejotycznych i postmejotycznych komórek spermatogenezy [41]. Kinaza fosfoglicerynianowa jest enzymem wielofunkcyjnym, będącym między innymi kofaktorem polimerazy DNA α i mogącym mieć udział w syntezie opóźnionej nici DNA podczas replikacji [42]. Postępy Biochemii 61 (4) 2015 447

Fosfogliceromutaza (PGAM) U ludzi istnieją trzy formy fosfogliceromutazy aktywne w postaci homodimerów: mutaza bisfosfoglicerynianu w erytrocytach (BPGM), PGAM2 (typ M) występująca w tkance mięśniowej oraz PGAM1 (typ B) aktywna w pozostałych tkankach [43]. Enzym ten katalizuje przekształcenie 3-fosfoglicerynianu do 2-fosfoglicerynianu. Enolaza (ENO) Enolaza w komórkach eukariotycznych występuje w postaci homo- lub heterodimerów kodowanych przez geny ENO1, ENO2 oraz ENO3, którym odpowiadają podjednostki α, γ oraz β. Najbardziej powszechnym izoenzymem jest nieneuronalna α-enolaza (ENO1) występująca w prawie wszystkich tkankach. β-enolaza (ENO3) obecna jest w komórkach o dużym zapotrzebowaniu na energię, głównie w tkankach mięśni szkieletowych i mięśniu sercowym. Natomiast γ-enolaza (ENO2) znajduje się jedynie w tkankach nerwowych i neuroendokrynnych [44]. Enolaza katalizuje odwodnienie 2-fosfoglicerynianu i powstanie mającego wysokoenergetyczne wiązanie fosfoenolopirogronianu. Poza podstawową rolą w glikolizie, pełni ona wiele niekatalitycznych funkcji [15]. Może nawet występować na powierzchni komórek, jako receptor plazminogenu ludzkiego, przez co bierze udział w procesie inwazyjności patogenów, biogenezie czy też migracji komórek nowotworowych oraz przerzutach [45]. Kinaza pirogronianowa (PK) U człowieka i innych ssaków obecne są cztery izoenzymy kinazy pirogronianowej PKM1, PKM2, PKL i PKR, których produkcja jest tkankowo specyficzna [46]. Gen PKLR dzięki alternatywnym promotorom oraz różnemu składaniu (ang. splicing) koduje transkrypty zarówno dla PKL, jak i PKR. PKR funkcjonuje jedynie w erytrocytach, natomiast produkcja PKL zachodzi w wątrobie, nerkach oraz jelicie cienkim [46]. Glikolityczne enzymy kinazy pirogronianowej M1 i M2 (PKM1 i PKM2) powstają w wyniku alternatywnego składania transkryptów genu PKM, którego eksony 9 i 10 kodują sekwencje specyficzne odpowiednio dla izoformy M1 i M2. Obie te formy różnią się jedynie 22 aminokwasami [47]. Poza mięśniami szkieletowymi ekspresja genu PKM1 zachodzi również w sercu, mózgu oraz większości pozostałych tkanek. PKM2 jest natomiast embrionalną izoformą obecną we wszystkich tkankach na wczesnych etapach życia, a także w komórkach proliferujących. W trakcie rozwoju w wybranych tkankach jest ona zastępowana przez pozostałe formy tego enzymu [48]. Podwyższony poziom PKM2 związany jest z rozwojem nowotworów. Kinaza pirogronianowa katalizuje ostatni etap glikolizy, nieodwracalne przeniesienie grupy fosforylowej z fosfoenolopirogronianu na ADP z wytworzeniem pirogronianu. PKM2 występuje w dwóch formach, aktywnego tetrameru oraz nieaktywnego dimeru, przy czym przejście pomiędzy tymi dwiema formami jest dynamiczne [49]. Dimer PKM2 w komórkach nowotworowych przekierowuje metabolizm węgla z produkcji pirogronianu i komórkowej energii na procesy anaboliczne niezbędne do szybkiego wzrostu. Co ciekawe, w komórkach z formą M2 kinazy pirogronianowej ilość pirogronianu jest większa niż w komórkach z formą M1 mającą wysoką aktywność [48]. Przyczyna wyższego stężenia tego metabolitu pozostaje niewyjaśniona [49]. Poza cytosolem kinaza pirogronianowa może występować także w jądrze komórkowym, gdzie bezpośrednio fosforyluje czynnik transkrypcyjny STAT3 (ang. signal transducer and activator of transcription) [50]. STAT3 reguluje ekspresję genów, których produkty występują w wielu szlakach metabolicznych i biosyntezy, integrując sygnały prowadzące do globalnych zmian transkrypcji i onkogenezy [51]. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) U większości żywych organizmów dehydrogenaza mleczanowa jest tetramerem występującym w pięciu formach, które są kombinacją dwóch rodzajów podjednostek: M (mięśniowej, kodowanej przez gen LDHA) i H (sercowej, kodowanej przez gen LDHB), tj. LDH-1 (HHHH), LDH-2 (HHHM), LDH-3 (HHMM), LDH-4 (HMMM) i LDH-5 (MMMM). W komórkach ssaczych najbardziej powszechne są głównie dwie izoformy dehydrogenazy mleczanowej. Pierwszą z nich jest LDHA (LDMM lub LDH5) dominująca w mięśniach szkieletowych, a drugą LDHB (LDHH lub LDH1) będąca główną formą występującą w sercu. Forma A katalizuje przekształcanie pirogronianu do mleczanu, natomiast forma B powoduje wsteczną konwersję [52]. Opisano jeszcze dwa izoenzymy: LDHC obecny jedynie w jądrach [53] oraz LDHD zidentyfikowany na podstawie sekwencji kodującej i będący homologiczny do drożdżowej dehydrogenazy D-mleczanowej. Analiza transkryptu odpowiadającego LDHD wykazała jego obecność w sercu, mięśniach szkieletowych oraz wątrobie i nerkach [54]. Dehydrogenaza mleczanowa katalizuje wzajemne przekształcanie pirogronianu i mleczanu z jednoczesną przemianą NADH i NAD +. Przekształca pirogronian będący końcowym produktem glikolizy do mleczanu w warunkach braku tlenu lub przy jego niskim poziomie. LDH jest bardzo istotnym enzymem w metabolizmie komórkowym, w szczególności w mięśniach szkieletowych, gdzie podczas intensywnego wysiłku produkcja ATP w procesie oksydacyjnej fosforylacji jest niewystarczająca, aby zapewnić energię do skurczu mięśni. ROLA METABOLITÓW GLIKOLIZY W większości tkanek 80 90% glukozy utleniane jest w procesie glikolizy, a pozostałe 10 20% w szlaku pentozofosforanowym [55]. Produkty pośrednie (metabolity) powstające podczas kolejnych etapów glikolizy mogą także zostać wykorzystane jako substraty w innych szlakach metabolicznych zachodzących w komórce. Na przykład fruktozo-6-fosforan i aldehyd 3-fosfoglicerynowy mogą być przekierowane do szlaku pentozofosforanowego (PPP), gdzie podczas fazy nieoksydacyjnej dochodzi do wytworzenia rybozo-5-fosforanu (R5p), będącego produktem pośrednim niezbędnym w biosyntezie nukleotydów [55]. Alternatywnie, włączenie glukozo-6-fosforanu do fazy oksydacyjnej szlaku pentozofosforanowego (PPP) prowadzi do powstania R5p oraz NADPH, co z kolei przyczynia się do obrony komórki w warunkach stresu oksydacyjnego [56]. 448 www.postepybiochemii.pl

Glikolityczny związek pośredni 3-fosfoglicerynian (3PG) jest prekursorem do syntezy endogennych aminokwasów: cysteiny, glicyny i seryny, które są istotne do syntezy białek, lipidów i kwasów nukleinowych. Ponadto redukcja fosfodihydroksyacetonu do glicero-3-fosforanu dostarcza komórkom substratu do biosyntezy zarówno fosfolipidów, jak i triacylogliceroli będących ważnymi składnikami błony komórkowej [57]. Fosfoenolopirogronian (PEP) jest metabolitem istotnym w fosforylacji mutazy fosfoglicerynianowej (PGAM1), podczas której powstaje pirogronian, ale bez wytworzenia ATP. Wytworzenie pirogronianiu bez generowania ATP zapobiega negatywnej allosterycznej regulacji glikolizy na poziomie fosfofruktokinazy (PFK1), którą może powodować wysokie stężenie ATP. Natomiast fosforylacja PGAM1 zwiększa aktywność tego enzymu prowadząc do wzrostu poziomu 3-fosfoglicerynianu (3PG) [58]. Może to prowadzić do przekierowania metabolitów glikolizy do szlaków biosyntezy glicyny i seryny [49]. 3-fosfoglicerynian (3PG) oraz 2-fosfoglicerynian (2PG) modulują tlenową fazę szlaku pentozofosforanowego oraz biosyntezy seryny. 3PG stanowi substrat, natomiast 2PG pobudza ten szlak poprzez pozytywną regulację dehydrogenazy fosfoglicerynianowej, katalizującej pierwszy jego etap [58]. W komórkach z obniżoną aktywnością PGAM1 zaobserwowano zmniejszoną syntezę nukleotydów. Powodem tego było hamowanie wejścia glukozo-6-fosforanu do szlaku pentozofosforanowego (PPP). Mechanizm tego hamowania opiera się na inaktywacji enzymu dehydrogenazy 6-fosfoglukonianowej (6PGD) przez gromadzący się 3-fosfoglicerynian. Co więcej, obniżona aktywność PGAM1 prowadziła do obniżenia ilości 2-fosfoglicerynianu, będącego produktem reakcji katalizowanej przez ten enzym, a w efekcie powodowało to zmniejszoną biosyntezę seryny [59]. Badania przeprowadzone na drożdżach wykazały, że fosfoenolopirogronian (PEP) może być kompetycyjnym inhibitorem izomerazy triozofosforanowej (TPI1), wpływającym na adaptację do warunków stresu oksydacyjnego poprzez regulację glikolizy oraz szlaku pentozofosforanowego. Niedawno wykazano również antyoksydacyjny potencjał fosfoenolopirogronianu oraz jego cytoprotekcyjne właściwości [60]. Jednak dokładny mechanizm działania PEP nie został dotychczas wyjaśniony. Pirogronian jest związkiem odgrywającym kluczową rolę w metabolizmie. Dzieje się tak głównie przez przemianę do acetylokoenzymu A (acetyl-coa), który włącza się do cyklu Krebsa stanowiąc źródło energii komórkowej (oksydacyjna fosforylacja), a także metabolitów do syntezy makrocząsteczek. Pirogronian może być również przekształcany do aminokwasu alaniny, albo poprzez konwersję do mleczanu umożliwiać regenerację NAD + konieczną do kontynuacji glikolizy w warunkach beztlenowych [11]. W ssaczych liniach komórkowych, enzym PFKFB3 (odpowiadający za syntezę 2,6-bisfosforanu fruktozy; Fru-2,6-BP), zaangażowany w regulację glikolizy oraz glukoneogenezy, degradowany jest przez kompleks ligazy ubikwityny AP- C/C-Cdh1, który bierze udział w kontrolowaniu przejścia z fazy G 1 do fazy replikacji [61]. Glikoliza aktywowana jest w odpowiedzi na zwiększony poziom Fru-2,6-BP w cytoplazmie, a jego podwyższone ilości w jądrze mogą dostarczyć sygnał do bardziej efektywnego wykorzystania glukozy w celu ułatwienia proliferacji komórek [62]. Spadek aktywności enzymu PFKFB3 w fazie S prawdopodobnie ma na celu zahamowanie szlaku glikolizy i przekierowanie glukozy do szlaku pentozofosforanowego w celu przekształcenia w rybozo-5-fosforan, konieczny do syntezy nukleotydów [63]. REGULACJA PROCESU GLIKOLIZY Większość reakcji szlaku glikolizy jest odwracalna, z wyjątkiem etapów katalizowanych przez heksokinazę (HK), fosfofruktokinazę 1 (PFK1) oraz kinazę pirogronianową (PK). Precyzyjna regulacja aktywności tych enzymów umożliwia dostosowanie wydajności całego procesu do aktualnego zapotrzebowania komórki na energię. Negatywna regulacja glikolizy Głównym etapem glikolizy podlegającym regulacji jest reakcja fosforylacji fruktozo-6-fosforanu przeprowadzana przez fosfofruktokinazę 1. Enzym ten podlega allosterycznemu hamowaniu w obecności wysokiego poziomu ATP i aktywacji w momencie pojawienia się dużych ilości AMP. Dzięki temu szybko zmieniające się zapotrzebowanie komórki na energię może być w łatwy i wydajny sposób regulowane poprzez zmiany tempa samej glikolizy [14]. Podobnej regulacji podlega również kinaza pirogronianowa [64]. Poza tym PFK1 może być hamowana przez cytrynian, będący pierwszym produktem kompletnego cyklu Krebsa. Wysoki jego poziom sygnalizuje bardzo dużą ilość intermediatów cyklu Krebsa, a tym samym zmniejszone zapotrzebowanie na dalsze rozkładanie glukozy [65]. Również znaczne obniżenie ph skutkuje hamowaniem aktywności fosfofruktokinazy 1 przez jony H +. Taka regulacja ma na celu zapobieganie w warunkach beztlenowych nadmiernemu tworzeniu kwasu mlekowego, którego kumulacja mogłaby prowadzić do kwasicy [100]. Wykazano również, że potranslacyjna glikozylacja PFK1 w miejscu Ser529 w warunkach niedotlenienia prowadzi do zahamowania aktywności tego enzymu i przekierowania metabolizmu na szlak pentozofosforanowy [66]. Innymi negatywnymi regulatorami enzymów szlaku glikolizy są glukozo-6-fosforan hamujący aktywność heksokinazy, a także acetylo-coa oraz alanina w przypadku kinazy pirogronianowej [13]. Glukozo-6-fosforan będący produktem rekacji katalizowanej przez heksokinazę może allosterycznie hamować ten enzym. W przypadku formy mózgowej HK1 efekt ten może zostać zniesiony przez nieorganiczny fosforan (P i ) [26]. Acetylo-CoA może hamować aktywność kinazy pirogornianowej oraz obecnej w wątrobie glukokinazy [14]. Natomiast alanina, będąc aminokwasem mogącym powstać w wyniku transaminacji pirogronianu, jest wyznacznikiem ilości prekursorów do biosyntezy składników komórkowych [67]. W przypadku ich nadmiernego nagromadzenia, aminokwas ten poprzez allosteryczne hamowanie kinazy pirogronianowej, znacznie obniża tempo glikolizy. Postępy Biochemii 61 (4) 2015 449

Negatywna regulacja metabolizmu glukozy może również wynikać z obniżonej aktywności kinazy pirogronianowej (PKM2) w komórce (szczegóły powyżej opis PK). W wyniku tego dochodzi do akumulacji fosfoenolopirogronianu (PEP), który przez kompetycyjne hamowanie prowadzi do obniżenia aktywności izomerazy triozofosforanowej (TPI1), a tym samym zahamowania glikolizy na wczesnym jej etapie. Ma to szczególnie istotne znaczenie dla tempa proliferacji komórek nowotworowych oraz ich adaptacji do stresu oksydacyjnego [60]. Pozytywna regulacja glikolizy Fosfofruktokinaza 1 może być allosterycznie aktywowana przez AMP przez co w komórce wraz ze spadkiem stosunku ATP/AMP wzrasta aktywność tego enzymu [68]. Innym allosterycznym aktywatorem PFK1 jest fruktozo-2,6-bifosforan (F-2,6-BP) syntetyzowany przez 6-fosfofrukto-2-kinazę (PFKFB3). Metabolit ten silnie aktywuje PFK1 powodując stymulację glikolizy nawet w warunkach wysokiego stężenia ATP, co z kolei sprzyja między innymi zwiększeniu wykorzystania glukozy do proliferacji [69]. Pozytywnej regulacji podlega również kinaza pirogronianowa, jednak została ona zaobserwowana tylko w przypadku form M2, L oraz R. Fruktozo-1,6-bisfosforan będący produktem reakcji fosfofruktokinazy 1 może aktywować kinazę pirogoronianową [70]. Wykazano również pozytywną regulację PKM2 przez aminokwas serynę. W warunkach niedoboru składników do procesów biosyntezy, np. aminokwasów, aktywność PKM2 spada [71]. REPLIKACJA DNA Dokładne kopiowanie informacji genetycznej zawartej w podwójnej helisie DNA jest niezbędne do dziedziczenia cech określających fenotyp komórek oraz całych organizmów. Dlatego, nie jest zaskoczeniem, że w tak złożony proces zaangażowany jest szereg białek, których położenie i działanie musi być dokładnie kontrolowane w celu zapewnienia zarówno odpowiedniej jego wydajności, jak i precyzji. W badaniach przeprowadzonych nad inicjacją replikacji pokazano, że podstawowe mechanizmy powielania DNA, nawet u tak odległych ewolucyjnie organizmów, jak bakterie i ssaki, przebiegają w podobny sposób. Sugeruje się, że proces replikacji istniał już u ostatniego uniwersalnego przodka (LUA, ang. last universal ancestor) [72]. W komórkach eukariotycznych replikacja DNA zachodzi tylko podczas fazy S cyklu komórkowego i podobnie jak w przypadku bakterii jest ona semikonserwatywna. Proces powielania materiału genetycznego można podzielić na trzy etapy: inicjacji, wydłużania i terminacji [73]. Replikacja chromosomów rozpoczyna się w określonych rejonach DNA, w których wyznaczone białko lub białka inicjatorowe wiążąc się z DNA tworzą kompleks nukleoproteinowy. Następnie helikaza przez miejscowe rozplecenie helisy DNA tworzy parę widełek replikacyjnych, umożliwiając polimerazom dostęp do pojedynczych nici DNA i rozpoczęcie syntezy potomnych nici [74]. Około 50 lat temu opisano pierwszy mechanizm regulujący syntezę DNA [75]. Przedstawiał on proces wiązania białka inicjatorowego, kodowanego na chromosomie, do specyficznych regionów DNA zwanych regionami inicjacji replikacji (ang. origin) oraz wskazywał na kluczowe znaczenie tego etapu w powstawaniu nowych widełek replikacyjnych. Liczba miejsc inicjacji replikacji w genomie jest w przeważającej części zależna od rozmiaru chromosomu. Genomy bakteryjne i archeonów zwykle składają się z małego kolistego chromosomu, najczęściej z pojedynczym origin replikacji [72]. U najbardziej złożonych organizmów wielkość genomu oraz około 20 razy wolniejsze tempo poruszania się widełek replikacyjnych niż u bakterii [72] wymusiło istnienie wielu miejsc inicjacji replikacji, od ok. 400 u drożdży do aż 30000 50000 u ludzi [76]. Powielenie materiału genetycznego może nastąpić tylko raz na cykl komórkowy i aby to zapewnić, konieczne było wykształcenie odpowiednich mechanizmów ściśle regulujących ten proces. Zaburzenia w regulacji inicjacji replikacji mogą prowadzić do wytworzenia wielu kopii jednego regionu genomowego w pojedynczej komórce. Sprzyja to niestabilności genomu i często wiąże się z występowaniem nowotworów i innych chorób [77]. Również pominięcie pewnej części DNA podczas replikacji (na przykład wybranego genu supresorowego) może być niebezpieczne dla komórki. Podobnie jak w przypadku amplifikacji genów, taki błąd również może być przyczyną zapoczątkowania procesu transformacji nowotworowej komórek [78]. MIEJSCA INICJACJI REPLIKACJI U drożdży Saccharomyces cerevisiae na podstawie sekwencji zidentyfikowano miejsca inicjacji replikacji i określono je jako ARS (ang. Autonomously replicating sequences) [73]. Natomiast z badań przeprowadzonych na ludzkich komórkach wykazano, że eukariotyczne miejsca inicjacji replikacji są prawdopodobnie w większym stopniu definiowane organizacją chromatyny niż sekwencją DNA. Jednak nie są one całkowicie przypadkowe, na co wskazywałby fakt ich występowania w sekwencjach zachowanych w ewolucji [79]. Ponadto wiele origin odpowiada aktywnym transkrypcyjnie regionom DNA lub innym rejonom umożliwiającym dostęp do białek wiążących się do origin (OBP, ang. origin binding proteins). Zalicza się do nich sekwencje bogate w pary AT, powtórzenia dwunukleotydowe czy asymetryczne sekwencje puryna-pirymidyna [79]. W chromosomach eukariotycznych istnieje wiele potencjalnych miejsc inicjacji replikacji, jednak nie wszystkie funkcjonują w każdej komórce. Również nie wszystkie origin są aktywne w tym samym momencie, przy czym kolejność ich uruchamiania podlega ścisłej kontroli [76]. Ponieważ mogą one być aktywowane w różnych momentach fazy S, często klasyfikuje się je jako origin aktywowane we wczesnej, w połowie lub pod koniec tej fazy. Poza tym, tylko część wszystkich potencjalnych miejsc inicjacji replikacji jest używana w każdym cyklu komórkowym, natomiast inne są aktywowane i wykorzystywane w warunkach, które istotnie wpływają na przebieg fazy S, takich jak uszkodzenie DNA lub zmiany warunków wzrostu [76,79]. 450 www.postepybiochemii.pl

Wydajność uruchamiania origin u drożdży Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces pombe wynosi poniżej 50% [80]. Z kolei u zwierząt tkankowych jest ona jeszcze mniejsza i osiąga w określonych domenach replikacji tylko 5 20% [81]. INICJACJA REPLIKACJI Wiele danych dotyczących inicjacji replikacji uzyskano z badań przeprowadzonych w komórkach drożdży. Wskazują one, że inicjacja replikacji rozpoczyna się od przyłączenia heksametrycznego kompleksu ORC (ang. Origin Recognition Complex) do origin replikacji [72]. Budowę kompleksu replikacyjnego oraz poszczególne etapy jego powstawania przedstawia rycina 3. Spośród wszystkich podjednostek ORC, pięć należy do rodziny ATPaz związanych z różnymi aktywnościami komórkowymi (AAA +, ang. ATPases associated with diverse cellular activities). Białka wchodzące w skład kompleksu ORC wraz z dodatkowymi białkami Cdc6 i Cdt1 (czynniki licencjonujące) odpowiadają za rekrutację białek MCM (ang. Minichromosome Maintenance), pełniących funkcję helikazy. U wyższych eukariota do inicjacji replikacji również wymagana jest obecność ORC, Cdc6 oraz Cdt1. U ssaków kompleks ORC składa się z podjednostek ORC2-ORC5, które mogą słabo oddziaływać z ORC1 oraz ORC5 [82]. Ponadto u wyższych eukariota ORC przyłącza się nie tylko do miejsc inicjacji replikacji, ale także do centrosomów, centromerów, heterochromatyny czy sekwencji telomerowych [82,83]. Dodatkowo badania na ludzkich komórkach wykazały udział białka ORCA w przyłączaniu się kompleksu ORC do chromatyny, białko to oddziałuje również z Cdt1 oraz gemininą [83]. U wyższych eukariota, helikaza jest kompleksem zbudowanym z sześciu podjednostek (białka MCM 2-7) należących do białkowych ATPaz AAA +, z których każda z nich kodowana jest przez oddzielny, homologiczny gen [84]. Pomimo, iż białka MCM po raz pierwszy zostały wyizolowane z mutantów drożdży Saccharomyces cerevisiae [85], to ich homologi występują u wszystkich organizmów eukariotycznych. U drożdży, podczas inicjacji replikacji, białka MCM 2-7 łączą się z białkiem Cdt1, tworząc kompleks, który zostaje zrekrutowany do powstałego kompleksu DNA-ORC-Cdc6. Następnie w wyniku hydrolizy ATP przez białko Cdc6 dochodzi do zmian konformacyjnych w kompleksie ORC i uwolnienia Cdt1 [86]. Jednocześnie ma miejsce umieszczenie helikazy, która po otoczeniu jednej z nici rodzicielskich i pozyskaniu energii z hydrolizy ATP, przesuwa się wzdłuż pojedynczej nici DNA w kierunku 3-5. Ładowanie białek helikazy MCM 2-7 zachodzi pod koniec mitozy oraz w fazie G 1 i stanowi potwierdzenie gotowości do replikacji [79]. Wszystkie te białka razem tworzą kompleks prereplikacyjny (pre-rc) [73,79,87]. Po umieszczeniu helikazy MCM 2-7 w miejscu inicjacji replikacji białko Cdt1 odłącza się od kompleksu pre-rc i w komórkach drożdży eksportowane jest do cytoplazmy [79]. W ludzkich komórkach Cdt1 podczas fazy S częściowo ulega proteolizie przy udziale jednego z dwóch kompleksów mających właściwości ligazy ubikwityny, SCF Skp2 lub Ddb1-Cu14-Roc-1 [88]. Jednak, aby możliwe było szybkie montowanie kompleksu pre-rc u wyższych eukariontów część wolnego białka Cdt1 pozostaje jedynie inaktywowana przez związanie z gemininą występującą w fazach S-G 2 -M. Za degradację gemininy w czasie mitozy odpowiada kompleks APC/C (ang. anaphase promoting complex/cyclosome) [87]. Ścisła kontrola poziomu oraz przyłączania białek pre-rc do rejonu origin replikacji, uniemożliwia ponowne utworzenie kompleksu replikacyjnego i rozpoczęcie replikacji genomowego DNA w kolejnych fazach tego samego cyklu komórkowego. Ufosforylowanie białek Orc1, Cdt1 oraz Cdc6 prowadzi do zahamowania ich aktywności. W komórkach ludzkich białko ORC1, podobnie jak wspomniane wcześniej białko Cdt1, po ubikwitylacji ulega degradacji podczas fazy S. Natomiast fosforylacja Cdc6 chroni to białko przed degradacją. Wiadomo, że część Cdc6 białka eksportowana jest do cytoplazmy [89]. Taki dynamicznie zmieniający się układ gwarantuje, że pre-rc powstaje tylko w fazie G 1 i jest ściśle hamowany poza nią, służąc, jako jeden z mechanizmów licencjonowania replikacji, który jest istotny dla utrzymania stabilności genomu [73]. Aby uformować aktywną helikazę wymagana jest obecność dodatkowych białek Cdc45 oraz GINS, które zarówno u drożdży, jak i u wyższych eukariota tworzą razem kompleks CMG (Cdc45-MCM 2-7-GINS) [79,87]. Bez tych dodatkowych białek MCM 2-7 nie ma aktywności helikazy i nie ma możliwości przesuwania się wzdłuż nici DNA [90]. Do zmiany konformacji oraz aktywacji MCM 2-7 dochodzi w fazie S pod wpływem połączonego działania kinazy DDK (zależna od Dbf4 kinaza Cdc7) oraz kinazy CDK [79,87]. U ssaków aktywność kinaz Cdc7 oraz Cdk2 zależy od białek będących pod kontrolą czynników transkrypcyjnych E2F: Dbf4 w przypadku Cdc7 oraz cyklin A i E dla Cdk2 [72,79,91]. Kinazy te u drożdży promują wiązanie Cdc45, GINS, Sld3, Sld2 oraz Dpb11 do miejsc origin replikacji. Wszystkie one są istotne do aktywacji origin [73,92]. U kręgowców zidentyfikowano homologi drożdżowych białek niezbędnych do rekrutacji białka Cdc45 oraz inicjacji replikacji, są to: RecQL4 (Sld2), TICRR (Sld3) oraz TopBP1 (Dbp11) [83]. Po aktywacji kompleks helikazy MCM 2-7 przechodzi z podwójnego heksameru otaczającego podwójną nić DNA do pojedynczego heksameru CMG otaczającego ssdna. Mechanizm tego przejścia nie został dotąd poznany. Kompleks CMG ma aktywność helikazową i porusza się wzdłuż widełek replikacyjnych rozwijając DNA [92]. U wyższych eukariota do załadowania MCM 2-7 mogą być wymagane dodatkowe białka, jak na przykład Mcm9 i Hbo1 u żab z rodzaju Xenopus oraz ludzi (szczegółowy opis [93]). Budowa kompleksu replikacyjnego oraz poszczególne etapy jego powstawania u Metazoa przedstawione są na rycinie 3. Po utworzeniu pojedynczych nici DNA swoją aktywność rozpoczynają polimerazy DNA. Za przyłączenie polimeraz do miejsc początku replikacji odpowiadają białka związane z kompleksem pre-rc, tworzące wraz z nim tzw. widełki replikacyjne. Za rekrutację polimerazy α do kompleksu u wszystkich eukariota odpowiada białko Mcm10 łączące się z MCM 2-7 [94]. Natomiast za przyłączenie polimeraz δ i ε odpowiada Cdc45, wpływający także na przejście kompleksu pre-rc w pre-ic (kompleks pre-inicjacyjny) [95]. Postępy Biochemii 61 (4) 2015 451

Rycina 3. Budowa kompleksu replikacyjnego oraz poszczególne etapy jego powstawania u Metazoa (na podstawie [93], zmienione). Formowanie kompleksu prereplikacyjnego (pre-rc) zachodzi w fazie G 1 i rozpoczyna się od wiązania kompleksu ORC do miejsca inicjacji replikacji. Następnie dołącza się białko Cdc6 konieczne do załadowania białek helikazy MCM przy pomocy Cdt1. Do aktywacji helikazy w fazie S cyklu komórkowego niezbędna jest obecność białek Cdc45 oraz GINS. Następnie po utworzeniu widełek replikacyjnych rozpoczyna się synteza nowych nici DNA- ciągłej przez polimerazę ε oraz opóźnionej przez polimerazę δ. Dodatkowo w regulacji tego procesu biorą udział kinazy CDK2 oraz Cdc7 fosforylujące białka kompleksu pre-rc w celu skierowania ich do degradacji oraz przyłączające grupę fosforanową do czynników biorących udział w aktywacji helikazy oraz wiązaniu polimeraz do miejsca inicjacji replikacji. Pierścieniom odpowiadają: niebieski replikacyjny czynnik C (RFC), różowy antygen PCNA. Szczegółowy opis w tekście. ELONGACJA I TERMINACJA Wieloenzymatyczny kompleks zawierający polimerazę DNA katalizuje przyłączanie deoksyrybonukleotydów do 3 końca DNA. Za syntezę starterów koniecznych do inicjacji syntezy DNA odpowiada polimeraza α, w skład, której wchodzi podjednostka o aktywności prymazy [96]. Aby zapobiec ponownej asocjacji nici DNA, po rozpleceniu helisy do jednoniciowego DNA dzięki aktywności GINS przyłączają się białka A (RPA, ang. replication protein A) [90]. Dodatkowo, aby zwiększyć kontakt polimerazy z DNA i wpłynąć na jej procesywność, konieczny jest udział antygenu jądrowego proliferujących komórek PCNA (ang. proliferating cell nuclear antigen). Za regulację oddziaływania antygenu PCNA z kompleksem polimerazy i DNA odpowiada replikacyjny czynnik C RFC (ang. replication factor C) [97]. Ponieważ nici DNA są antyrównoległe, a sama replikacja może zachodzić tylko w jednym kierunku, widełki replikacyjne są asymetryczne. Na jednej nici (wiodącej) dodawanie nukleotydów odbywa się w sposób ciągły dzięki aktywności polimerazy ε [97]. Natomiast na nici opóźnionej synteza odbywa się w formie krótkich fragmentów Okazaki wymagających oddzielnych starterów. Gdy polimeraza δ napotka starter poprzedniego fragmentu Okazaki, następuje jego usunięcie. W proces ten zaangażowane są białka o aktywności nukleazy: RNaza H, Dna2 (DNA helikaza/endonukleaza 2) oraz endonukleaza Fen-1 (ang. Flap endonuclease) [98]. Powstała po usunięciu starteru luka zostaje wypełniona przez polimerazę δ. Natomiast za połączenie powstałych fragmentów Okazaki odpowiada zależna od ATP ligaza DNA I. Istotny dla tego procesu jest również udział antygenu PCNA oraz czynnika RFC [97]. Terminacja następuje w miejscach określanych jako TER (ang. termination regions), w których spotykają się nowo syntetyzowane nici DNA powstałe z dwóch sąsiadujących miejsc origin. Badania na drożdżach Saccharomyces cerevisiae wskazują na istotny udział w tym procesie białka helikazy Rrm3 oraz topoizomerazy Top2 [99]. Ponieważ ruch polimerazy odbywa się tylko w jednym kierunku, usunięcie terminalnego startera RNA z nici opóźnionej prowadzi do powstania cząsteczki potomnej z niekompletnym końcem 5. Skutkuje to skróceniem sekwencji DNA po każdym cyklu replikacyjnym, wyznaczając tym samym limit liczby podziałów komórki, który u człowieka wynosi około 80 [100]. Strukturalne elementy na końcu chromosomu ulegające skróceniu zwane są telomerami. Osiągnięcie krytycznej długości telomerów prowadzi do indukcji replikacyjnego stanu spoczynkowego, różnicowania lub apoptozy [101]. DNA intensywnie dzielących się komórek, a także komórek zarodkowych, macierzystych czy skóry chronione jest przed skracaniem po każdym kolejnym cyklu replikacyjnym dzięki aktywności odwrotnej transkryptazy, zwanej telomerazą [101]. Natomiast w komórkach somatycznych nie stwierdza się obecności tego enzymu [100]. Reaktywacja aktywności telomerazy związana jest z procesem nowotworzenia [102]. CENTRALNY METABOLIZM WĘGLA A REPLIKACJA DNA Dwa główne procesy, metabolizm oraz replikacja DNA, odpowiedzialne za utrzymanie oraz powielenie materiału genetycznego komórki dotychczas badane były oddzielnie, z nielicznymi wyjątkami dotyczącymi organizmów prokariotycznych [103]. Replikacja DNA, jako proces wymagający 452 www.postepybiochemii.pl

dużej ilości energii w sposób oczywisty musi być zależna od metabolizmu komórkowego. Jednak przez długi czas uważano, że zależność ta jest jedynie pośrednia i potencjalnie może wynikać z różnej dostępności energii komórkowej lub prekursorów makrocząsteczek [104]. Jako potwierdzenie tej tezy prezentowano wyniki badań przeprowadzonych w warunkach niedoboru składników odżywczych i związanej z nim produkcji w komórkach bakterii specyficznych alarmonów, takich jak czterofosforan guanozyny (ppgpp) oraz cykliczny AMP (camp) [103]. Również analiza metabolicznego cyklu drożdży (YMC, ang. yeast metabolic cycles) ujawniła, że każda jego faza może być utożsamiana z równoważną fazą klasycznego cyklu komórkowego. Późniejsze badania dodatkowo wykazały, że stężenie wewnątrzkomórkowych metabolitów będących składnikami biosyntezy, w tym aminokwasów, nukleotydów oraz energetycznych związków pośrednich jak NADP(H) czy acetylo-coa zmieniało się okresowo wraz z cyklami metabolicznymi [105]. CENTRALNY METABOLIZM WĘGLA A REPLIKACJA DNA U PROKARIOTA Przeprowadzone przed kilkoma laty badania wykazały, że replikacja DNA może być bezpośrednio powiązana z centralnym metabolizmem węgla, a w szczególności z glikolizą u Gram-dodatnich bakterii Bacillus subtilis [106]. Zaobserwowano specyficzną supresję warunkowo letalnych (temperaturo-wrażliwych) mutacji w genach kodujących białka biorące udział w procesie replikacji DNA (DnaE polimeraza DNA zaangażowana w syntezę nici opóźnionej, DnaC helikaza, homolog białka DnaB u Escherichia coli oraz DnaG prymaza) poprzez wprowadzenie mutacji w genach kodujących enzymy zaangażowane w reakcje w późnych etapach glikolizy i glukoneogenezy. Na podstawie uzyskanych danych zasugerowano istnienie domniemanego metabolicznego łącznika mogącego powodować zmiany w konformacji białek replikacyjnych, aby modulować właściwości replisomu [106]. Podobne analizy przeprowadzono w Gram-ujemnych komórkach bakterii Escherichia coli [107]. Uzyskane wyniki potwierdziły wcześniej obserwowane zależności w przypadku genów dnae, dnab oraz dnag (Ryc. 4). Wykazano również efekt niwelowania temperaturo-wrażliwości w przypadku mutacji w genach dnan (gen kodujący podjednostkę beta polimerazy DNA III) i dnaa (gen kodujący białko inicjatorowe). Ponadto zaobserwowano wzrost bakterii w subletalnych dla tych mutantów temperaturach nie tylko w przypadku braku enzymów zaangażowanych w szlak glikolizy i glukoneogenezy (geny: pgi izomerazy glukozofosforanowej i gpma fosfogliceromutazy I), ale również w innych szlakach CCM, takich jak szlak pentozofosforanowy (gen tktb transketolazy II) oraz octanowy (geny pta acetylotransferazy fosforanowej i acka kinazy octanowej). Sugeruje to istnienie u Escherichia coli szerszego niż u Bacillus subtilis powiązania pomiędzy replikacją DNA a CCM [107]. U Bacillus subtilis mutacje w genach związanych z metabolizmem komórkowym wpływały głównie na etap elongacji [106], natomiast u Escherichia coli wykazano powiązanie między CCM a replikacją zarówno na etapie inicjacji, jak i elongacji [107]. Ponadto Maciąg i wsp. [108] wykazali, że wpływ enzymów CCM na replikację DNA dotyczy nie tylko kontroli inicjacji i wydajności syntezy DNA, ale również wierności tego procesu. Dysfunkcje odpowiednich enzymów CCM zaangażowanych w reakcje szlaku pentozofosforanowego (produkt genu zwf 1-dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu), metabolizmu pirogronianu (produkty genów pta oraz acka) oraz cyklu Krebsa (produkty genów acnb hydratazy akonitynianowej B, icd dehydrogenazy izocytrynianowej specyficznej dla NADP + ) prowadziły do zniesienia, bądź wzmocnienia zaburzeń w wierności powielania DNA, powodowanych przez mutacje dnaq49 oraz Rycina 4. Wpływ mutacji w wybranych genach kodujących białka zaangażowane w reakcje centralnego metabolizmu węgla na mutacje w genach odpowiadających wybranym białkom biorącym udział w replikacji DNA w komórkach Bacillus subtilis oraz Escherichia coli ([103], zmienione). Kolor pomarańczowy dotyczy danych uzyskanych dla B. subtilis, niebieski dla E.coli. Obecność kropki świadczy o zaobserwowanym efekcie niwelowania temperaturo-wrażliwości powodowanej mutacją w danym genie związanym z replikacją DNA przez mutację w odpowiednim genie szlaku metabolicznego. Geny i kodowane przez nie białka: pgm mutaza fosfoglicerynianowa, pgk kinaza fosfoglicerynianowa, eno enolaza, pyk kinaza pirogronianowa, pgi izomeraza glukozofosforanowa i gpma fosfogliceromutaza I, tktb- transketolaza II, pta acetylotransferaza fosforanowa, acka kinaza octanowa, dnae polimeraza DNA zaangażowana w syntezę opóźnionej nici, dnag prymaza, dnan beta podjednostka polimerazy DNA III, dnaa białko inicjatorowe. dnax36 (odpowiednio geny kodujące podjednostki ε i τ polimerazy DNA III). Dla przykładu, mutacje w genach pta i acka powodowały efekt supresji w szczepie dnaq49, natomiast w szczepie dnax36 wzmacniały obserwowane negatywne efekty fenotypowe [108]. Wyniki te sugerują istnienie bardziej skomplikowanego niż wcześniej zaproponowany przez Janniere i wsp. [106] mechanizmu łączącego centralny metabolizm węgla z replikacją DNA. Postępy Biochemii 61 (4) 2015 453