Nazwa pola Komentarz Nazwa przedmiotu (w języku Metody analityczne w chemii bioorganicznej polskim oraz angielskim) Analytical methods in bioorganic chemistry Jednostka oferująca przedmiot CBMiM PAN Liczba punktów ECTS 4 Sposób zaliczenia Egzamin na ocenę egzamin pisemny, jedno pytanie z 1 godziny wykładu Język wykładowy polski Określenie, czy przedmiot Wymagane zaliczenie jednorazowe może być wielokrotnie zaliczany Skrócony opis przedmiotu W ramach wykładu zostaną zaprezentowane podstawy fizyczne magnetycznego rezonansu jądrowego NMR i omówienie podstawowych metod spektroskopii NMR. Przedstawione zostaną metody krystalograficzne w analizie strukturalnej białek i kwasów nukleinowych. Przedstawione zostaną metody sekwencjonowania DNA. Zostaną przedstawione chemiczne i fizykochemiczne podstawy oddziaływań cząsteczek chromatografowanych substancji z różnego typu wypełnieniami stosowanymi w chromatografii cieczowej. Omówione zostaną parametry wypełnień istotne dla prawidłowego doboru typu wypełnienia do zadania analitycznego. Przedyskutowane zostaną parametry elementów konstrukcyjnych. Przedstawione zostaną enzymatyczne i chemiczne metody sekwencjonowania białek. W obrębie metod enzymatycznych omówione zostaną schematy analiz z wykorzystaniem odpowiednich proteaz, w tym dipeptydaz. Omówione zostaną metody chemiczne sekwencjonowania od N-końca (metoda Edmana) oraz od C-końca (metoda z zastosowaniem fenyloizotiocyjanianu). Omówione zostanie zagadnienie sekwwencjonowania z użyciem metody Tandem Mass Spectrometry. W ramach wykładu zostaną przedstawione także metody spektralne (spektrometria UV/VIS i spektrofluorymetria) ilościowego oznaczania oligonukleotydów i białek, badania przemian fazowych kompleksów biopolimerów i wykrywania oddziaływań gospodarz-ligand). W ramach wykładu omawiane zostaną podstawowe techniki izolacji DNA, RNA i białek z preparatów biologicznych, a także separacji (elektroforeza) i identyfikacji (hybrydyzacja) biomolekuł, fizyczne podstawy elektroforezy i podstawowe techniki elektroforetyczne do separacji biomolekuł: elektroforeza żelowa i kapilarna. Przedstawiona będzie elektroforeza dwukierunkowa i jej zastosowanie w badaniach proteomicznych oraz techniki hybrydyzacyjne oraz immunoenzymatyczne (Southern, Northern i Western), a także ich praktyczne zastosowanie w diagnostyce medycznej, analizie mutacji genetycznych i badaniach z wykorzystaniem białek rekombinantowych. Pełny opis przedmiotu Słuchacze zapoznają się z metodami rejestracji widm 1H, 13C, 31P, 29Si oraz 15N. Omówione zostaną parametry jakościowe i ilościowe dostępne w analizie widm NMR. Omawiany będzie wpływ struktury badanych związków na obraz podstawowych widm NMR. Zaprezentowane zostaną również podstawowe sekwencje pulsowe i 1
techniki wykorzystywane do rejestracji widm DEPT, INEPT. Omówione zostaną podstawowe definicje związane z krystalografią i analizą rentgenostrukturalną, metody krystalizacji biocząsteczek, zjawiska dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego, metody rozwiązywania struktury(problemu fazowego) w oparciu o dane dyfrakcyjne (metody: bezpośrednia, SIR/MIR, MR, MA), udokładnianie modelu struktury, parametry oceny jakości uzyskanego modelu struktury oraz znaczenie stosowania badań krystalograficznych w rozwoju nauki. Przedstawione zostanie sekwencjonowanie DNA metodą Maxama- Gilberta, metodą Sangera z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych trifosforanów nukleozydów, narzędzia biologii molekularnej stosowane w sekwencjonowaniu genomów (PCR, technologia rekombinacji genów, chromosome walking), schemat sekwencjonowania genomów, zsekwencjonowanie ludzkiego genomu. Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki DNA, sekwencjonowanie z użyciem nanoporów. Omówione zostaną metody analizy i rozdziału związków organicznych, polimerów i biopolimerów stanowiących podstawy współczesnej chemii, biochemii i chemii medycznej a szczegónie podstawowe pojęcia w zakresie typów chromatografii cieczowej i obszarów jej stosowania (chemia, farmacja, biochemia i biologia molekularna), stosowane techniki rozdziału (na żelu krzemionkowym, na odwrotnej fazie, złoża jonowymienne, filtracja żelowa) i mechanizmy oddziaływań (siły Van derwaalsa, oddziaływania hydrofobowe, jonowe) wykorzystywane w danej rodzinie metod, charakterystyka podstawowych typów wypełnień, rodzaj grup funkcyjnych, stopień rozwinięcia powierzchni, porowatość złoża a wielkość separowanych cząsteczek, trwałość nośnika (żel krzemionkowy, złoża polimerowe), charakterystyka podstawowych typów modułów chromatografów cieczowych, pompy tłokowe i strzykawkowe, detektory UV-VIS, IR, RI, MS, ELSD, typowe objawy niedomagań kolumn chromatograficznych i elementów chromatografu,a także sposoby ich unikania lub naprawy, wzrost ciśnienia wstecznego, ubytek złoża, niewłaściwa średnica wewnętrzna użytych kapilar połączeniowych. Omówione zostaną metody enzymatycznego i chemicznego określania sekwencji aminokwasów w peptydach a w szczególności: wstępna hydroliza enzymatyczna dużych białek i izolowanie otrzymanych peptydów, sposoby odblokowywania N-terminalnej grupy aminowe, schematy analiz z wykorzystaniem odpowiednich proteaz, w tym dipeptydaz, metoda chemiczna sekwencjonowania od N-końca (metoda Edmana)i jej ograniczenia, metoda chemiczna sekwencjonowania od C-końca i jej ograniczenia, metody ochrony wrażliwych aminokwasów (Ser, Thr, Cys, Trp), metody sekwencjonowania z użyciem techniki spektrometrii mas, metody identyfikowania aminokwasów uwolnionych w kolejnych cyklach degradacji (znaczniki UV i fluorescencyjne, znakowanie 2
radioizotopowe). Część wykładu poświęcona metodom spektralnym obejmować będzie zastosowanie spektrometrii UV/VIS i spektrofluorymetrii w następujących zagadnieniach badawczych - określanie ilościowe kwasów nukleinowych i białek w oparciu o charakterystyczne współczynniki ekstynkcji, badanie stabilności termicznej struktur wyższego rzędu (dupleksów i trypleksów oligonukleotydowych) przez pomiar krzywych mięknięcia, zastosowanie fluorescencyjnych molecular beacons w badaniach przejść fazowych kwasów nukleinowych, zastosowanie molecular beacons w badaniach oddziaływań białek z niskocząsteczkowymi ligandami. Wykład obejmie także: 1. fizyczne podstawy elektroforezy 2. pojęcie ruchliwości elektroforetycznej 3. rodzaje i funkcje nośników elektroforetycznych 4. elektroforeza w żelu poliakryloamidowym (PAGE) a. elektroforezę natywną i denaturującą b. wykorzystanie PAGE do rozdziału biocząsteczek c. wyznaczanie masy cząsteczkowej białek d. ogniskowanie izoelektryczne 5. elektroforezę dwukierunkową 6. elektroforezę agarozową 7. elektroforezę agarozową w pulsującym polu elektrycznym 8. elektroforezę kapilarną a. zjawisko elektroosmozy b. rodzaje elektroforezy kapilarnej 9. techniki hybrydyzacyjne i ich wykorzystanie w badaniach nad biocząsteczkami 10. hybrydyzację Southern w badaniach DNA a. delecje/insercje b. mutacje punktowe c. polimorfizmy DNA d. typowanie DNA 11. hybrydyzację Northern w badaniach RNA, identyfikację i poziom ekspresji mrna 12. hybrydyzacja Western w badaniach białek a. identyfikacja białek endogennych i rekombinantowych b. poziom ekspresji i fosforylacji białek 13. izolowanie białek, DNA i RNA z komórek a. metoda Chomczyńskiego b. izolacja DNA lub RNA na złożach krzemionkowych c. izolacja mrna z wykorzystaniem oligo-dt d. izolacja białek rekombinantowych zawierających metkę His lub GST Literatura 1. RM. Silverstein, FX Webster, DJ. Kiemle; Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych. PWN 2007 2. W. Zieliński, A. Rajca, Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych 3. H. Günter, Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego, PWN 1983 4. FW. Wherli, T. Wirthlin, Interpretacja widm w spektroskopii 13C NMR, PWN 1985. 5. H. Friebolin, One- and Two- Dimensional NMR Spectroscopy. VCH 1991. 3
6. Metody krystalografii, Z. Kosturkiewicz, Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań 2000. Crystallography made crystals clear. A guide for users of macromolecular models, G. Rhodes, Academic Press Inc., San Diego 1993. 7. "Principles of protein X-ray crystallography", J. Drenth, Springer- Verlag, New York 1999. 8. Chemia Bioorganiczna, 9. J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer PWN wyd. 5, 2005 9. Artykuły z bazy PubMed 10. Doniesienia internetowe 11.CRC Handbook of HPLC for the separation of amino acids, peptides and proteins. W.S. Hancock ed., CRC Press, Inc., Boca Raton., 1984 12. P. Guga, Konfigurowanie Systemów HPLC. Analityka, 1/2004, 28-34. 13. Drukowane i dostępne w internecie materiały informacyjne firm produkujących chromatografy cieczowe i kolumny chromatograficzne (Waters, Dionex, Agilent, Varian), 14. Hanno Steen, Matthias Mann. The abc's (and xyz's) of peptide sequencing. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 5:699-711, 2004. 15. Coon, J. J. (April 13, 2009). "Collisions or Electrons? Protein Sequence Analysis in the 21st Century". Anal. Chem. 81 (9): 3208 3215. doi:10.1021/ac802330b. 16.http://www.molecularbeacons.org/download/antony,jbsd01(19)49 7.pdf http://www.auburn.edu/~santosr/protocols/oligoprotocols.pdf http://www.ecoli.sk/files/documents/quantification.pdf 17. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques, 15, 532-537. 18. Introduction to capillary electrophoresis Beckman Coulter handbook, www.lumexpol.com 19. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 20. Elektroforeza przykłady zastosowań - opracowanie zbiorowe pod redakcją Bogdana Walkowiaka i Violetty Kochmańskiej Efekty uczenia się Słuchacz zapoznaje się z podstawami fizycznymi spektroskopii NMR i poznaje podstawowe parametry spektralne. Poznaje podstawowe techniki rejestracji widm 1D i 2D. Student (doktorant) zapoznaje się z podstawowymi pojęciami w zakresie krystalografii biocząsteczek, poznaje stosowane techniki krystalizacji biocząsteczek, techniki pomiarowe i metody rozwiązywania struktur, zapoznaje się z procesem udokładniania i oceny uzyskanej struktury oraz uzyskuje wiedzę na temat metod sekwencjonowania, zasady ich działania i zastosowania w określonych warunkach. Doktorant zapoznaje się z podstawowymi pojęciami w zakresie podstawowych typów chromatografii cieczowej i obszarów jej stosowania (chemia, farmacja, biochemia i biologia molekularna) poznaje stosowane techniki (rozdział na żelu krzemionkowym, na odwrotnej fazie, złoża jonowymienne, filtracja żelowa) i mechanizmy oddziaływań (siły Van derwaalsa, oddziaływania hydrofobowe, jonowe) wykorzystywanych w danej rodzinie metod. Poznaje charakterystykę podstawowych typów wypełnień, charakterystykę podstawowych typów modułów 4
chromatografów cieczowych (pompy, detektory). Poznaje typowe objawy niedomagań kolumn chromatograficznych i elementów chromatografu,a także sposoby ich unikania lub naprawy. Doktorant zapoznaje się z podstawowymi pojęciami w zakresie enzymatycznych i chemicznych metod sekwencjonowania peptydów. Poznaje zagadnienia doboru enzymów dla uzyskania peptydów, które można poddać sekwencjonowaniu. Poznaje podstawowe metody odblokowywania N-terminalnych grup aminowych..poznaje metody chemicznego sekwencjonowania peptydów od N- i C- końca.poznaje metody sekwencjonowania z użyciem techniki spektrometrii mas. Poznaje metody identyfikowania aminokwasów uwolnionych w kolejnych cyklach degradacji. Doktorant zapoznaje się z podstawowymi pojęciami w zakresie zastosowania spektrometrii UV/VIS i spektrofluorymetrii w badaniach ilościowych biopolimerów oraz w badaniach niektórych ich przemian fazowych, poznaje zagadnienia określania ilościowego kwasów nukleinowych i białek w oparciu o charakterystyczne współczynniki ekstynkcji, poznaje podstawowe metody badania stabilności termicznej struktur wyższego rzędu, poznaje zasady zastosowania fluorescencyjnych markerów typu molecular beacons. Metody i kryteria oceniania Praktyki zawodowe w ramach przedmiotu Doktorant ma możliwość zaznajomić się z metodami izolacji RNA, DNA i białek z preparatów komórkowych, podstawowymi pojęciami i technikami wykorzystywanymi do analizy biomolekuł: elektroforezą, western, southern i northern blotingiem, obszarami zastosowań omówionych technik, przede wszystkim w badaniach podstawowych, diagnostyce medycznej, biotechnologii, Ocena każdego pytania w skali 1 do 10, zaliczenie po uzyskaniu co najmniej 60% punktów. Nie dotyczy 5
B) Opis przedmiotu cyklu Nazwa pola Cykl dydaktyczny, w którym przedmiot jest realizowany Forma(y) i liczba godzin zajęć oraz sposoby ich zaliczenia Komentarz Pierwszy rok studium doktoranckiego, semestr II Wykład, 16 godzin Forma zaliczenia egzamin pisemny Imię i nazwisko koordynatora/ów przedmiotu cyklu Metody dydaktyczne Literatura Prof.dr Barbara Nawrot Wykład interaktywny Jak wyżej 6