CHEMIA DYDAKTYKA EKOLOGIA METROLOGIA 2008, R. 13, NR 1-2 33 Anna Sadowska-Rociek 1 i Ewa Cieślik 1 1 Małopolskie Centrum Monitoringu i Atestacji śywności Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków tel./fax 012 662 48 27, fax 012 662 48 25 email: asadowska-rociek@ar.krakow.pl STOSOWANE TECHNIKI I NAJNOWSZE TRENDY W OZNACZANIU POZOSTAŁOŚCI PESTYCYDÓW W śywności METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ APPLIED AND RECENTLY DEVELOPED METHODS FOR DETERMINATION OF PESTICIDE RESIDUES IN FOOD BY GAS CHROMATOGRAPHY Streszczenie: Omówiono zagadnienia dotyczące oznaczania pozostałości pestycydów w produktach spoŝywczych metodą chromatografii gazowej. Scharakteryzowano zarówno dotychczasowe, jak i nowo opracowane techniki uŝywane do ekstrakcji pestycydów oraz metody oczyszczania ekstraktów. Przedstawiono trudności analityczne występujące przy przygotowaniu próbek do analizy spowodowane obecnością w Ŝywności złoŝonej matrycy biologicznej, zróŝnicowanymi właściwościami fizykochemicznymi pestycydów, a takŝe małymi stęŝeniami tych związków w Ŝywności. Scharakteryzowano najnowsze trendy w ich analityce: dwuwymiarową chromatografię gazową, metodę QuEChERS, a takŝe zastosowanie kalibracji z wykorzystaniem matrycy próbki oraz związków chroniących anality. Słowa kluczowe: pestycydy, Ŝywność, metody analityczne, chromatografia gazowa, QuEChERS Summary: The paper deals with the issues relating to determination of pesticide residues in food by gas chromatography. The commonly known as well as recently developed techniques used for the extraction of pesticides and methods for cleaning-up extracts are characterised. Analytical problems occurring in the preparation of samples for analysis (the presence of complex matrix, diverse physicochemical properties of pesticides, their low concentrations in food) are briefly described. The paper also presents the latest trends in analytics of these compounds: two-dimensional gas chromatography, the QuEChERS method, the application of matrix-matched calibration, and the use of analyte protectants. Keywords: pesticides, food, analitycal methods, gas chromatography, QuEChERS Wprowadzenie Pestycydy są jednymi z najbardziej toksycznych substancji zanieczyszczających środowisko. Szczególnie niebezpieczna jest ich obecność w Ŝywności, poniewaŝ stanowi ona łatwe źródło naraŝenia zdrowia ludzkiego na zatrucia. Dlatego teŝ niezbędne jest kontrolowanie poziomu pozostałości pestycydów w Ŝywności za pomocą dostępnych metod analitycznych. Wybór odpowiedniej procedury badawczej w duŝej mierze uwarunkowany jest rodzajem produktu spo- Ŝywczego (matrycą próbki) oraz strukturą i budową chemiczną oznaczanego pestycydu. Obecnie dąŝy się jednak do opracowania tzw. multimetod (multiresidue methods), zwanych takŝe metodami wielopozostałościowymi lub technikami równoczesnego oznaczania pozostałości wielu składników [1, 2]. Techniki te pozwalają oznaczyć w danej grupie produktów Ŝywnościowych pozostałości pestycydów naleŝących do róŝnych grup chemicznych. Jest to o tyle trudne, Ŝe związki te w zaleŝności od budowy chemicznej mają zróŝnicowane właściwości fizykochemiczne [3]. Optymalna, wielopozostałościowa metoda oznaczania pozostałości pestycydów w Ŝywności powinna spełniać następujące kryteria [4]: umoŝliwić jednoczesne wykrywanie duŝej liczby substancji naleŝących do róŝnych grup związków chemicznych, zapewnić maksymalne oczyszczanie próbki ze zbędnych substancji (usunięcie matrycy), charakteryzować się duŝym odzyskiem związków, dobrą precyzją i wysoką czułością, być tania w eksploatacji, szybka i łatwa w wykonaniu oraz bezpieczna dla środowiska (małe zuŝycie próbki i odczynników, w tym przede wszystkim rozpuszczalników organicznych).
34 CHEMIA DYDAKTYKA EKOLOGIA METROLOGIA 2008, R. 13, NR 1-2 Podstawowym problemem oznaczania pozostałości pestycydów w materiałach biologicznych jest obecność skomplikowanej i zróŝnicowanej matrycy, zawierającej związki, które, interferując z analitami, poszerzają piki chromatograficzne, a takŝe mogą uszkodzić sprzęt wykorzystywany do analizy. Do związków tych naleŝą przede wszystkim kwasy tłuszczowe, sterole oraz barwniki. Kwasy tłuszczowe i sterole pogarszają parametry rozdziału chromatograficznego oraz powodują zanieczyszczenie wkładki dozownika i kolumny chromatograficznej. Obecność barwników w próbce zakłóca pracę spektrometru masowego [5, 6]. Analiza pozostałości pestycydów utrudniona jest takŝe ze względu na fakt, iŝ występują one w produktach spoŝywczych w bardzo małych stęŝeniach. Niezbędna jest więc izolacja związków z matrycy, a następnie ich wzbogacanie przed ostatecznym oznaczeniem końcowym. Proces oznaczania pozostałości pestycydów jest złoŝony i składa się z wielu etapów [7, 8]: pobrania próbki, ekstrakcji pestycydów z próbki, oczyszczania ekstraktu i jego odpowiedniego przygotowania do analizy, identyfikacji i oznaczenia analitów wybraną techniką badawczą. Przygotowanie próbek do analizy Procedura pobrania próbki musi zapewnić odpowiednią reprezentatywność i jednorodność materiału przeznaczonego do badań. Zarówno ilość próbki, jak i sam proces jej pobierania są uzaleŝnione od badanego produktu spoŝywczego i zwykle opisane są w stosownych dokumentach (np. Polskie Normy, Rozporządzenia Ministrów: Zdrowia lub Rolnictwa i Rozwoju Wsi). Jednorodność próbki laboratoryjnej uzyskuje się, zazwyczaj poddając ją procesowi homogenizacji (rozdrobnienia). Z tak przygotowanej próbki wydziela się następnie porcję analityczną przeznaczoną do badań. Jej ilość powinna być odpowiednio dobrana do stosowanej metody badawczej (jak najmniejsza, aby zmniejszyć zuŝycie odczynników, ale na tyle duŝa, aby zapewnić wykrywalność analitów). W dotychczasowych badaniach ilość próbki zazwyczaj wahała się od 10 do 50 g, jednak przy obecnie stosowanych metodach badawczych około 5 g zazwyczaj jest wystarczająca [4]. Metody ekstrakcji pestycydów ze środków spoŝywczych uzaleŝnione są od rodzaju matrycy (dotyczy to przede wszystkim zawartości tłuszczu w produkcie) oraz właściwości fizykochemicznych danej grupy pestycydów (pestycydy polarne i niepolarne). PoniŜej scharakteryzowano najczęściej stosowane dotychczas metody ekstrakcji. Ekstrakcja z uŝyciem rozpuszczalnika (LLE, liquidliquid extraction) polega na wyodrębnieniu analitów z matrycy z wykorzystaniem odpowiednio dobranego rozpuszczalnika. Najczęściej stosowane są: aceton, acetonitryl, octan etylu, a takŝe dichlorometan, heksan, eter naftowy, alkohol izopropylowy, eter dietylowy oraz ich mieszanki. Aceton i acetonitryl wykorzystywane są raczej do ekstrakcji pestycydów niepolarnych, octan etylu stosowany jest do bardziej polarnych pestycydów. Aceton miesza się nieograniczenie z wodą, dlatego teŝ, aby oddzielić anality od wody, stosuje się odpowiednie dodatki soli (NaCl, Na 2 SO 4 ). Ekstrakty acetonowe zawierają jednak duŝo związków z matrycy, które wymagają usunięcia. Stosowanie acetonu jako rozpuszczalnika do ekstrakcji wykorzystywane jest w metodzie Luke a, zwanej takŝe multimetodą DFG S19 [9]. Acetonitryl nieco lepiej oddziela się od wody, ale teŝ najczęściej do ekstraktów dodawane są sole w celu lepszego rozdzielenia faz. Acetonitryl nie ekstrahuje tak duŝo tłuszczów jak aceton, ponadto charakteryzuje się teŝ większymi odzyskami związków [4, 10]. Wadą stosowania LLE jest ryzyko powstania emulsji, która trudno ulega ponownemu rozdzieleniu, oraz stosowanie w duŝych ilościach (100 200 cm 3 ) szkodliwych dla zdrowia rozpuszczalników. Pestycydy ekstrahowane tą metodą charakteryzują się zróŝnicowanymi odzyskami dla poszczególnych związków. Metoda ta jest praco- i czasochłonna [11, 12]. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE, solid phase extraction) polega na przepuszczaniu analizowanej próbki (lub jej roztworu) przez złoŝe sorbentu umieszczonego w kolumnie i adsorpcji oznaczanych związków na cząstkach złoŝa. Zaadsorbowane anality wymywa się następnie niewielką ilością odpowiedniego rozpuszczalnika (acetonitryl, octan etylu, aceton, dichlorometan). Niepolarne anality i średniopolarne sorbuje się na niepolarnych sorbentach, polarne związki zaś są zatrzymywane na polarnych sorbentach (Florisil, tlenek glinu, Ŝel krzemionkowy), modyfikując odpowiednio sorbenty poprzez dodatki grup fenylowych, oktylowych itp. [3]. Metoda jest szybka i prosta, łączy w sobie jednocześnie proces ekstrakcji, oczyszczania oraz wzbogacania analitów. Odmianą klasycznej metody SPE jest tzw. dyspersyjna ekstrakcja do fazy stałej (dispersive SPE lub dspe). W tym przypadku nie uŝywa się złoŝa sorbentu, a jedynie sypkiego sorbentu, dodawanego do roztworu próbki. Jako sorbenty stosuje się modyfikowane Ŝele krzemionkowe, w tym przede wszystkim PSA (primary secondary amine) w połączeniu z GCB (graphitized carbon black) lub C 18 (modyfikowany Ŝel krzemionkowy z grupami oktadecylowymi). Wybór odpowiedniego sorbentu uzaleŝniony jest od rodzaju matrycy i związków, które naleŝy usunąć. I tak, do usuwania kwasów tłuszczowych stosuje się zazwyczaj PSA, NH 2, SAX, C 18 i DEA, do usuwania pigmentów wykorzystywany jest PSA i GCB. Najlepsze oczyszczanie uzyskuje się, łącząc szeregowo oczyszczanie na PSA i GCB lub teŝ stosując kolumienki wypełnione dwiema warstwami sorbentów [6, 13]. Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME, solid phase microextraction) jest modyfikacją SPE. W technice tej anality obecne w ciekłej próbce lub w parach nad jej powierzchnią są adsorbowane na włóknie pokrytym odpowiednią fazą stacjonarną i zamkniętym w mikrostrzykawce. Zaadsorbowany analit zostaje następnie przeniesiony do dozownika chromatografu gazowego, gdzie następuje jego desorpcja termiczna. Jej zaletą jest szybkość i brak rozpuszczalników [4, 14, 15].
CHEMIA DYDAKTYKA EKOLOGIA METROLOGIA 2008, R. 13, NR 1-2 35 Technika ekstrakcji za pomocą ruchomego elementu sorpcyjnego (SBSE, stir bar sorptive extraction) korzysta z tych samych zasad co SPME, natomiast w tym przypadku sorbent (najczęściej PDMS) umieszczony jest na ruchomym elemencie sorpcyjnym. Tak zatrzymane anality są następnie desorbowane termicznie. Technika ta charakteryzuje się większymi wartościami odzysków związków niŝ SPME [2, 11]. W technice ekstrakcji z fazy stałej (MSPDE, matrix solid phase dispersion extraction) dobrze rozdrobnioną próbkę miesza się ze stałym sorbentem (Ŝel krzemionkowy, Florisil, C 8, C 18 itp.) i umieszcza się w kolumnie, którą przemywa się odpowiednio dobranym eluentem (np. dichlorometanem). Metoda jest prosta, efektywna i umoŝliwia analizę wielu próbek, redukuje ilość rozpuszczalników, unika konieczności stosowania odrębnego procesu oczyszczania. Wadą metody są stosunkowo małe odzyski związków [5, 14]. W ekstrakcji płynem w fazie nadkrytycznej (SFE, supercritical fluid extraction) jako rozpuszczalnik stosuje się CO 2 w postaci płynu w stanie nadkrytycznym. Wydajność ekstrakcji moŝna optymalizować, modyfikując parametry CO 2, np. przez dodanie metanolu. Technika ta nie prowadzi do degradacji pestycydów, jest szybka, nie wymaga stosowania toksycznych rozpuszczalników, wykazuje dobre efekty w usuwaniu tłuszczów i dobre wydajności w ekstrakcji pestycydów chlorowcoorganicznych. Wadą metody jest jej wysoki koszt [4]. Metoda przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikiem (ASE, accelerated solvent extraction) polega na ekstrakcji analitów niewielką ilością rozpuszczalnika w podwyŝszonej temperaturze i pod zwiększonym ciśnieniem. Do zalet metody naleŝy zaliczyć małe zuŝycie odczynników i krótki czas operacji, do wad moŝliwość degradacji związków lotnych i nietrwałych termicznie [7, 16]. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta polega na cyklicznej ekstrakcji związków z ciał stałych odpowiednim rozpuszczalnikiem lub jego parami. Technika jest powszechnie stosowana do ekstrakcji tłuszczów i zanieczyszczeń z Ŝywności, lecz jej wadą jest długi czas procesu i znaczne zuŝycie rozpuszczalników [16]. Etap oczyszczania otrzymanego ekstraktu jest procesem niezbędnym, który zawsze powinien poprzedzać etap analizy próbki. Szczególnie waŝne jest odseparowanie związków, które mogłyby zakłócać przebieg analizy, ale usunięcie matrycy polepsza takŝe wykrywalność analitów (obniŝa granicę wykrywalności) oraz zapewnia prawidłowy przebieg analizy ilościowej [3]. W niektórych przypadkach - przy oznaczaniu pestycydów z wykorzystaniem dwuwymiarowej chromatografii gazowej (GCxGC) lub tandemowej spektrometrii mas (MS- MS) - oczyszczanie próbki nie jest konieczne, gdyŝ zastosowanie wyŝej wymienionych technik w pełni zapewnia oddzielenie sygnałów analitów od sygnałów matrycy. Pominięcie etapu oczyszczania ekstraktu moŝe spowodować jednak pogorszenie pracy urządzeń i krótszy czas ich Ŝycia, powinno się więc poddać oczyszczaniu kaŝdą próbkę, niezaleŝnie, jaką metodą będzie ona potem badana [5, 9, 14]. Proces oczyszczania moŝe być prowadzony jednocześnie z procesem ekstrakcji (z wykorzystaniem SPE, MSPDE, SPME) lub teŝ moŝe być etapem całkowicie odrębnym. Najczęściej stosowaną techniką oddzielania matrycy od pestycydów jest chromatografia Ŝelowa (GPC, gel permeation chromatography), która umoŝliwia odseparowanie małomolekularnych pestycydów od wielkomolekularnych substancji obecnych w matrycy [14]. Jako wypełnienie stosuje się zazwyczaj Ŝywice (kopolimery styrenu i diwinylobenzenu), jako eluenty zaś wykorzystuje się zazwyczaj octan etylu, cykloheksan, eter dietylowy lub ich mieszaniny. GPC szczególnie przydatna jest przy analizie produktów o duŝej zawartości tłuszczu (np. oleje), gdyŝ skutecznie oddziela tłuszcze od pestycydów. Wadą chromatografii Ŝelowej jest długi czas analizy, zuŝycie znacznej ilości rozpuszczalników oraz trudności w zoptymalizowaniu warunków procesu [14, 17]. Przy analizie pyretroidów naleŝy szczególnie starannie dobrać parametry oczyszczania z uwagi na duŝe masy molekularne tych związków, które mogą się eluować wraz z zanieczyszczeniami [4]. Oddzielanie niepoŝądanych związków od analitów moŝe równieŝ odbywać się na kolumnie wypełnionej odpowiednim sorbentem (chromatografia adsorpcyjna). Najczęściej wykorzystywanymi sorbentami są: Ŝel krzemionkowy, Florisil, tlenek glinu, węgiel aktywny. śel krzemionkowy niezbyt dobrze oczyszcza pestycydy od innych substancji. Florisil natomiast skutecznie usuwa chlorofil, triglicerydy i sterole roślinne. Oczyszczanie ekstraktu tą techniką nie jest tak efektywne jak przy uŝyciu chromatografii Ŝelowej, zdarza się równieŝ, Ŝe anality są zatrzymywane na sorbencie, co prowadzi do zafałszowania wyników. Dlatego teŝ metoda ta jest coraz rzadziej stosowana [4, 7]. Oznaczanie pozostałości pestycydów - chromatografia gazowa Ostatnim etapem procedury analitycznej jest identyfikacja związków i ich ilościowe oznaczenie z wykorzystaniem właściwie dobranej techniki instrumentalnej. Dobór odpowiedniej metody uzaleŝniony jest od właściwości pestycydów. Do związków polarnych, nietrwałych i niestabilnych termicznie moŝna stosować chromatografię cieczową. Znane są takŝe inne metody oznaczania pozostałości pestycydów, takie jak: chromatografia cienkowarstwowa, spektrometria UV czy teŝ enzymatyczna analiza immunologiczna (ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) [7, 14]. Najczęściej jednak wykorzystuje się chromatografię gazową, wyposaŝoną w adekwatne do rodzaju pestycydów detektor i kolumnę. Stosuje się ją do analizy związków zarówno polarnych, jak i niepolarnych, a więc doskonale nadaje się do równoczesnego oznaczania pozostałości pestycydów chlorowcoorganicznych, fosforoorganicznych, karbaminianów i pyretroidów. Wybór właściwej kolumny zapewnia optymalny rozdział analizowanej próbki. Do analizy pestycydów niepolarnych (chlorowcoorganiczne, pyretroidy) stosuje się kolumny z wypełnieniem niepolarnym, takie jak: DB 5, HP-5 MS, DB-XLB, do rozdziału związków średniopolarnych i polarnych (pestycydy fosforoorganiczne) naleŝy uŝyć ko-
36 CHEMIA DYDAKTYKA EKOLOGIA METROLOGIA 2008, R. 13, NR 1-2 lumn z wypełnieniami bardziej polarnymi. Przykładami takich kolumny są: CP Sil 8, CP Sil 13, DB-17, DB-1701 [12, 15, 18]. Równie waŝny jest dobór właściwej metody detekcji związków rozdzielonych na kolumnie. W przypadku oznaczenia pestycydów chlorowcoorganicznych takim detektorem jest detektor wychwytu elektronów (ECD, electron capture detector). Jego zaletą jest wysoka czułość w stosunku do związków zawierających elektroujemne atomy. Detektor płomieniowo-fotometryczny (FPD, flame photometric detector) jest natomiast wykorzystywany do detekcji pestycydów fosforoorganicznych [3]. W niektórych pracach uŝywano takŝe detektora fosforowo-azotowego (NPD, nitrogen phosphorus detector, zwanego równieŝ specyficznym detektorem termojonowym, TSD, thermionic specific detector), który doskonale nadaje się do analiz związków mających w swej strukturze atomy azotu i fosforu [14, 19]. Oprócz wyŝej wymienionych detektorów selektywnych na wybrane grupy związków bardzo powszechnym i efektywnym rozwiązaniem jest sprzęŝenie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas. Spektrometr mas jako detektor uniwersalny charakteryzuje się szerokim zakresem zastosowań i moŝe być wykorzystywany w multimetodach do jednoczesnego oznaczania pestycydów wywodzących się z róŝnych grup chemicznych. Spektrometr mas moŝe pracować w trybie skaningu całkowitego widma mas (full scan) lub monitorowania wybranych jonów (SIM, selected ion monitoring), który odznacza się lepszą czułością i selektywnością, ale znacznie redukuje ilość dostarczanych informacji o badanych związkach [20]. Zwiększenie czułości moŝna uzyskać, stosując równieŝ wielokrotną spektrometrię mas (MS n, najczęściej MS/MS), w wersji tandemowej w przestrzeni (tandem-in-space) lub tandemowej w czasie (tandemin-time). W technice tej wybrane jony rozdzielone w pierwszym analizatorze są następnie ponownie fragmentowane, a powstające z nich jony potomne są analizowane w drugim analizatorze mas [10, 21]. Większą czułość metody, poprawienie rozdziału pików chromatograficznych oraz zmniejszenie wpływu matrycy na wyniki oznaczeń moŝna takŝe osiągnąć przy uŝyciu kompletnej dwuwymiarowej chromatografii gazowej - GCxGC [18, 22]. W technice tej anality po wstępnym rozdzieleniu na pierwszej kolumnie ulegają z pewną częstotliwością zatrzymywaniu w kapilarze (lub pułapce kriogenicznej). Następnie związki są uwalniane poprzez podgrzanie kapilary i dostają się do drugiej kolumny. Zatrzymywanie i desorpcja analitów (modulacja) odbywa się cyklicznie. Dobór właściwej kombinacji kolumn pozwala na optymalny rozdział analitów, przykładem moŝe być zastosowanie kolumn DB-17 i HT-8 do rozdziału pestycydów chloroorganicznych [22]. Często spotykanym rozwiązaniem jest połączenie dwuwymiarowej chromatografii gazowej z detekcją mas, zwłaszcza z zastosowaniem analizatora czasu przelotu - GCxGC-TOF- MS [23]. Analizator ten charakteryzuje się znaczną szybkością zbierania danych, co doskonale znajduje zastosowanie w GCxGC, a takŝe w szybkiej chromatografii gazowej (fast GC), równie często wykorzystywanej do analizy pestycydów. Szybka chromatografia gazowa, w porównaniu do klasycznej GC, wykorzystuje krótsze (około 10 m) i węŝsze kolumny kapilarne (o średnicach od 0,1 mm), z filmami fazy stacjonarnej o grubości około 0,1 µm, szybsze przepływy gazu nośnego i jego wyŝsze ciśnienie. Parametry te pozwalają uzyskać wyniki oznaczeń w krótszym czasie, z większą precyzją i lepszym rozdziałem pików [8, 15, 24, 25]. Problemy kalibracji w oznaczaniu pozostałości pestycydów Istotną kwestią w analizie pozostałości pestycydów jest uzyskanie wiarygodnych wyników oznaczeń ilościowych. Najczęściej spotykanymi metodami kalibracji w chromatografii gazowej są: metoda serii wzorców (wzorca zewnętrznego) oraz metoda wzorca wewnętrznego. Roztwory kalibracyjne sporządzane były zazwyczaj w odpowiednich rozpuszczalnikach (heksan, acetonitryl itp.). Wyniki oznaczeń obarczone były jednak pewnymi błędami, wynikającymi z róŝnic pomiędzy roztworami stosowanymi do kalibracji (czysty rozpuszczalnik) a analizowanym roztworem próbki rzeczywistej (obecność, nawet w ilościach śladowych, matrycy). Podczas wstrzykiwania próbki zawierającej matrycę do układu chromatograficznego jej składniki mają tendencję do blokowania miejsc aktywnych, co zmniejsza straty analitów spowodowane ich adsorpcją lub degradacją w tych miejscach. Zjawisko to prowadzi do podwyŝszenia sygnałów pochodzących od analitów, w porównaniu do próbek niezawierających matrycy [26]. Problemem jest równieŝ dobór odpowiedniego wzorca wewnętrznego, który powinien być pod względem właściwości fizykochemicznych jak najbardziej zbliŝony do oznaczanych związków. Pewnym rozwiązaniem jest dodatek wzorców wewnętrznych izotopowo oznakowanych (SIDA, Stable Isotope Dilution Assay). Technika ta polega na dodawaniu do roztworu badanej próbki wzorca wewnętrznego, który jest izotopem analitu. Zarówno oznaczany związek, jak i jego izotop (wzorzec wewnętrzny) mają niemal identyczne właściwości fizykochemiczne i podobnie reagują podczas przygotowania próbki i w warunkach przeprowadzania analizy chromatograficznej [24]. Aby natomiast zrekompensować skutki obecności matrycy, oprócz dodawania do roztworów wzorca wewnętrznego, stosuje się technikę sporządzania roztworów kalibracyjnych nie z czystego rozpuszczalnika, a z roztworów zawierających matrycę pochodzącą z danej próbki, wolną jednak od oznaczanych analitów (matrix-matched calibration). Zapewnia to uzyskiwanie porównywalnych sygnałów pochodzących od analitów obecnych zarówno w badanej próbce, jak i w roztworach stosowanych do kalibracji [26]. Takie podejście skomplikowane jest jednak ze względu na trudności w uzyskaniu matrycy o składzie zbliŝonym do analizowanej próbki, która jednocześnie nie zawiera analizowanych związków. Innym sposobem - zaproponowanym przez Anastassiadesa i współprac. [7] - ochrony analitów przed adsorpcją lub degradacją w układzie chromatograficznym - jest dodatek odpowiednich związków ochronnych
CHEMIA DYDAKTYKA EKOLOGIA METROLOGIA 2008, R. 13, NR 1-2 37 (analyte protectants), np. D-sorbitolu czy teŝ 3-etoksy-1,2- propanediolu. Wykazano, iŝ obecność tych substancji zmniejsza ryzyko strat analitów podczas analizy chromatograficznej [13, 26, 27]. Stosowanie kalibracji z wykorzystaniem roztworów zawierających matrycę czy teŝ dodatek związków chroniących analit jest rekomendowane przez Dyrekcję Generalną ds. Zdrowia i Ochrony Konsumentów (SANCO, organ Unii Europejskiej) w instrukcji do metod walidacji i kontroli jakości w oznaczaniu pozostałości pestycydów w Ŝywności i paszach [28]. Najnowsze trendy w analityce pestycydów - metoda QuEChERS Obecne kierunki badań skłaniają się ku opracowaniu procedur badawczych, które spełniałyby wszystkie warunki, jakie powinna mieć idealna metoda oznaczania pestycydów. Taką techniką jest metoda QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe - szybka, prosta, tania, efektywna, bezpieczna). QuEChERS opracowane zostało kilka lat temu przez Anastassiadesa i współpracowników. Technika ta oparta jest na kilku etapach [27, 29]: ekstrakcji pestycydów z próbki za pomocą niewielkiej ilości acetonitrylu (10 cm 3 ), dodatku około 1 g NaCl i 4 g MgSO 4 w celu rozdzielenia warstw wody i acetonitrylu, oczyszczania wydzielonej objętości ekstraktu metodą dyspersyjnej SPE z zastosowaniem róŝnych sorbentów; podstawowym sorbentem jest PSA (zazwyczaj stosuje się go w ilości 25 mg na 1 cm 3 roztworu), dodatku 5% roztworu kwasu mrówkowego w acetonitrylu (osiągnięcie wartości ph wynoszącej około 5), oznaczania metodą GC lub LC. Zaletą metody jest niewielkie zuŝycie próbki (około 5 10 g) i odczynników, w tym toksycznych rozpuszczalników, prostota wykonania - w procedurze wykorzystuje się jedynie wytrząsanie i wirowanie. Wszystkie powyŝsze cechy wpływają takŝe na redukcję kosztów analizy. Metoda ta charakteryzuje się równieŝ bardzo dobrymi efektami w usuwaniu matrycy i wysokimi odzyskami analizowanych związków [14]. W zaleŝności od poziomu zawartości tłuszczu w produktach spoŝywczych metoda QuEChERS moŝe być odpowiednio modyfikowana przez dodatek, np. C 18 lub GCB jako sorbentów, które efektywnie usuwają tłuszcz, sterole i pigmenty [10, 14], lub kwasu octowego w celu polepszenia ekstrakcji polarnych pestycydów fosforoorganicznych [6]. Tłuszcz lub woski wyekstrahowane z próbek (głównie zbóŝ i owoców cytrusowych) mogą być usunięte równieŝ przez wymraŝanie próbki co najmniej przez 1 godz. w niskiej temperaturze [29]. Istnieją takŝe pewne odmiany tej metody (buffered Qu- EChERS, modified QuEChERS), w których stosuje się bufor cytrynianowy (dodatek cytrynianu i wodorocytrynianu sodu przy ekstrakcji acetonitrylem) lub octanowy (uŝycie do ekstrakcji 1% roztworu kwasu octowego w acetonitrylu z dodatkiem octanu sodu zamiast chlorku sodu [14, 21]. W przypadku analizy owoców cytrusowych, czarnych porzeczek i malin zalecany jest dodatek 5 M roztworu NaOH w celu osiągnięcia ph około 5 [29]. Pewnym problemem metody są końcowe objętości uzyskanego ekstraktu do analizy. W przypadku dozowania do chromatografu objętości próbki rzędu 1 2 nm 3 (µl), otrzymane sygnały analitów mogą znajdować się poniŝej granicy wykrywalności związków. W takich przypadkach stosuje się metodę dozowania większych (niŝ 3 nm 3 (µl)) objętości próbki (LVI, Large Volume Injection) z moŝliwością odparowania próbki w dozowniku z programowaną zmianą temperatury (PTV, Programmed Temperature Vaporizer) [1, 30]. Innym rozwiązaniem jest wzbogacenie próbki przed wstrzyknięciem jej do chromatografu poprzez odparowanie części rozpuszczalnika, np. z 4 do 1 cm 3 [29]. Technika QuEChERS jest coraz bardziej rozpowszechniona na świecie. Obecnie prowadzone są badania nad jej zoptymalizowaniem do analiz zróŝnicowanych grup związków oraz produktów Ŝywnościowych. Została ona równieŝ zatwierdzona jako oficjalna metoda badań pestycydów według Europejskiego Komitetu Normalizacyjnego (CEN, fr. Comité Européen de Normalisation), a od grudnia 2008 r. funkcjonuje teŝ w zbiorze Polskich Norm jako (obecnie jedynie w wersji anglojęzycznej): PN-EN 15662 śywność pochodzenia roślinnego. Oznaczanie pozostałości pestycydów metodą GC-MS i/lub LC-MS(/MS) po uprzedniej ekstrakcji i rozdziale acetonitrylem oraz oczyszczaniu metodą dyspersyjnej SPE. Metoda QuEChERS [31]. Podsumowanie Pestycydy są jednymi z najbardziej niebezpiecznych substancji chemicznych obecnych w środowisku, głównie ze względu na ich odporność na degradację oraz długofalowe skutki działania w organizmach Ŝywych. Ich obecność w Ŝywności stwarza szczególne zagroŝenie naraŝenia zdrowia, dlatego teŝ niezbędne jest monitorowanie i badanie ich pozostałości w środkach spoŝywczych. Szereg opracowanych do tej pory procedur badawczych i technik przygotowania próbek umoŝliwia oznaczenie pozostałości tych związków w całej gamie artykułów spoŝywczych i rolnych. Oznaczanie pozostałości pestycydów w Ŝywności utrudnione jest jednak ze względu na obecność w próbkach matrycy i małe stęŝenia pestycydów w Ŝywności, co pociąga za sobą konieczność stosowania praco- i czasochłonnych metod. Dlatego teŝ trwają badania nad udoskonaleniem wykorzystywanych technik i opracowaniem nowych, które w sposób szybki, prosty, tani, skuteczny i bezpieczny dla środowiska pozwalałyby jednocześnie oznaczyć pestycydy wywodzące się z róŝnych grup chemicznych, uzyskując wiarygodne wyniki analiz. Literatura [1] Gnusowski B., Nowacka A., Giza I., Sztwiertnia U., Łozowicka B., Kaczyński P., Szpyrka E., Rupar J., Rogozińska K., Kuźmenko A. i Sadło S.: Post. Ochr. Roślin, 2007, 47, 38-41. [2] Sandra P., Tienpot B. i David F. [w:] Nowe horyzonty i wyzwania w analityce i monitoringu środowiskowym. Namieśnik J., Chrzanow-
38 CHEMIA DYDAKTYKA EKOLOGIA METROLOGIA 2008, R. 13, NR 1-2 ski W. i Szpinek P. (red.): Centrum Doskonałości Analityki i Monitoringu Środowiskowego, Gdańsk 2003, 1-32. [3] Štajnbaher D. i Zupančič-Kralj L.: J. Chromatogr. A, 2003, 1015, 185-198. [4] Hercegová A., Dömötörová M. i Matisová E.: J. Chromatogr. A, 2007, 1153, 54-73. [5] Ferrer C., Gómez M.J., García-Reyes J.F., Ferrer I., Thurman E.M. i Fernandez-Alba A.R.: J. Chromatogr. A, 2005, 1069, 183-194. [6] He Y. i Liu Y-H.: Chromatographia, 2007, 65, 581-590. [7] Pestycydy: występowanie, oznaczanie i unieszkodliwianie. Biziuk M. (red.). Wyd. Nauk.-Tech., Warszawa 2001. [8] Cajka T., Hajslova J., Lacina O., Maštovská K. i Lehotay S.J.: J. Chromatogr. A, 2008, 1186, 281-294. [9] Walorczyk S.: J. Chromatogr. A, 2007, 1165, 200-212. [10] Leandro C.C., Fussell R.J. i Keely B.J.: J. Chromatogr. A, 2005, 1085, 207-212. [11] Blasco C., Lino C.M., Picó Y., Pena A., Font G. i Silveira M.I.N.: J. Chromatogr. A, 2004, 1049, 155-160. [12] Cencič Kodba Z. i Brodnjak Vončina D.: Chromatographia, 2007, 66, 619-624. [13] Przybylski C. i Hommet F.: J. Chromatogr. A, 2008, 1201, 78-90. [14] García-Reyes J.F., Ferrer C., Gómez-Ramos J.M., Molina-Díaz A. i Fernández-Alba A.R.: Trends Anal. Chem., 2007, 26, 828-841. [15] Hercegová A., Dömötörová M., Matisová E., Kirchner M., Otrekal R. i Štefuca V.: J. Chromatogr. A, 2005, 1084, 46-53. [16] Garrido Frenich A., Martínez Vidal J.L., Cruz Sicilia A.D., González Rodríguez M.J. i Plaza Bolaños P.: Anal. Chim. Acta, 2006, 558, 42-52. [17] Liu L.-B., Hashi Y., Qin Y.-P., Zhou H.-X. i Lin J.-M.: J. Chromatogr. B, 2007, 845, 61-68. [18] Zrostlíková J., Hajšlová J. i Čajka T.: J. Chromatogr. A, 2003, 1019, 173-186. [19] Guardia-Rubio M., Marchal-López R.M., Ayora-Caňada M.J. i Ruiz-Medina A.: J. Chromatogr. A, 2007, 1145, 195-203. [20] Tahboub Y.R., Zaater M. F. i Barri T. A.: Anal. Chim. Acta, 2006, 558, 62-68. [21] Garrido Frenich A., Plaza Bolaños P. i Martínez Vidal J.L.: J. Chromatogr. A, 2008, 1203, 229-238. [22] Bordajandi L.R., Ramos J.J., Sanz J., González M.J. i Ramos L.: J. Chromatogr. A, 2008, 1186, 312-324. [23] Van Der Lee M.K., Van Der Weg G., Traag W.A. i Mol H.G.J.: J. Chromatogr. A, 2008, 1186, 325-339. [24] Kirchner M., Húšková R., Matisová E. i Mocák J.: J. Chromatogr. A, 2008, 1186, 271-280. [25] Walorczyk S. i Gnusowski B.: J. Chromatogr. A, 2006, 1128, 236-243. [26] Díez C., Traag W.A., Zommer P., Marinero P. i Atienza J.: J. Chromatogr. A, 2006, 1131, 11-23. [27] Anastassiades M., Maštovská K. i Lehotay S.J.: J. Chromatogr. A, 2003, 1015, 163-184. [28] SANCO/2007/3131:http://ec.europa.eu/food/plant/protection/resources /qualcontrol_en.pdf (15.10.2008). [29] Anastassiades M.: http://www.quechers.com (15.10.2008). [30] González Rodríguez R.M., Rial-Otero R., Cancho-Grande B. i Simal-Gándara J.: Food Chem., 2008, 107, 1342-1347. [31] Polski Komitet Normalizacyjny: http://www.pkn.pl (20.12.2008).