Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Diagnostyka mikrobiologiczna Analityka medyczna III rok Instrukcja do ćwiczeń Temat: Analiza sanitarna wody Wody powierzchniowe są drugim po glebie naturalnym środowiskiem bytowania mikroorganizmów. W wodach dominują bakterie, ale również występują w nich grzyby i ich zarodniki, wirusy i bakteriofagi. Ścieki komunalne, a także niektóre rodzaje ścieków przemysłowych, np. z rzeźni, garbarni, mleczarni wnoszą do zbiorników wodnych poza mikroorganizmami saprofitycznymi wirusy i bakterie chorobotwórcze. Pochodzą one przede wszystkim z odchodów ludzkich i zwierzęcych. Najbardziej groźnymi chorobami wirusowymi są: choroba Heinego-Medina, zapalenie opon mózgowordzeniowych, zapalenie mięśnia sercowego u noworodków, zapalenie jelita grubego, zapalenie wątroby. Najczęstszymi chorobami pochodzenia bakteryjnego, szerzącymi się przez zanieczyszczone wody są: tyfus i paratyfus wywołany przez bakterie z rodzaju Salmonella, czerwonka wywołana przez pałeczki Shigella, gruźlica Mycobacterium tuberculosis i cholera Vibrio cholerae. Zakażenia te mogą się szerzyć drogą wodno-pokarmową, ale także przez bezpośredni kontakt z osobami chorymi. Bakterie chorobotwórcze dostaja się do wody z wydalinami chorego. Przeżywalność tych bakterii w wodzie i ściekach zależy głównie od rodzajów mikroorganizmów, a także od warunków fizycznych i chemicznych. Waha się ona od kilku do kilkunastu dni, a przetrwalników nawet do kilkudziesięciu lat. Zakres analizy bakteriologiczno sanitarnej wody obejmuje następujące badania: 1. Oznaczanie ogólnej liczby mikroorganizmów zdolnych do wzrostu metodą posiewu na agarze odżywczym wg. PN-EN ISO 6222: 2004 2. Oznaczanie liczby bakterii z grupy coli, bakterii z grupy coli typ fekalny i Escherichia coli metodą filtracji membranowej wg PN-EN ISO 9308-1: 2004 metodą fermentacyjną probówkową wg. PN-75/C-04615/05: 1975 metodą fermentacyjną probówkową wg. PN-77/C-04615/07: 1977 3. Oznaczanie liczby enterokoków kałowych metodą filtracji membranowej wg PN-EN ISO 7899-2: 2004 metodą probówkową wg. PN-82/C-04615/25: 1982 4. Oznaczanie liczby Clostridium perfringens na podłożu m-cp metodą filtracji membranowej wg Dyrektywy 98/83/WE z dn. 3.11.1998r i PN-ISO 8199: 2001 1
OZNACZANIE OGÓLNEJ LICZBY MIKROORGANIZMÓW ZDOLNYCH DO WZROSTU METODĄ POSIEWU NA AGARZE ODŻYWCZYM wg. PN-EN ISO 6222:2004 (Jakość wody. Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów zdolnych do wzrostu. Określanie ogólnej liczby kolonii metodą posiewu na agarze odżywczym). Pobrać próbki wody: - woda pitna z sieci wodociągowej: bez rozcieńczeń - woda ze studni: bez rozcieńczenia + 10-1 - woda powierzchniowa: rozcieńczenia od 10-1 do 10-5 - ścieki: rozcieńczenia od 10-1 do 10-8 Wykonać posiew wgłębny (po 1 ml próbki wody przenieść na 2 płytki Petriego (dla każdej temperatury) i zalać ostudzonym agarem odżywczym Inkubacja: - temp. 36 o C ± 2 o C przez 44 h ± 4 h - temp. 22 o C ± 2 o C przez 68 h ± 4 h Przedstawić wyniki jako liczbę jednostek tworzących kolonie na ml (jtk/ml) próbki dla każdej temperatury. Jeśli obserwuje się brak wzrostu kolonii na płytkach zaszczepionych określonymi objętościami nie rozcieńczonej próbki, wynik przedstawić jako nie wykryto w 1 ml. Jeżeli na płytkach zaszczepionych najwyższymi rozcieńczeniami jest ponad 300 kolonii, wynik przedstawić jako > 300 lub jedynie przybliżony. Uwaga! Oznaczenie na agarze odżywczym bakterii psychrofilnych (22 o C ± 2 o C) świadczy o zanieczyszczeniu wody substancjami organicznymi łatwo ulegającymi rozkładowi, natomiast bakterie mezofile (36 o C ± 2 o C), oznaczone na podłożu agarowym informują o zanieczyszczeniu wody fekaliami, a więc o możliwości zakażenia wody bakteriami chorobotwórczymi. 2
OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI, BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY I ESCHERICHIA COLI W WODZIE METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ wg PN-EN ISO 9308-1:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli. Część 1: Metoda filtracji membranowej) przygotować objętości próbek wody do przefiltrowania: - woda uzdatniona, dezynfekowana: 100 ml Uwaga! W przypadku filtracji próbek wody o obj. 10 i 1 ml do aparatu filtracyjnego wlać dodatkowo 20-50 ml jałowego płynu Ringera - czterokrotnie rozc. i dokładnie wymieszać zawartość leja filtracyjnego przefiltrować próbki wody przez sterylny filtr membranowy (0,45 µm) TEST STANDARDOWY przenieść filtr membranowy na podłoże agarowe z laktozą (agar laktozowy TTC) temp. 36 o C±2 o C przez 21±3 h (można przedłużyć do 44±4 h ) kolonie, które na podłożu pod filtrem maja żółte zabarwienie (bakterie kaktozo-dodatnie) test na oksydazę test na indol TEST SZYBKI przenieść filtr membranowy na podłoże agarowe z kazeiną (agar TSA) temp. 36 o C±2 o C przez 4-5 h przenieść filtr na podłoże zaw. kazeinę (tryptyczny wyciąg kazeinowy) i sole żółci agar TBA temp. 44 o C±0,5 o C przez 19-20 h przenieść przynajmniej 3 kolonie przenieść przynajmniej 3 kolonie przenieść filtr i umieścić na agar TSA na bulion tryptofanowy na krążku bibułowym nasączonym odczynnikiem do testu na wyrywanie indolu temp. 36 o C±2 o C przez 21±2 h wykonać test na oksydazę cytochromową temp. 44 o C±0,5 o C przez 21±3 h dodać 0,2-0,3 ml odczynnika Kovacsa czerwony pierścień wystawić na działanie lampy UV przez 10-30 minut wszystkie czerwone kolonie policzyć jako E. coli Uwaga! W przypadku oznaczania liczby bakterii z grupy coli typ fekalny należy kolonie oksydazo-ujemne przesiać na podłoże Endo i przeprowadzić inkubację w temperaturze 44 o C±1 o C przez 24±2 h. Jako należy uznać wzrost w postaci ciemnoczerwonych kolonii charakteryzujących się często zielonozłotych metalicznym połyskiem. Wynik końcowy podać zgodnie z normą PN-EN ISO 9308-1:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli. Część 1: Metoda filtracji membranowej) jako liczbę bakterii z grupy coli lub bakterii z grupy coli typ fekalny lub Escherichia coli w 100 ml próbki wody. 3
OZNACZANIE LICZBY BAKTERII Z GRUPY COLI TYP FEKALNY I ESCHERICHIA COLI W WODZIE METODĄ FERMENTACYJNĄ PROBÓWKOWĄ wg. PN-77/C-04615/07:1977 (Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne: Oznaczanie bakterii grupy coli typu kałowego (fekalnego) metodą fermentacyjną probówkową). posiać podane objętości próbek wody na podłoże Eijkmana (LPB): - 3 x 10 ml na (2x)LPB - 3 x 1 ml na (1x)LPB - 3 x 0,1 ml na (1x)LPB temp. 44 o C przez 24-48 h (po 24 h obejrzeć hodowle) zmiana barwy pożywki z fioletowej na żółtą (probówki bez widocznych zmian inkubować do 48 h) posiew na podłoże Endo wg ISO posiew 0,1 ml na podłoże z zielenią i posiew 0,1 ml na bulion tryptofanowy brylantową temp. 44 o C przez 24 h temp. 44 o C przez 24 h temp. 44 o C przez 24 h kolonie ciemnoczerwone zmętnienie podłoża zmętnienie podłoża z metalicznym zielonozłotym połyskiem (obecność grupy coli typu fekalnego i czerwony pierścień domniemanych E. coli) potwierdzenie przynależności domniemanych E. coli do E. coli Wykonać próby z szeregu IMCV próba na indol próba MR cytrynian próba VP posiew na posiew na posiew na posiew na bulion tryptofanowy pożywkę Clarka pożywkę Simonsa pożywkę Clarka po dodaniu od. Kovacsa temp. 44 o C przez 24 h temp. 37 o C przez 72 h temp. 44 o C do 5 dni temp. 37 o C przez 48 h odczyt próba na indol - do hodowli dodać odczynnika Kovačsa (p-dimetyloaminobenzaldehyd w roztworze alkoholu amylowego lub izoamylowego i stężonego HCl). Pojawienie się ciemnowiśniowego pierścienia świadczy o obecności indolu i zdolności bakterii do rozkładu tryptofanu. próba MR - sprawdzenie stopnia zakwaszenia podłoża (określenie typu fermentacji). Do hodowli dodać kilka kropli roztworu czerwieni metylowej. Jeśli ph jest niższe niż 4,5 pożywka zabarwia się na czerwono (odczyn MR dodatni), jeżeli ph jest wyższe niż 4,5 barwa podłoża pozostanie żółta (odczyn MR ujemny). próba VP - sprawdzenie wytwarzania acetoiny. Do hodowli dodać 0,6 ml 6% roztworu α-naftolu, 0,4 ml 40% roztworu KOH. Probówkę parokrotnie wstrząsnąć i umieścić na 30 minut w łaźni wodnej w temp. 37 C. Czerwone lub wyraźnie różowe zabarwienie w górnej części podłoża świadczy o wytwarzaniu acetoiny (odczyn dodatni). Wynik końcowy odczytać z tablic podanych w Normie PN-75/C-04615/05 - Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową i podać jako NPL bakterii z grupy coli typ fekalny lub Escherichia coli w 100 ml próbki wody w 100 ml próbki wody. 4
OZNACZANIE LICZBY ENTEROKOKÓW KAŁOWYCH W WODZIE METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ wg PN-EN ISO 7899-2:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych. Część 2: Metoda filtracji membranowej). przygotować objętości próbek wody do przefiltrowania: - woda uzdatniona, dezynfekowana: 100 ml Uwaga! W przypadku filtracji próbek wody o obj. 10 i 1 ml do aparatu filtracyjnego wlać dodatkowo 20-50 ml jałowego płynu do rozcieńczeń i dokładnie wymieszać zawartość leja filtracyjnego przefiltrować próbki wody przez sterylny filtr membranowy (0,45 µm) przenieść filtr membranowy na podłoże Slanetza i Bartleya : temp. 36 o C ± 2 o C przez 44 ± 4h : kolonie 0,2-1 mm, (obserwować pod lupą) koloru czerwonego, czerwonawego z ciemniejszym środkiem lub różowym lub barwy kasztanowej przenieść filtr nie odwracając go na wstępnie ogrzane do 44 o C podłoże agarowe z żółcią, eskuliną i azydkiem temp. 44 o C ± 0,5 o C przez 2h policzyć kolonie wokół których podłoże przybiera barwę brązową do czarnej Wynik końcowy podać zgodnie z normą PN-EN ISO 7899-2:2004 (Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych. Część 2: Metoda filtracji membranowej) jako liczbę enterokoków kałowych w 100 ml próbki wody. 5
OZNACZANIE ENTEROKOKÓW KAŁOWYCH W WODZIE METODĄ PROBÓWKOWĄ wg. PN-82/C- 04615/25:1982 (Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne: Oznaczanie paciorkowców kałowych metodą filtrów membranowych (FM) i metodą probówkową). posiać podane objętości próbek wody na podłoże Eijkmana (LPB): - 3 x 10 ml na (2x)APB - 3 x 1 ml na (1x)APB - 3 x 0,1 ml na (1x)APB Inkubacja temp. 37 o C przez 24-48 h : zmętnienie podłoża i zmiana zabarwienia z czerwonej na żółtą Badania potwierdzające przenieść 0,1 ml z dodatnich hodowli na podłożu APB do probówek z 5 ml podłoża z azydkiem sodowym i fioletem etylowym (AFE) temp. 37 o C przez 48 h (odczyt zrobić już po 24 h) Wynik dodatni: Zmętnienie i osad bakterii na dnie probówki Wynik końcowy odczytać z tablic podanych w Normie PN-82/C-04615/25: 1982 - Woda i ścieki. Badania mikrobiologiczne: Oznaczanie paciorkowców kałowych metodą filtrów membranowych (FM) i metodą probówkową i podać jako NPL bakterii z grupy coli w 100 ml próbki wody. 6
OZNACZANIE LICZBY CLOSTRIDIUM PERFRINGENS W WODZIE NA PODŁOŻU m-cp METODĄ FILTRACJI MEMBRANOWEJ wg Dyrektywy 98/83/WE z dn. 3.11.1998r i PN-ISO 8199: 2001 (Jakość wody. Ogólne wytyczne oznaczania liczby bakterii metodą hodowl). Filtracja: Przefiltrować przez filtr membranowy określoną objętość badanej próbki wody (zazwyczaj 100 ml). W przypadku wód silniej zanieczyszczonych przefiltrować dodatkowo 10 i 1 ml próbki i do tego celu użyć sterylnego płynu do rozcieńczeń w ilości od 20 do 50 ml. W przypadku oznaczania liczby spor Clostridium perfringens próbkę wody przed filtracją należy ogrzać w temperaturze 60±2 o C przez 15 min ±1 min. Przenieść filtr membranowy na agar m-cp w taki sposób aby pod filtrem nie powstawały pęcherzyki powietrza. Następnie płytki odwrócić i poddać inkubacji. Inkubacja: 44 o C±1 o C / 21±3 h w warunkach beztlenowych Odczyt: Po określonym czasie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Za domniemane Clostridium perfringens należy uznać wszystkie rosnące na agarze m-cp w postaci żółtych kolonii. Podłoże pod filtrem przyjmuje zabarwienie żółte. Potwierdzenie: Umieścić otwarta płytkę z filtrem membranowym w pojemniku z oparami wody amoniakalnej. Po 20-30 s dokonać odczytu. Za należy uznać te kolonie, które zmieniły barwę z żółtej na różową Wynik podać jako liczbę Clostridium perfringens lub liczbę spor Clostridium perfringens w 100 ml próbki wody. 7