Markery ministr jako nowa technologia badania œladów biologicznych w kryminalistyce

Markery ministr jako nowa technologia badania œladów biologicznych w kryminalistyce We wspó³czesnym œwiecie, w którym przestêpstwa, ataki terrorystyczne i klêski ywio³owe stwarzaj¹ ogromne zagro enie dla ludzi, identyfikacja osobnicza jest niezmiernie wa na. Dziêki odkryciom z dziedziny biologii molekularnej dokonanym w po³owie lat 80. przez A.J. Jeffreysa 1 mo liwa sta³a siê indywidualizacja œladu biologicznego i wskazanie, z prawdopodobieñstwem granicz¹cym z pewnoœci¹, konkretnej osoby, od której œlad pochodzi. Dziêki opracowaniu metody powielania pojedynczych fragmentów DNA nast¹pi³ prze³om w badaniu œladów biologicznych. Metoda zaproponowana przez Mullisa 2, zwana technik¹ amplifikacji PCR (Polymerase Chain Reaction), umo liwi³a bowiem badanie materia- ³u zawieraj¹cego znikom¹ iloœæ DNA i dawa³a szansê na badania DNA czêœciowo zdegradowanego, pochodz¹cego np. z ekshumowanych zw³ok 3. Obecnie do badañ na potrzeby identyfikacji osobniczej wykorzystywane s¹ najczêœciej sekwencje mikrosatelitarne zwane krótkimi powtórzeniami tandemowymi STR (Short Tandem Repeats). Markery STR s¹ silnie polimorficzne i mo na dziêki nim uzyskaæ wynik genotypowania z bardzo ma³ej iloœci materia³u biologicznego 4. Analiza DNA za pomoc¹ zestawów multipleksowych STR, z zastosowaniem reakcji PCR w rutynowym postêpowaniu, pozwala na osi¹gniêcie bardzo du ej si³y dyskryminacji. W niektórych przypadkach przedmiotem badañ s¹ próbki DNA o znacznym stopniu zdegradowania. Ró ne czynniki atmosferyczne, jak wysoka temperatura i wilgotnoœæ, promieniowanie UV oraz ogieñ powoduj¹ fragmentacjê DNA do krótkich odcinków (w komórkach zachodz¹ wówczas procesy biochemiczne, oksydacyjne i bakteryjne) 5. Z materia³em zdegradowanym specjaliœci mieli do czynienia podczas badania DNA ofiar ataku terrorystycznego na Word Trade Center z 11 wrzeœnia 2001 r. Œlady biologiczne wystêpuj¹ ponadto na rozmaitych pod³o ach, które mog¹ zawieraæ substancje chemiczne hamuj¹ce reakcjê PCR. Do takich czynników nale y miêdzy innymi znajduj¹cy siê w tkaninach d insowych barwnik indygo czy kwas huminowy obecny w glebie. W sytuacji gdy DNA jest silnie zdegradowane lub reakcja PCR jest hamowana, analiza zestawem multipleksowym STR uniemo liwia uzyskanie pe³nego profilu 6. J.M. Butler 7 i B. Budowle 8 poszukiwali odpowiedniego zestawu multipleksowego do analizowania zdegradowanego DNA. Zauwa yli, e krótsze amplikony daj¹ wiêksz¹ szansê na otrzymanie produktu PCR z powielanych fragmentów 9. Do systemów zawieraj¹cych niskocz¹steczkowe markery daj¹ce amplikony o niewielkich d³ugoœciach nale ¹ markery polimorfizmu pojedynczego nukleotydu SNP (Single Nucleotide Polymorphism) oraz markery ministr maj¹ce krótkie regiony flankuj¹ce 10. Komercyjne markery multipleksowe STR generuj¹ produkty w zakresie d³ugoœci od 100 do 450 par zasad 11, natomiast produkty amplifikacji ministr mieszcz¹ siê w zakresie d³ugoœci od 50 do 150 par zasad 12. Markery SNP pozwalaj¹ osi¹gn¹æ amplikony o najmniejszej wielkoœci (40 par zasad), dlatego mog³yby byæ bardziej preferowane ni markery ministr. Nale y zauwa yæ, e zestawy multipleksowe SNP obejmuj¹ du- ¹ liczbê analizowanych uk³adów, wahaj¹c¹ siê w granicach od 40 do 50 loci. W takiej sytuacji trudno o odtwarzalnoœæ i powtarzalnoœæ wyników badañ, zmniejsza siê równie efektywnoœæ amplifikacji 13. Aby uzyskaæ lepsz¹ jakoœæ profili, mo na, prowadz¹c reakcje wieloprobówkowe, stosowaæ równoczeœnie kilka zestawów multipleksowych SNP. Takie rozwi¹zanie wymaga jednak wykorzystania du ej iloœci materia³u genetycznego 14, a wyniki nie daj¹ mo liwoœci porównywania ich z profilami oznaczanymi w systemach multipleksowych STR zarejestrowanymi w narodowych bazach danych DNA 15. Optymalnym rozwi¹zaniem w przypadku badañ zdegradowanych œladów jest wiêc wykorzystanie markerów ministr, które daj¹ mo liwoœæ takiego porównywania. Amplifikowany obszar w locus ministr powinien zostaæ skrócony poprzez przesuniêcie starterów w stronê obszaru repetetywnego na jak najmniejsz¹ odleg³oœæ. Prowadz¹c badania, najwy sz¹ czu³oœæ uzyskiwano dla produktów posiadaj¹cych wielkoœæ poni ej 150 par zasad 16, co zainicjowa³o debatê na temat tego, który ze znanych systemów pozwoli na uzyskiwanie najlepszych wyników 17. Rozwój technologii i wprowadzanie nowych metod badawczych do laboratoriów kryminalistycznych s¹ koordynowane przez miêdzynarodowe organizacje, które wytyczaj¹ standardy gwarantuj¹ce wysok¹ jakoœæ badañ. ENFSI Europejska Sieæ Laboratoriów Kryminalistycznych (European Network of Forensic Science Institutes) we wspó³pracy z ENDAP Europejsk¹ Grup¹ Profilowania DNA (European DNA Profiling Group) opublikowa³a seriê dokumentów dostarczaj¹cych wskazówek 56

i rekomendacji, które dotycz¹ badañ polimorfizmu DNA na potrzeby identyfikacji osobniczej. Celem publikacji by³a standaryzacja metodyki profilowania DNA umo liwiaj¹ca porównywanie uzyskanych wyników miêdzy laboratoriami w ca³ej Europie. W laboratoriach europejskich stosuje siê kilka komercyjnych zestawów STR 18 i chocia oficjalna liczba loci akceptowana przez Interpol wynosi 7 (International Standard Set of Loci, w skr. ISSOL), to wiele laboratoriów prezentuje wyniki badañ porównawczych w znacznie wiêkszym zakresie analizowanych uk³adów. W krêgach kryminalistycznych okreœlono podstawowe zestawy markerów STR, których nale y u ywaæ w celu identyfikacji osób. Przyk³adem mo e byæ amerykañskie Federalne Biuro Œledcze (Federal Bureau of Investigation), które wyznaczy³o dla swoich baz danych 13 loci STR systemu CODIS (Combined DNA Index System). Ze wzglêdu na szerokie zastosowanie stanowi¹ one dla naukowców idealny materia³ wyjœciowy do projektowania nowych starterów 19. W celu polepszenia jakoœci wyników analiz zdegradowanego DNA grupy ENFSI i EDNAP opracowa³y zalecenia, wedle których nale y zmieniaæ obecnie u ywane zestawy multipleksowe. Wprowadzanie innowacji powinno przyczyniæ siê do zwiêkszenia si³y dyskryminacji oraz poprawy czu³oœci testów 20. Z tego powodu zestawy ministr ciesz¹ siê szczególnym zainteresowaniem. Butler i wsp. 21 zaprezentowali nowe startery, które amplifikuj¹ 13 loci STR systemu CODIS, a tak e markery Penta D, Penta E i D2S1338. Wszystkie znajduj¹ siê w komercyjnych zestawach STR (tab. 1). Ka dy z markerów STR zmniejszono o tak¹ iloœæ par zasad, na jak¹ pozwala³a budowa sekwencyjna danego markera. Sekwencje referencyjne dla skracanych markerów STR otrzymano z Banku Genów 22 (tab. 2). Tabela 1 Zestawienie loci komercyjnych zestawów multipleksowych z systemami ministr. Kolorem ó³tym oznaczono zestaw loci ENFSI, kolorem niebieskim dodatkowe loci CODIS niewchodz¹ce w sk³ad zestawu ENFSI Commercial sets of STR markers compiled with ministr systems. ENFSI loci are marked yellow, CODIS loci are marked blue Komercyjne zestawy multipleksowe STR Komercyjne zestawy multipleksowe ministr Zestawy ministr zaproponowane przez Butlera i wsp. Układ SGM Plus TM Identifiler Profiler Plus CoFiler Profiler PowerPlex 16 PowerPlex ES PowerPlex 1.2 MPX-2LF MPX-SP1 MPX-SP2 MiniFiler TM Miniplex 1 Miniplex 2 Miniplex 3 Miniplex 4 Miniplex 5 BigMini D3S1358 + + + + + + + + + vwa + + + + + + + + + + D16S539 + + + + + + + D2S1338 + + + + AMG + + + + + + + + + + + D8S1179 + + + + + + + + D21S11 + + + + + + + + + + D18S51 + + + + + + + + + D19S433 + + TH01 + + + + + + + + + + + + FGA + + + + + + + + + + + CSF1PO + + + + + + + + D5S818 + + + + + + D7S820 + + + + + + + + + D13S317 + + + + + + + TPOX + + + + + + + Penta D + + Penta E + + SE33 + + * + * W podanym zestawie marker dla locus SE33 nie zosta³ skrócony 57

Redukcja wielkoœci amplikonów loci ministr Size reduction of amplicons within ministr loci Tabela 2 Układ STR Numer dostępu Banku Genów dla sekwencji referencyjnej MiniFiler TM Redukcja rozmiaru amplikonu MiniSTR D3S1358 NT_005997 25 pz 3 vwa M25858 64 pz 3 D16S539 AC024591 157 pz 1 152 pz 2 D2S1338 AC010136 183 pz 1 198 pz 1 D8S1179 AF216671 37 pz 3 D21S11 AP000433 33 pz 1 33 pz 3 D18S51 AP001534 168 pz 1 151 pz 3 TH01 D00269 105 pz 2 FGA M64982 87 pz 1 71 pz 3 CSF1PO X14720 201 pz 1 191 pz 2 D5S818 AC008512 53 pz 3 D7S820 AC004848 129 pz 1 117 pz 3 D13S317 AL353628 99 pz 1 105 pz 3 TPOX M68651 148 pz 2 Penta D AP001752 282 pz 4 Penta E AC027004 299 pz 4 1 porównanie z zestawami Identifiler oraz SGM Plus 2 porównanie z zestawem CoFiler 3 porównanie z zestawem Profiler Plus 4 porównanie z zestawem PowerPlex16 1 in comparison with Identifiler and SGM Plus 2 in comparison with CoFiler 3 in comparison with Profiler Plus 4 in comparison with PowerPlex16 Do projektowania mo liwie najmniejszych produktów PCR dla ka - dego markera u yto dostêpnego w Internecie programu Primer3 23, programu ³atwego w obs³udze i umo liwiaj¹cego definiowanie parametrów, jak minimalna i maksymalna d³ugoœæ startera, temperatura topnienia czy wielkoœæ produktu PCR. Obszar powielany zawiera³ region powtarzalny STR oraz regiony flankuj¹ce, w których zaobserwowano czêœciowe powtórzenia lub jednonukleotydowe ci¹gi powtórzeñ. Wyjœciowa wielkoœæ produktu PCR, jak¹ ustawiano w punkcie startowym Primer3, wynosi³a 80 100 par zasad. Temperatura topnienia dla efektywnego startera obliczona na podstawie wzoru podanego przez Maniatisa i wsp. 24 powinna mieœciæ siê w zakresie od 57 o C do 63 o C i byæ zbli ona do temperatury hybrydyzacji PCR wynosz¹cej 55 o C. Wysokoœæ temperatury topnienia zale y od d³ugoœci startera oraz iloœci zawartych w nim zasad G oraz C 25. Niektóre markery STR maj¹ sekwencje flankuj¹ce, zawieraj¹ce polimorficzne nukleotydy, a tak e nukleotydowe ci¹gi powtórzeñ, insercje lub delecje, co mo e uniemo liwiaæ stabilne przy³¹czenie startera do matrycy DNA. Nie wszystkie startery mog¹ zostaæ wiêc zaprojektowane tak, aby przy³¹czaæ siê najbli ej obszaru powtórzeñ STR. Projektuj¹c startery dla danego markera, nale y ka dorazowo uwzglêdniaæ budowê sekwencyjn¹ obszaru flankuj¹cego. Przyk³adem mo e byæ locus D7S820, w którym rozci¹gniêcie sekwencji poly-t umiejscowione jest w odleg³oœci trzynastu nukleotydów za rdzeniem powtórzenia GATA i zawiera 8, 9 lub 10 nukleotydów tyminowych 26. Taki polimorfizm rozci¹gniêæ T powoduje bardzo du y wzrost liczby wariantów alleli, dlatego starter odwrócony (reversed) dla locus D7S820 powinien zostaæ zaprojektowany w taki sposób, aby obszar powielany obejmowa³ rozci¹gniêcia poly-t. Pozwala to uzyskaæ pe³n¹ zgodnoœæ z wynikami otrzymanymi dla komercyjnych zestawów STR 27. Zestawy multipleksowe ministr mog¹ poprawiæ wyniki analizy STR w przypadkach, gdy dosz³o do tzw. wypadania alleli (drop out) na skutek polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w obszarze przy³¹czania startera. Tego typu zjawisko zaobserwowano 58

dla locus D8S1179 w zestawie Profiler Plus w miejscu przy³¹czenia startera odwróconego (55 nukleotyd poni ej powtórzenia) wystêpowa³ polimorfizm pojedynczego nukleotydu. Spowodowa³o to wypadanie alleli dla niektórych próbek pochodz¹cych z Azji 28. Odwrócony starter ministr D8S1179 zosta³ zaprojektowany tak, aby obszar jego przy³¹czania znajdowa³ siê poza tym polimorfizmem, co z kolei eliminuje ryzyko wyst¹pienia zjawiska wypadania alleli. W przypadku umieszczania starterów w bezpoœrednim s¹siedztwie regionu powtarzalnego STR z pominiêciem regionu flankuj¹cego, w którym wystêpuje insercja lub delecja, mo liwe jest uzyskanie produktu amplifikacji z allelem zdefiniowanym inaczej ni w zestawie komercyjnym. Na przyk³ad w locus D13S317 J. Drabek i wsp. definiowali allele 11 i 13 29 z u yciem zestawu minipleksowego zaproponowanego przez Butlera i wsp. 30, natomiast z u yciem zestawów Identifiler i Power- Plex 16 allele 10 i 13. Porównanie uzyskanych wyników analiz próbek tego samego DNA za pomoc¹ komercyjnego zestawu multipleksowego Identifiler i zestawu ministr w obrêbie locus D13S317 przedstawia rycina 1 31. Zjawisko to by- ³o spowodowane potencjaln¹ delecj¹ czterech nukleotydów TGTC w obszarze flankuj¹cym, znajduj¹c¹ siê w odleg³oœci 24 par zasad za blokiem powtórzeñ TATC. Komercyjne zestawy definiowa³y allel z delecj¹ jako posiadaj¹cy 10 powtórzeñ. Ich faktyczn¹ liczbê 11, ujawni³o dopiero przesuniêcie starterów z pominiêciem obszaru delecji 32. Przesuniêcie starterów ministr poza obszar wystêpowania delecji przedstawia rycina 2 33. Butler i wsp. 34 zaobserwowali, e istnieje mo liwoœæ umieszczenia koñca 3 startera w obszarze powtarzalnym STR. Starter zosta³ zaprojektowany tak, aby przy³¹czaæ siê o dwa pe³ne powtórzenia powy ej obszaru repetetywnego. Mimo to nadal uzyskiwano wydajn¹ amplifikacjê. Przyk³adem mo e byæ zestaw zawieraj¹cy przesuniêty starter frontowy (forward) TPOX, nachodz¹cy na obszar czterech zasad, czyli na jedno pe³ne powtórzenie 35. Coble wraz z Butlerem kontynuowali prace nad nowymi markerami ministr. Wspólnie zaprojektowali i przetestowali startery dla nastêpuj¹cych loci: D1S1677, D2S441, D4S2364, D10S1248, D14S1434 oraz D22S1045. Najwiêksz¹ si³ê dyskryminacji uzyskano dla D2S441, D10S1248 i D22S1045 36. Znalaz³o to odzwierciedlenie w wytycznych grup EDNAP/ENFSI dotycz¹cych Ryc 1. Porównanie wyników analiz próbek DNA pochodz¹cych od tej samej osoby za pomoc¹ komercyjnego zestawu multipleksowego Identifiler izestawu ministr zaprojektowanego przez Butlera i wsp. w obrêbie locus D13S317 Fig. 1. Comparison of results obtained from Identifiler and ministr set designed by Butler et. al with the same DNA samples using the D13S317 marker ujednolicenia systemu dzia³aj¹cego w Europie i zalecaj¹cych w³¹czenie tych trzech uk³adów ministr do standardowego zestawu loci (IS- SOL). Narodowe bazy danych DNA zosta³y stworzone na bazie ró nych ze- Ryc. 2. Schemat przedstawiaj¹cy przesuniêcie starterów STR z pominiêciem obszaru delecji Fig. 2. Shifting STR markers outside deletion region stawów multipleksowych STR, dlatego podczas zastêpowania ich markerami ministr bêd¹ musia³y zostaæ uwzglêdnione wymagania poszczególnych krajów. Konieczne staje siê wprowadzenie zestawów z wieloma markerami, wœród których nowe loci koegzystowaæ bêd¹ z dotychczasowymi. Rdzeñ 7 loci ISSOL, wykorzystywany w narodowych bazach danych DNA, bêdzie zastêpowany markerami ministr poprzez skracanie amplifikowanych obszarów. Zalet¹ markerów ministr jest zachowanie kompatybilnoœci oznaczanych profili DNA z profilami ju znajduj¹cymi siê w bazach danych DNA 37. G³ówne zalecenie dotycz¹ce nowych starterów mówi o tym, e ich wbudowywanie powinno nastêpowaæ blisko regionów repetetywnych 38. Dyskusja cz³onków grup ED- NAP/ENFSI z producentami pokaza- ³a, e istniej¹ znaczne ograniczenia w produkcji zestawów multipleksowych zgodnych z przedstawionymi wymaganiami. Do rozwoju nowych multipleksów zawieraj¹cych wiêcej 59

ni 13 loci STR potrzebne s¹ czas i znaczne nak³ady œrodków, dlatego producenci zasugerowali, aby stopniowo wdra aæ markery ministr. Pozwoli to na ostro ne œledzenie zmian na ka dym etapie rozwoju i umo liwi odpowiednie poczynienie dalszych kroków. W zwi¹zku z tym wy³oni³y siê dwie ró ni¹ce siê, lecz równoleg³e strategie, z których pierwsza zak³ada utworzenie zestawu 13 loci ministr. Najprostszym rozwi¹zaniem technicznym jest zatem po³¹czenie 10 zredukowanych loci SGM Plus TM z trzema nowymi markerami ministr D10S1248, D2S441 oraz D22S1045. Takie rozwi¹zanie zwiêkszy³oby wydajnoœæ i si³ê dyskryminacji nowego zestawu 39, co w efekcie skróci³oby czas wprowadzenia nowego systemu. Laboratoria preferuj¹ce tê strategiê wol¹ u ywaæ jednego zestawu multipleksowego dla oznaczania wszystkich rodzajów materia³ów dowodowych, w tym równie próbek wysoce zdegradowanego DNA. Druga strategia zak³ada wykorzystanie zestawu multipleksowego STR sk³adaj¹cego siê z szeœciu obecnie u ywanych wysokocz¹steczkowych markerów STR zmodyfikowanych tak, by uzyskaæ mniejsze amplikony z dodaniem dwóch loci midistr (120 180 par zasad) o du ej sile dyskryminacji. Zak³ada siê, e nowy zestaw multipleksowy by³by stworzony w oparciu o komercyjne zestawy STR. Wiele laboratoriów wyrazi³o chêæ do³¹czenia zwalidowanych ju Strategia 1 Strategia 1 10 niskocz¹steczkowych loci + 3 loci ministr = 13 loci ministr dla pañstw u ywaj¹cych SGM Plus TM Mo liwoœæ dodania D12S391 i D1S1656 Po³¹czenie strategii 1 i 2 z uwzglêdnieniem ró nic narodowych. 15 loci ministr dla baz danych u ywaj¹cych systemu SGM Plus TM Ryc. 3. Strategie wprowadzania zestawów multipleksowych ministr Fig. 3. Strategies of introduction the ministr multiplexes 6 niskocz¹steczkowych loci istniej¹cych systemów + mo liwoœæ dodania D12S391 i D1S1656 = zestaw multipleksowy ministr Wprowadzenie kolejnych loci ministr przez EDNAP loci midistr: D12S391 oraz D1S1656. Zalet¹ tych loci jest wysoka si³a dyskryminacji (0,0067). Rozwa a siê równie w³¹czenie locus TPOX, który mo e byæ zaprojektowany jako ministr. Posiada on relatywnie ma³¹ si³ê dyskryminacji, dlatego jest przedmiotem dyskusji. Nowy zestaw multipleksowy nie zast¹pi³by obecnie u ywanych zestawów, stanowi³by zaœ alternatywn¹ metodê postêpowania w przypadku zdegradowanego materia³u genetycznego: dwa zestawy multipleksowe u ywane równolegle dawa- ³yby mo liwoœæ prowadzenia powi¹zañ badañ œladów z profilami znajduj¹cymi siê w narodowych bazach danych DNA. Niew¹tpliwie jest to zalet¹ powy szej propozycji 40. Nadrzêdnym wymaganiem w stosunku do nowych strategii jest zwiêkszenie liczby 7 uniwersalnych loci ISSOL, które mog³yby byæ u ywane w ca³ej Europie. W przeciwnym razie nie bêdzie mo liwoœci efektywnego porównywania wyników analiz w europejskich bazach danych. Przedstawione strategie mog³yby zostaæ w póÿniejszym czasie po³¹czone (ryc. 3), co doprowadzi³oby do uzyskania zestawu multipleksowego 15 loci ministr. Proces ten by³by kierowany przez grupy EDNAP/ENFSI 41. Podczas tworzenia nowych zestawów zostan¹ uwzglêdnione równie lokalne wymagania, które jednak pozostan¹ poza zakresem rekomendacji 42, takie jak wprowadzenie locus SE33 dla laboratoriów niemieckich. Wed³ug aktualnych wytycznych nale y wprowadzaæ systemy ministr jako sposób zwiêkszenia czu- ³oœci analizy. G³ównym celem nie jest wprowadzenie metody o bardzo wysokiej czu³oœci czy odpowiednika metody niskiej liczby kopii (Low Copy Numer, w skr. LCN), lecz u³atwienie analizy czêœciowo zdegradowanego DNA poprzez zwiêkszenie si³y dyskryminacji i poprawienie efektywnoœci porównañ wyników miêdzy narodowymi bazami danych. Trzeba mieæ równie na uwadze fakt, e im wiêcej loci zawiera zestaw multipleksowy, tym mniejsza jest wydajnoœæ procesu amplifikacji, a tak e powtarzalnoœæ i odtwarzalnoœæ metody. Oznacza to, e dobre wyniki osi¹ga siê dziêki kompromisowi polegaj¹cemu na wypoœrodkowaniu miêdzy rozmiarem zestawu, a jego efektywnoœci¹ 43. PRZYPISY Magdalena Spólnicka Jacek Drabik tab. i ryc. 3.: autorzy 1 A.J. Jeffreys, V. Wilson, S.W. Thein: Hypervariable minisatellite regions in human DNA, Nature 1985, nr 314, s. 67 73; 2 K.B. Mullis., A.F. Faloona: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, Methods in Enzymology 1987, nr 155, s. 350 355; 60

3 M. Czarny, J. Kwiatkowska, M. S³omska., B. Siemianko, R. S³omski: Mo liwoœci badawcze polimorficznych loci DNA cz³owieka i ich wykorzystanie w badaniach medyczno-s¹dowych, Arch. Med. S¹d. Kryminol. 1995, nr 45, s. 257 262; K.B Mullis: The polymerase chain reaction in an anemic mode: How avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion, PCR Methods and Appl. 1991, nr 1, s. 1 4; K. Mullis, A.F. Faloona, S. Schaff, R. Saiki, G. Horn, H. Erlich: Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 1986, nr 51, s. 263 273; 4 S.S. Arcos, Z. Wang, J.L. Weber, P.L. Deininger, M.A. Balzer: Alu repeats: a source for the Genesis of primate microsatellites, Genomics 1995, nr 29, s. 136 144; R.K. Bunker, Y-P Mao, D. Gluten, V.J. Dzan, E.S. Lander: Genetic mapping of a gene causing hypertension in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat, Cell 1991, nr 67, s. 213 224; J.L. Weber, P.E. May: Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction, Am. J. Hum. Genet. 1989, nr 44, s. 388 396; 5 J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: The Development of Reduced Size STR Amplicons as Tools for Analysis of Degraded DNA, J. Forensic Sci. 2003, nr 48 (5), s. 1054 1064; 6 J.P. Whitaker, T. M. Clayton, A.J. Urquhart, E.S. Millican, T.J. Downes, C.P. Kimpton: Short tandem repeat typing of bodies from a mass disaster: high success rate and characteristic amplification patterns in highly degraded samples. BioTechniques 1995, nr 18 (4), s. 670 677; 7 J.M. Butler: Forensic DNA Typing. Elsevier Academic Press, Burlington, London 2005, s. 148 150; 8 B. Budowle: SNP typing strategies, Forensic Sci. Int. 2004, nr 146 (Suppl.), s. 139 142; 9 J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit, s. 1054 1064; M.D. Coble, J.M. Butler: Characterization of new mini-str loci to aid analysis of degraded DNA, Forensic Sci. 2005, nr 50, s. 43 53; A. Hellmann, U. Rohleder, H. Schmitter, M. Wittig: STR typing of human telogen hairs a new approach, Int. J. Legal Med. 2001, nr 114, s. 269 273; 10 L.A. Dixon, A.E. Dobbins, H.K. Pulker, J.M. Butler, P.M. Vallone, M.D. Coble, W. Parson, B. Berger, P. Grubwieser, H.S. Mogensen, N. Morling, K. Nielsen, J.J. Sanchez, E. Petkovski, A. Carracedo, P. Sanchez-Diz, E. Ramos-Luis, M. Brion, J.A. Irwin, R.S. Just, O. Loreille, T.J. Parsons, D. Syndercombe-Court, H. Schmitter, B. Stradmann-Bellinghausen, K. Bender, P. Gill: Analysis of artificially degraded DNA using STRs and SNPs results of collaborative European (EDNAP) exercise, Forensic Sci. Int. 2006, nr 164, s. 33 44; 11 B.E. Krenke, A. Tereba, S.J. Anderson, E. Buel, S. Culhane, C.J. Finis, et al.: Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system, J. Forensic Sci. 2002, nr 47 (4), s. 773 85; 12 J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit, s. 1054 1064; L.A. Dixon, A.E. Dobbins, H.K. Pulker:... op.cit., s. 33 44; 13 B. Budowle: op.cit., s. 139 142; 14 P.A. Bell., S. Chaturvedi, C.A. Gelfand, C.Y. Huang, M. Kochersperger, R. Kopla, F. Modica, M. Pohl, S. Varde, R. Zhao, X. Zhao, M.T. Boyce-Jacino: SNPstream UHT: ultra-high throughput SNP genotyping for pharmacogenomics and drug discovery, Biotechniques (Suppl.) 2002, s. 7 77; S. Inagaki, Y. Yamamoto, Y. Doi, T. Takata, T. Ishikawa, K. Imabayashi, K. Yoshitome, S. Miyaishi, H. Ishuzu: A new 39-plex analysis method for SNPs including 15 blood group loci, Forensic Sci. Int. 2004, nr 144, s. 45 57; 15 P. Gill: An assessment of the utility of single nucleotide polymorphisms (SNPs) for forensic purposes, Int. J. Legal Med. 2001, nr 114, s. 204 210; 16 L.A. Dixon, A.E. Dobbins, H.K. Pulker:...op.cit., s. 33 44; 17 P. Gill, D.J. Werrett, B. Budowle, R. Guerrieri: An assessment of whether SNPs will replace STRs in national DNA databases joint considerations of the DNA working group of the European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) and the Scientific Working group on DNA Analysis Methods (SWGDAM), Sci. Justice 2004, nr 44, s. 51 53; 18 http://www.enfsi.org/ewg/activities; 19 J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit, s. 1054 1064; P. Gill, L. Fereday, N. Morling, P.M. Schneider: The evolution of DNA databases Recommendations for new European STR loci, Forensic Sci. Int. 2006, nr 156, s. 242 244; 20 J. Drabek, D.T. Chung, J.M. Butler, B.R. McCord: Concordance study between Miniplex assays and a commercial STR typing kit, Forensic Sci. Int. 2004, nr 49, s. 859 860; P. Gill, L. Fereday, N. Morling, P.M. Schneider: op.cit., s. 242 244; A. Hellmann, U. Rohleder, H. Schmitter, M. Wittig: op.cit., s. 269 273; 21 J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit., s. 1054 1064; 22 http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/seq_ref.htm; 23 http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/ministr.htm; 24 T. Maniatis, E.F. Fritsch: Molecular Cloning A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor N.Y, 1982; 25 J.M Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit., s. 1054 1064; T. Maniatis, E.F. Fritsch: op.cit.; 26 P. Gill, L. Fereday, N. Morling, P. M. Schneider: New multiplexes for Europe amendments and clarification of strategic development, Forensic Sci. Int. 2006, nr 163 (1 2), s. 155 157; 61

27 J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit., s. 1054 1064; P. Gill, L. Fereday, N. Morling, P.M. Schneider: op.cit.; 28 B. Budowle, A. Masibay, S.J. Anderson, C. Barna, L. Biega, S. Brenneke: STR primer concordance study, Forensic Sci. Int. 2001, nr 124 (1), s. 47 54; J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit., s. 1054 1064; G.R. Han, E.S. Song, J.J. Hwang: Non-amplification of an allele of the D8S1179 locus due to a point mutation, Int. J. Legal Med. 2001, nr 115 (10, s. 45 47; 29 J. Drabek, D.T Chung, J.M Butler, B.R. McCord: op.cit., s. 859 860; 30 J.M. Butler, Y. Shen, B.R McCord: op.cit.; 31 http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/ministr.htm; 32 J. Drabek, D.T. Chung, J.M. Butler, B.R. McCord: op.cit., s. 859 860; 33 http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/ministr.htm; 34 M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit., s. 1054 1064; 35 J.M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: ibidem; http://www.cstl.nist.gov/div 831/strbase/miniSTR.htm 36 M.D. Coble, J.M. Butler: Characterization of new mini-str loci to aid analysis of degraded DNA, J. Forensic Sci. 2005, nr 50, s. 43 53; 37 M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit., s. 1054 1064; 38 J. Drabek, D.T. Chung, J.M. Butler, B.R. McCord: op.cit, s. 859 860; P. Gill, L. Fereday, N. Morling, P.M. Schneider: op. cit., s. 242 244; A. Hellmann, U. Rohleder, H. Schmitter, M. Wittig, op.cit., s. 269 273; 39 M. Butler, Y. Shen, B.R. McCord: op.cit., s. 1054 1064; M.D Coble, J.M Butler, op.cit., s. 43 53; P. Gill, L. Fereday, N. Morling, P.M. Schneider: New multiplexes for Europe... op.cit., s. 155 157; 40 P. Gill, L. Fereday, N. Morling, P.M. Schneider: New multiplexes for Europe... op.cit., s. 155 157; 41 Ibidem; 42 Ibidem; 43 P. Gill, L. Fereday, N. Morling, P.M. Schneider: op.cit., s. 242 244. w nastêpnym numerze Ocena dowodu z opinii bieg³ego przez organ procesowy w postêpowaniu karnym. Wykorzystanie opinii bieg³ego w polskim procesie karnym. Monika Ca³kiewicz Nitrowanie jako technika derywatyzacji przy identyfikacji N-(m-chlorofenylo)piperazyny (m-cpp) Ma³gorzata Czajkowska, ukasz Matyjasek Komputer to nie wszystko Józef Gurgul N,N-dietylobenzyloamina produkt utleniania benzoesanu denatonium podchlorynem sodu ukasz Matyjasek Miêdzynarodowa konferencja naukowa Edukacja policjantów a technologie informacyjne Ma³gorzata Olewiñska Kryteria oceny opinii bieg³ych Ma³gorzata o³na Szeroka rozpiêtoœæ tonalna i du a g³êbia ostroœci zdjêæ sposoby rozwi¹zania problemu z ich uzyskaniem Waldemar Nowicki 62