Konstrukcja wektora plazmidowego DNA do klonowania genów i/lub wektora plazmidowego do sekrecji w bakteriach mlekowych
Łukasz Tranda Promotor: doc. dr hab. Jacek Bardowski, IBB Promotor: dr hab. Edward Darżynkiewicz, prof. nadzw. UW
Co to jest plazmid? Charakteryzacja bakterii fermentacji mlekowej. Dlaczego warto skonstruować własny wektor? Jak wygląda wektror plazmidowy?
Co to jest plazmid? Plazmidy są to autonomiczne, pozachromosalne elementy genetyczne występujące u wielu organizmów prokariotycznych i niektórych eukariotów. Charakterystyczną ich cechą jest: fizyczna odrębność od chromosomu, zdolność do trwałego utrzymywania i replikowania się w komórce. Plazmid nie koduje funkcji, które byłyby konieczne do jej życia. Zwiększa natomiast różnorodność zajmowanych środowisk. Ilość genów zgromadzonych w plazmidach odgrywa znaczącą rolę w ewolucji i zdolności adaptacyjnych komórek, w których się znajdują.
Struktura przestrzenna plazmidu: Cząsteczki są zazwyczaj kowalencyjnie zamknięte, koliste i superzwinięte. U pewnych bakterii i drożdży stwierdzono również plazmidy liniowe. Wielkość: plazmid 2-100 kb i większe chromosom 1,8 2,5 Mb
Replikacja plazmidów: Replikacja plazmidu odbywa się niezależnie od replikacji chromosomu komórki. Uznaje się je za pasożyty wewnątrzkomórkowe, które nadają komórce korzystny, w specyficznych warunkach, fenotyp. Replikację możemy podzielić na: Horyzontalną czyli poziomą; Wertykalną czyli pionową;
Replikacja Pionowa: dotyczy przekazania genów w obrębie tego samego gatunku: Małe cząsteczki korzystają z systemu replikacyjnego gospodarza i jedynie potrzebują fragmentu zawierającego geny replikacji (rep). Jest to miejsce przyłączania się polimerazy DNA i wszystkich elementów potrzebnych do replikacji. Podczas podziału komórki małe fragmenty są rozdzielane losowo wraz z podziałem cytoplazmy. Duże plazmidy, mogą nieść geny, kodujące potrzebne składniki do replikacji. Podczas podziału komórki, po wcześniejszym powieleniu się plazmidów, są one rozdzielane jak chromosom, dzięki powiązaniu s z błoną poprzez mechanizm segregacji. Istnieją również plazmidy mogące integrować do chromosomu bakterii i ich replikacja zachodzi podczas powielania chromosomu.
Replikacja Pozioma: dotyczy przekazania genów pomiędzy różnymi gatunkami: Koniugacja to mechanizm przenoszenia marteriału genetycznego z komórki do komórki, z udziłem plazmidu. Komórka zwierająca plazmid koniugacyjny (F+, płodna) tworzy pary koniugacyjne z komórkami nie zawierającymi takiego plazmidu (F-, niepłodna). Wytwarzając pilus, mostek łączący dwie komórki, który kurczy się powodując zbliżenie się koniugujących komórek. Dzięki takiemu połączeniu przenoszony jest DNA od dawcy F+ do biorcy F-. Geny tra niesione przez plazmid F zawierają pełną informację dotyczącą procesu koniugacji.
Transfer genów bakteryjnych z jednej komórki do drugiej przez pakowanie ich w DNA faga. Tego typu przekaz genów nazywamy transdukcją. Komórki mogą pobierać nowe geny przez pobranie nagiego DNA z otaczającego podłoża. Ten proces nazywamy transformacją. Zdolność komórki do pobrania DNA zależy od jej szczególnego stanu który nazywamy kompetencją. Przykładem jest elektroporacja, która jest sztucznym procesem wstrzelanie plazmidu do komórki. Swobodne plazmidy wraz z komórkami mającymi przyjąć DNA umieszczamy w impulsie pola elektrycznego. W wyniku przepływu prądu powstają dziury w ścianie komórkowej i plazmid wnika do komórki.
Krótka charakterystyka bakterii fermentacji mlekowej: gram dodatnie; fermentacja cukrów do kwasu mlekowego; obniżaanie ph środowiska do wartości 4,5-3,5; optymalna temperatura wynosi 30st C lub 37-45st C; Posiadanie statusu GRAS; czas generacji wynosi od 30 do 60 minut; Fakultatywne życie beztlenowe; wykorzystywanie w parafarmacji; ważne w biotechnologii, stosowane w przemyśle rolno-spożywczym; komórki mogą być pałeczkowate lub ziarniaki; zapobiegają niektórym schorzenią (np. alergia);
Lactobacillus delbrueckii Streptococcus thermophilus
Lactococcus lactis Lactobacillus casei
Bifidobacterium longum Leuconostoc mesenteroides
Wykorzystanie bakterii mlekowych jako model badawczy i aplikacyjny: Konstrukcja wektorów szczepionkowych w bakteriach jako adiowanty. Odgrywają one rolę w immunostymulacji układu odpornościowego; Jako GMO (genetycznie modyfikowane) produkują antygen i stymulują odporność; Jako probiotyki w hodowli zwierząt, którym nie będzie można aplikować antybiotyków; Zastosowanie probiotyków jest obecnie bardzo ograniczone ; Biotechnologia w produkcji rolno-spożywczej;
Dlaczego warto się zająć konstrukcją własnych wektorów plazmidowych? Dokonywanie zmian w bakteriach to pewne narzędzie do celów badawczych, ale również aplikacyjnych. W późniejszym okresie korzystanie z tych plazmidów jest bezproblemowe. Posiadając własny obiekt badawczy znika kwestia patentu. Plazmidy bakteryjne na bazie, których będziemy konstruować wektory będą pochodzić z własnej kolekcji IBB lub zostaną wizolowane ze szczepów naturlnych, na które nikt nie posiada patentu.
Typy genów obecnych w plazmidach: Pierwsze są niezbędne do funkcjonowania jako niezależny replikon, występujący na wszystkich plazmidach. Są to geny niezbędne do replikacji i utrzymania plazmidu w komórce nazywane genami rep. Plazmidy zawierające tylko pierwszy typ genów nie będą wyróżniały komórek bakteryjnych, które nazwano kryptycznymi. Ta sama nazwa odnosi się do plazmidów, których funkcji jeszcze nie znamy.
Drugim typem są geny, stanowiące dodatkowe wyposażenie w plazmidzie. Odpowiadają one za różnorodność fenotypów kodowanych przez plazmidy: Przetwarzanie substancji organicznych Odporność na wysoką temperaturę; Oporność na antybiotyki; Oporność na jony metali ciężkich; Produkcja bakteriocyn; Pozwalające żyć w nietypowym ph środowiska; Biodegradacja toksycznych związków organicznych; Cechy związane z patogennością bakterii wobec człowieka i zwierząt; Interakcje bakterii z komórkami roślinnymi; Efekt ochrony przed UV; itp.
Podstawowe geny, jakie powinien posiadać plazmid do klonowania: Geny rep, który powinien posiadać każdy plazmid Gen oporności na antybiotyk, aby można było identyfikować bakterie zawierające ten plazmid, np. tet. MCS tra Miejsce, gdzie będzie wstawiany gen, który ma zostać sklonowany. rep Geny tra odpowiedzialne za proces koniugacji.
Geny, jakie powinien posiadać wektor plazmidowy do sekrecji: Geny rep, który powinien posiadać każdy plazmid Gen oporności na antybiotyk, np. tet. aby można było identyfikować bakterie zawierające ten plazmid Miejsce, gdzie będzie wstawiany gen, który koduje białko przeznaczone do sekrecji Gen kodujący białko odpowiedzialne za sekrecję Geny tra odpowiedzialne za proces koniugacji rep MCS Sekrecja tra
Wektor do klonowania DNA w bakteriach mlekowych
Dziękuje za uwagę