VII. Diagnostyka mikrobiologiczna głównych drobnoustrojów odpowiedzialnych za zakażenia skóry i tkanek miękkich. Drobnoustroje z rodzajów Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus Staphylococcus ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 1. Ocena wzrostu szczepów gronkowców na: a. agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) typ hemolizy morfologia kolonii..... b. podłożu Chapmana (Ch)...... Ćwiczenie 2. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama. Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie III. Budowa komórki bakteryjnej, metody barwienia. preparat barwiony metodą Grama Opis preparatu:
Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych gronkowców i mikrokoków wykonanie próby na katalazę. Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie IV. Fizjologia bakterii. Szczep badany obserwowane wyniki... Wnioski:... Ćwiczenie 4. Różnicowanie gronkowców i mikrokoków za pomocą testu z furazolidonem. Zasada metody: Szczepy gronkowców są wrażliwe na furazolidon. Szczepy mikrokoków są oporne na furazolidon. Wykonanie oznaczenia: 1. Czystą hodowlę (pojedynczą kolonię) badanego szczepu, zidentyfikowanego jako ziarniak katalazo-dodatni, o gęstości około 0,5 w skali McFarlanda posiać na podłoże Muellera-Hintona, a następnie nałożyć krążek bibułowy nasycony 100 µg furazolidonu (można wykonać identyfikację kilku szczepów równocześnie, posiewając badane szczepy promieniście i nakładając krążek centralnie na płytkę). 2. Płytki z nałożonymi krążkami należy preinkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, następnie hodowlę inkubować w temperaturze 35⁰C przez 18-24 godziny, w atmosferze tlenowej. 3. Odczytać wielkość strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z furazolidonem. Wielkość 15 mm świadczy o wrażliwości na furazolidon.
Micrococcus spp. furazolidon 100µg Staphylococcus spp. Wnioski:... Ćwiczenie 5. Różnicowanie gronkowców koagulazo-dodatnich i koagulazo-ujemnych za pomocą próby na koagulazę. Koagulaza jest enzymem uwalnianym do otoczenia przez niektóre szczepy gronkowców, np.: gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus). Działa ona podobnie jak protrombina i zawarty w osoczu fibrynogen przekształca w fibrynę. W wyniku tej reakcji osocze ulega wykrzepianiu. Wykonanie: 1. Próbę na koagulazę wykonuje się w małych, wąskich probówkach. 2. Używa się świeżego lub liofilizowanego osocza króliczego rozcieńczonego w stosunku 1:5 roztworem 0,9% NaCl (zgodnie z instrukcją dołączoną przez producenta). 3. Do 0,5 ml osocza króliczego dodaje się 1 pełne oczko ezy 18-24 godzinnej hodowli bakteryjnej. 4. Próbę inkubuje się w temperaturze 37⁰C przez 4 godziny. 5. O dodatniej próbie świadczy powstanie skrzepu. 6. W przypadku próbek ujemnych (osocze pozostaje płynne) inkubację przedłuża się do 18 godzin i ponownie odczytuje wynik. Należy pamiętać, że szczepy gronkowców koagulazo-dodatnich mogą wytwarzać fibrynolizynę, która upłynnia powstały skrzep (wynik fałszywie ujemny).
Badany szczep: Wynik:... Wnioski:... Ćwiczenie 6. Identyfikacja szczepu Staphylococcus aureus z wykorzystaniem testu Staphytect Plus. Zasada metody: STAPHYTECT PLUS firmy Oxoid to lateksowy test oparty na reakcji aglutynacji, który umożliwia detekcję S. aureus, na podstawie wykrycia trzech antygenów: białka A, czynnika CF, polisacharydu wykrytego u szczepów MRSA. Wykonanie: 1. Doprowadzić odczynniki lateksowe do temperatury pokojowej. Zawartość opakowania dokładnie wymieszać, poprzez energiczne wstrząśnięcie. 2. Wycisnąć po 1 kropli odczynnika lateksowego na jeden z okręgów znajdujących się na karcie reakcji. 3. Jałową ezą pobrać ok. 5 kolonii gronkowcowych, pochodzących z 24 godzinnej hodowli na agarze krwawym. Bakterie przenieść i kolistymi ruchami ezy rozprowadzić w odczynniku lateksowym. 4. Poruszając kartą reakcyjną do 20 sekund obserwować aglutynację w normalnych warunkach oświetleniowych. Nie używać szkła powiększającego. 5. W taki sam sposób postępować z pozostałymi koloniami gronkowców. 6. Po zakończeniu testu, karty reakcji bezpiecznie przenieść i umieścić w pojemnikach/ workach przeznaczonych do utylizacji. Kontrolę dodatnią i ujemną przeprowadzić w analogiczny sposób używając odpowiednio szczepów: Staphylococcus aureus ATCC 25923 i Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
Wyniki: Badany szczep: Wynik:... Wnioski:... Ćwiczenie 7. Różnicowanie gronkowców koagulazo-ujemnych (CNS) za pomocą testu z nowobiocyną. Zasada metody: Gronkowce koagulazo-ujemne różnicuje się na dwie grupy w zależności od wrażliwości na nowobiocynę. Do grupy nowobiocynoopornych należy grupa Staphylococcus saprophyticus, do grupy nowobiocynowrażliwych grupa Staphylococcus epidermidis. Wykonanie oznaczenia: 1. Czystą hodowlę (pojedynczą kolonię) badanego szczepu, zidentyfikowanego jako gronkowiec koagulazo-ujemny, o gęstości około 0,5 w skali McFarlanda posiać na podłoże Muellera-Hintona a następnie nałożyć krążek bibułowy nasycony 5 µg nowobiocyny (można wykonać identyfikację kilku szczepów równocześnie, posiewając badane szczepy promieniście i nakładając krążek centralnie na płytkę). 2. Płytki z nałożonymi krążkami należy preinkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, następnie hodowlę inkubować w temperaturze 35⁰C przez 18-24 godziny, w atmosferze tlenowej. 3. Odczytać wielkość strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z nowobiocyną. Staphylococcus epidermidis nowobiocyna 5 µg Staphylococcus saprophyticus
Wnioski:... Ćwiczenie 8. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości szczepu Staphylococcus spp. a. opisz krążki b. dokonaj pomiaru stref zahamowania wzrostu wokół krążków. Antybiotyk Symbol/dawka na krążku Strefa zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku
c. uzupełnij tabelkę o informacje dotyczące szczepów Staphylococcus spp. Antybiogram podstawowy Antybiogram rozszerzony Oznaczane mechanizmy oporności Ćwiczenie 9. Interpretacja wyniku oznaczania mechanizmu oporności MLS B. Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania oznaczenia przy temacie VI. Antybiotyki i chemioterapeutyki.
Odczyt i interpretacja wyników: W przypadku oporności na erytromycynę należy zwracać uwagę na spłaszczenie strefy zahamowania wzrostu dookoła krążka z klindamycyną od strony krążka z erytromycyną (kształt litery D) świadczące o indukcyjnym mechanizmie oporności MLS B. Interpretacja wyników: W przypadku stwierdzenia mechanizmu MLS B zarówno konstytutywnego, jak i indukcyjnego, ze względu na ryzyko niepowodzenia terapeutycznego, w leczeniu nie powinno się stosować: makrolidów, linkosamidów, streptogramin B............
Streptococcus, Enterococcus ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 10. Ocena wzrostu szczepów paciorkowców na: a. agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) typ hemolizy morfologia kolonii... rodzaj drobnoustroju:. typ hemolizy morfologia kolonii... rodzaj drobnoustroju:.. b. podłożu D-coccosel z eskuliną morfologia kolonii......
c. podłożach płynnych: 1. bulion cukrowy 2. podłoże bulionowe z 6,5% NaCl 3. podłoże bulionowe o ph=9,6 4. podłoże bulionowe z 40% żółcią Streptococcus pneumoniae 1 2 3 4 Streptococcus pyogenes 1 2 3 4 Enterococcus faecalis 1 2 3 4 Wnioski:...
Ćwiczenie 11. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama. Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie III. Budowa komórki bakteryjnej, metody barwienia preparat barwiony metodą Grama Opis preparatu: Ćwiczenie 12. Oznaczanie cech biochemicznych paciorkowców. a. wykonanie próby na katalazę Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie IV. Fizjologia bakterii. Szczep badany: obserwowane wyniki. Wnioski:... b. test wrażliwości na bacytracynę Test różnicuje paciorkowce β-hemolizujące. Szczególną wrażliwość na bacytracynę wykazują paciorkowce grupy A (Streptococcus pyogenes) Wykonanie ćwiczenia: Na podłoże Muellera-Hintona z dodatkiem 5% krwi baraniej, posiać jałową wymazówką zawiesinę hodowli płynnej badanego szczepu (o gęstości 0,5 w skali McFarlanda). Następnie na powierzchnię podłoża nałożyć krążek bibułowy nasączony 0,04u bacytracyny. Całość inkubować w temperaturze pokojowej 30 minut, a następnie w 35⁰C przez 18-24 godziny. Jako wynik wrażliwości uznaje się strefę zahamowania wzrostu wokół krążka z bacytracyną 15 mm.
bacytracyna 0,04u Wnioski:.. c. test wrażliwości na optochinę Optochina w bardzo małych stężeniach (mniej niż 5µg/ml) w sposób wybiórczy ma zdolność hamowania wzrostu Streptococcus pneumoniae, co różnicuje te dwoinki od innych paciorkowców α-hemolizujących. Wykonanie ćwiczenia: Na podłoże Muellera-Hintona z dodatkiem 5% krwi baraniej, posiać jałową wymazówką zawiesinę hodowli płynnej badanego szczepu (o gęstości 0,5 w skali McFarlanda). Następnie na powierzchnię podłoża nałożyć krążek bibułowy nasączony 5µg optochiny. Całość inkubować w temperaturze pokojowej 30 minut, a następnie w 35⁰C przez 18-24 godziny. Jako wynik dodatni uznaje się pojawienie się strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z optochiną bez względu na wielkość strefy. Przy strefie 14mm, wynik potwierdzić innymi metodami. optochina 5µg Wnioski:..
d. wykrywanie zdolności do redukcji TTC Zdolność redukowania chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego (TTC) umożliwia różnicowanie szczepów Enterococcus spp. Próbę tę wykonuje się na podłożu stałym lub płynnym z dodatkiem 0,01% TTC. Wykonanie ćwiczenia: Badane bakterie posiać na podłoże z dodatkiem 0,01% TTC i inkubować przez 24-48 godzin. Bakterie mające zdolność do redukcji TTC rosną na podłożu stałym w postaci kolonii ciemnoczerwonych, a na podłożu płynnym tworzą strąt zabarwiony na ten kolor....... Wnioski...... e. test CAMP Czynnik CAMP jest białkiem enzymatycznym działającym jako ko-cytolizyna na częściowo zhemolizowane przez β-hemolizynę gronkowcową krwinki baranie. Wynikiem tego działania jest tzw. synergistyczna hemoliza. Wykonanie ćwiczenia: 1. Na powierzchnię płytki agarowej z 5% krwią baranią posiać liniowo (przez środek szalki) szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923 wytwarzający hemolizę β. 2. Prostopadle do linii posiewu, w bliskiej odległości (ale nie dotykając) posiać badany szczep. 3. Płytkę inkubować w temperaturze 35⁰C przez 18-24 godzin. 4. Wytwarzanie czynnika CAMP objawia się pojawieniem strefy wzmożonej hemolizy w postaci przejaśnienia, często o kształcie jasnego grota strzały, w miejscu gdzie linia posiewu szczepu nachodzi na strefę hemolizy β gronkowca.
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Szczep badany Wnioski:... f. identyfikacja grup serologicznych paciorkowców β-hemolizujących Badanie można wykonać przy użyciu testu Pastorex STREP (BIORAD) Wykonanie ćwiczenia: 1. Przygotowanie enzymu do ekstrakcji: Do liofilizatu dodać 10 ml wody destylowanej i wymieszać do rozpuszczenia. Roztwór jest stabilny przez 4 miesiące w temperaturze +2 do +8⁰C. 2. Wykonanie testu: 0,3 mln enzymu do ekstrakcji umieścić w probówce i zawiesić w nim 5 do 10 kolonii świeżej hodowli paciorkowca β-hemolizującego. Inkubować 15-45 minut w temp. pokojowej, lub 10-30 minut w temp. 37⁰C Wymieszać wszystkie surowice lateksowe (A, B, C, D, F, G) i nanieść po 1 kropli każdej z nich na oddzielne pola załączonej do testu płytki. Używając jałowej pipety dodać po 1 kropli ekstraktu enzymatycznego badanego szczepu do wszystkich rozpipetowanych surowic na karcie. Wymieszać przy pomocy pałeczek (do każdej kropli oddzielna). Obracając ruchem kolistym płytkę odczytać wynik: reakcja pozytywna przejawia się widoczną aglutynacją występującą w czasie do 1 min. Badanie przeprowadzać zawsze wykonując kontrolę dodatnią.
A B C D F G Wnioski:.. Ćwiczenie 13. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości paciorkowców. Szczep. a. opisz krążki b. dokonaj pomiaru stref zahamowania wzrostu wokół krążków. Antybiotyk Symbol/dawka na krążku Strefa zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku
c. uzupełnij tabelkę o informacje dotyczące szczepów: Antybiogram podstawowy Streptococcus spp. Enterococcus spp. Antybiogram rozszerzony Oznaczane mechanizmy oporności