Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Łuczyński W. i inni: Zaburzenia Szewczyk ekspresji L. niektórych i inni Aktywność genów opioidowa w komórkach u dziewcząt T regulatorowych z nadczynnością u dzieci i niedoczynnością z cukrzycą tarczycy typu 1 Vol. 8/2009 Nr 1(26) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Zaburzenia ekspresji niektórych genów w komórkach T regulatorowych u dzieci z cukrzycą typu 1 Disturbances in Some Gene Expression in T Regulatory Cells in Children with Type 1 diabetes 1 Włodzimierz Łuczyński, 2 Natalia Wawrusiewicz-Kurylonek, 3 Anna Stasiak-Barmuta, 4 Remigiusz Urban, 5 Elżbieta Iłendo, 1 Mirosława Urban, 6 Justyna Kos, 7 Radosław Jaworowski, 2 Adam Krętowski 1 II Klinika Chorób Dzieci, 2 Klinika Endokrynologii, Diabetologii i Chorób Wewnętrznych, 3 Zakład Immunologii Klinicznej, 4 Klinika Perinatologii, 5 Pracownia Cytogenetyki Zakładu Pediatrycznej Diagnostyki Laboratoryjnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku, 6 NZOZ Stomatologia, 7 I Oddział Chirurgii Ogólnej Szpitala MSWiA w Białymstoku Adres do korespondencji: dr hab. med. Włodzimierz Łuczyński, II Klinika Chorób Dzieci Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku, Waszyngtona 17, 15-274 Białystok; e-mail: w.luczynski@wp.pl. Słowa kluczowe: cukrzyca, dzieci, immunoterapia, limfocyty T regulatorowe Key words: diabetes, children, immunotherapy, T regulatory cells STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp. U podłoża cukrzycy typu 1 (T1DM) leży wybiórcza destrukcja komórek β wysp trzustkowych produkujących insulinę. Nieznane są powody wzbudzenia tej reakcji skierowanej przeciwko własnym tkankom. Zachodzi pytanie, czy jedna z subpopulacji limfocytów, tj. komórki T regulatorowe (Tregs), odpowiedzialne za hamowanie nadmiernej odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko autoantygenom, bierze udział w patogenezie T1DM? Celem pracy była analiza odsetków limfocytów T regulatorowych krwi obwodowej oraz ekspresji wybranych genów istotnych dla ich funkcji u dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą typu 1 w porównaniu z grupą kontrolną. Materiał i metody. Do badania zakwalifikowano 20 dzieci z cukrzycą typu 1. Oceny komórek T regulatorowych dokonano za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciał: anty-cd3, anty-cd4, anty-cd25, anty- CD127. Dokonano izolacji komórek T regulatorowych o fenotypie CD4+CD25+CD127dim/- oraz oceny poziomu ekspresji wybranych genów dla czynników transkrypcyjnych, aktywacyjnych i wewnątrzkomórkowych, cytokin oraz ich receptorów na poziomie mrna techniką ilościowego real-time PCR. Wyniki. Zanotowano istotnie statystycznie niższy odsetek limfocytów CD4+CD25high w grupie dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą typu 1 w porównaniu z dziećmi z grupy odniesienia. Natomiast różnice w zakresie subpopulacji komórek CD4+CD127dim/- oraz CD4+CD25highCD127dim/- nie były istotne statystycznie. Obserwowano niższy, w tym w niektórych przypadkach istotny statystycznie, poziom mrna dla genów cząsteczek, receptorów i czynników transkrypcyjnych istotnych w funkcjonowaniu limfocytów T regulatorowych, tj. CTLA-4, IL-10RA, TGF-βR1 i TGF-βR2 oraz STAT-1 i SMAD3. Wniosek. Naszym zdaniem zmniejszoną ekspresję wybranych genów w komórkach T regulatorowych 17

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):17-26 należy interpretować jako jeden z wyznaczników upośledzenia funkcji tej subpopulacji komórek w grupie dzieci z cukrzycą typu 1. Uzyskane wyniki mogą zostać użyte do konstruowania przyszłych schematów immunoterapeutycznych. Endokrynol. Ped. 8/2009;1(26):17-26. Introduction. The pathogenesis of type 1 diabetes (T1DM) includes the self-destruction of pancreatic beta cells. The causes of this reaction against self-antigens are unclear. The question rises if one of the lymphocytes subpopulations, T regulatory cells (Tregs), responsible for inhibition of hyperreactive immunological response could play a role in the pathogenesis of T1DM? The aim of the present study was the assessment of T regulatory cells percentages and expression of chosen genes important for their function in children with diabetes comparing to healthy subjects. Material and methods. Twenty children with T1DM were enrolled into the study. The T regulatory cells were assessed with flow cytometry with the use of following monoclonal antibodies: anti-cd3, anti-cd4, anti-cd25, anti- CD127. The T regulatory cells (CD4+CD25+CD127low) were separated and checked for the expression of chosen genes with the use of real-time RT PCR technique. Results. We noted lower percentages of CD4+CD25high cells in the group of children with T1DM comparing to the control group. The differences concerning CD4+CD127low and CD4+CD25highCD127low cells were not statistically significant. We also observed lower expression of genes for molecules, receptors and transcription factors important for the function of T regulatory cells i.e.: CTLA-4, IL-10RA, TGF-βR1 and TGF-βR2, STAT-1 and SMAD3. Conclusion. In our opinion the diminished expression of some genes in T regulatory cells in patients with type 1 diabetes can be interpreted as one of the aspects of their dysfunction. These results could be used in the future immunotherapeutic trials. Pediatr. Endocrinol. 8/2009;1(26):17-26. Wykaz użytych skrótów: IL interleukina (interleukin), PCR reakcja łańcuchowej polimerazy (polimerase chain reaction), RNA kwas rybonukleinowy (ribonucleic acid), T1DM cukrzyca typu 1 (type 1 diabetes mellitus), TGF transformujący czynnik wzrostu (transforming growth factor), TNF-α czynnik martwicy nowotworów (tumor necrosis factor), Tregs limfocyty T regulatorowe (T regulatory cells) Wstęp Cukrzyca typu 1 (T1DM) jest jedną z najczęstszych chorób przewlekłych u dzieci. U jej podłoża leży wybiórcza destrukcja komórek β wysp trzustkowych produkujących insulinę [1]. Objawy choroby wynikają z niedoboru insuliny i zaburzeń metabolicznych związanych z hiperglikemią. Mechanizm patogenetyczny choroby jest związany z pojawieniem się autoimmunologicznej odpowiedzi o charakterze komórkowym i humoralnym, skierowanej przeciwko elementom wysp trzustkowych. Zniszczenie komórek β zachodzi na drodze apoptozy z udziałem cytokin prozapalnych, takich jak: IL-1β, TNF-α i IFN-γ, prowadzących do aktywacji szlaków czynników transkrypcyjnych NF-κB i STAT-1 [2]. Nieznane są powody wzbudzenia tej reakcji skierowanej przeciwko własnym tkankom, być może jedną ze składowych tej patologii jest defekt immunoregulacji. Wyjaśnienie fenomenu autodestrukcji mogłoby pomóc w leczeniu i zapobieganiu tej jednostce chorobowej [3]. W latach dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku intensywnie badano udział subpopulacji limfocytów Th 1 i Th 2 w patogenezie chorób o podłożu immunologicznym. Limfocyty produkujące cytokiny prozapalne, tj. profil Th 1 (IFN-γ, TNF-α), miałyby być odpowiedzialne za pojawienie się chorób z autoagresji, natomiast komórki typu Th 2, produkujące cytokiny przeciwzapalne (IL-4, IL-10, TGF-β), miałyby odgrywać rolę protekcyjną w chorobach autoimmunologicznych, a sprawczą w alergiach i immunosupresji. W efekcie dalszych badań uznano, że zarówno limfocyty Th 1, jak i Th 2 biorą udział w indukcji apoptozy komórek β wysp trzustkowych [4]. Ponieważ cukrzyca typu 1 jest jedną z modelowych chorób autoimmunologicznych, od wielu lat prowadzone są badania nad przyczyną utraty tolerancji w stosunku do własnych tkanek w tej grupie pacjentów. Jedna z subpopulacji limfocytów komórki T regulatorowe (Tregs) jest odpowiedzialna za hamowanie nadmiernej odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko własnym antygenom. Brak lub uszkodzenie funkcji limfocytów T regulatorowych prowadzi do rozwoju chorób autoimmunologicznych [5]. Defekt ilościowy i/lub jakościowy Tregs jest brany pod uwagę w nowoczesnym modelu patogenezy cukrzycy typu 1 [6]. Niektórzy badacze próbują nawet wykorzystać tę subpopulację komórek do zahamowania destrukcji wysp trzustkowych i uzyskania ustąpienia objawów choroby [7]. Mimo wielu prac poświęconych badaniom czynności limfocytów T regulatorowych opinie na ten temat są bardzo różnorodne i kontrowersyjne. Tregs prowadzą do supresji poprzez drogi zależne 18

Łuczyński W. i inni: Zaburzenia ekspresji niektórych genów w komórkach T regulatorowych u dzieci z cukrzycą typu 1 i niezależne od kontaktu komórka komórka. Poszukiwania istotnego markera Tregs zostały zwieńczone udowodnieniem kluczowej roli czynnika transkrypcyjnego FoxP3 w czynności komórek T regulatorowych za komórki regulatorowe będzie się zatem uważało: CD4 + /CD25 ++ /FoxP3 +. Jednak oznaczanie czynnika FoxP3 wiąże się z długotrwałą procedurą laboratoryjną (permeabilizacja) oraz brakiem możliwości użycia komórek do dalszych badań, np. funkcjonalnych. Ostatnio wykryto silną korelację pomiędzy wewnątrzkomórkową ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3 a powierzchniową niską ekspresją antygenu CD127 (IL-7R), można zatem przyjąć, że komórki T regulatorowe to CD4 + /CD25 ++ /CD127 low. Być może jedną z ważnych substancji produkowanych przez Tregs jest odkryta niedawno IL-35, która składa się z genu indukowanego przez wirus Epstein-Barr (EBI3) oraz podjednostki p35 IL-12. Według niektórych autorów jej działanie jest kluczowe dla supresyjnej funkcji limfocytów Tregs [8]. Wyniki ostatnich badań doświadczalnych zdają się również wskazywać na krytyczne znaczenie cząsteczki ICOS w czynności supresyjnej limfocytów T regulatorowych [9]. Funkcja Tregs może być również zaburzona w zakresie odpowiedzi wewnątrzkomórkowej na stymulację IL-10, dotyczy to m.in. ekspresji SOCS3, STAT1 i STAT3 [10]. Podobnie czynniki transkrypcyjne Smad3 i NFAT również są istotne dla funkcjonowania FoxP3 [11]. Badania dużej liczby genów z użyciem metod real-time PCR i mikromacierzy w komórkach T regulatorowych były przeprowadzone tylko w jednym znanym eksperymencie opartym na izolacji komórek CD4 + CD25 + od kilku grup etnicznych mieszkańców Afryki różniących się wrażliwością na zachorowanie na malarię [12]. W tym doświadczeniu wykazano znaczenie genów zarówno charakterystycznych dla funkcji supresyjnej (FoxP3, CTLA- 4), genów związanych z profilem limfocytów Th 1 (IL-18, IFN-γ, TBX21), jak i Th 2 (IL-4, GATA3) w czynności limfocytów T regulatorowych. Hipoteza, że w T1DM dochodzi do zaburzeń ilościowych i jakościowych komórek T regulatorowych, byłaby bardzo atrakcyjna dla przyszłych modeli interwencji immunoterapeutycznej. Zatem celem niniejszej pracy była analiza odsetków limfocytów T regulatorowych oraz ekspresji wybranych genów istotnych dla ich funkcji u dzieci z cukrzycą typu 1. Z naszych wstępnych badań przeprowadzonych u dzieci z T1DM za pomocą cytometrii przepływowej oraz łańcuchowej reakcji polimerazy wynika, iż odsetki limfocytów T regulatorowych są podobne do tych obserwowanych w grupie odniesienia, natomiast w cukrzycy dochodzi do zaburzeń w ekspresji elementów służących do przekazywania wewnątrzkomórkowego sygnału, co może wskazywać na upośledzenie funkcji tych komórek w badanej grupie pacjentów. Pacjenci Do badania zakwalifikowano 20 dzieci z cukrzycą typu 1 (10 chłopców i 10 dziewcząt w średnim wieku 10,5 lat). Rozpoznanie cukrzycy oparto na kryteriach opracowanych przez Polskie Towarzystwo Diabetologiczne (2007). Średnie stężenie hemoglobiny glikowanej wynosiło 10,1%, a średnie zapotrzebowanie na insulinę w momencie pobierania krwi do badania 0,8 j/kg/dobę. Krew obwodową w ilości 5 cm 3 pobierano po uzyskaniu równowagi metabolicznej w dniach 14-21 od rozpoznania choroby. Grupę odniesienia stanowiło 20 dzieci bez cech infekcji oraz choroby przewlekłej, a w szczególności: chorób nowotworowych, autoimmunologicznych, zapalnych, z negatywnym wywiadem rodzinnym w kierunku cukrzycy typu 1. Na przeprowadzenie doświadczeń uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. W każdym przypadku pisemną zgodę na pobranie krwi wyrażali prawni opiekunowie dziecka oraz pacjent (wiek 16 lat). Materiał był pobierany wyłącznie przy okazji innych badań laboratoryjnych. Grupy badana i odniesienia nie różniły się statystycznie wiekiem oraz płcią (p > 0,05). Metody Cytometria przepływowa Oceny komórek T regulatorowych dokonano za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem następujących przeciwciał monoklonalnych: anty-cd3 (skonjugowanego z PECy5), anty-cd4 (PECy7), anty-cd25 (FITC), anty-cd127 (PE) oraz izotypowych kontroli. Odczynniki do powyższych oznaczeń zostały zakupione w firmie Beckman Coulter (USA). Oceniano odsetki następujących subpopulacji limfocytów T: CD4 +, CD4 + CD25 high, CD4 + CD127 dim/-, CD4 + CD25 high CD127 dim/-. Badania wykonywano na pięciokolorowym cytometrze Beckman Cytomics FC 500 MPL z użyciem oprogramowania CXP wersja 2.0. W analizie brano pod uwagę miniumum 100 000 zdarzeń. W celu wyliczenia wartości bezwględnych badanych parametrów 19

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):17-26 dodatkowo wykonywano morfologię krwi z rozmazem. Z powodu dużej ilości uzyskanych danych wyniki przedstawiono jako średnie. Separacja komórek T regulatorowych Izolacji komórek T regulatorowych o fenotypie CD4 + CD25 + CD127 dim/- dokonano z użyciem odczynników firmy Miltenyi Biotec zgodnie z instrukcją produdenta. W skrócie: w pierwszej kolejności z krwi obwodowej separowano komórki jednojądrzaste (Histopaque, Sigma), następnie usunięto komórki CD4 - oraz CD127 high poprzez deplecję na kolumnach MACS, zaś w ostatnim etapie pozytywnie wyizolowano komórki CD4 + CD25 + CD127 dim/-. W celu poprawienia czystości separacji ostatni etap reakcji wykonywano za każdym razem dwukrotnie na nowych kolumnach. Łańcuchowa reakcja polimerazy czasu rzeczywistego (real-time PCR) Ocena ekspresji wybranych genów dla czynników transkrypcyjnych, aktywacyjnych i wewnątrz- Tabela I. Nazwy, symbole, numery identyfikacyjne oraz obecność genów ocenianych w komórkach T regulatorowych Table II. Names, symbols, Ids and presence/absence of genes in T regulatory cells Symbol genu /Gene symbol Nazwa genu/gene name Numer identyfikacyjny Assay ID Obecność w badanych próbkach /Presence in examined probes FoxP3 forkhead box P3 NM_001114377 + CD25 interleukin 2 receptor, alpha (IL2RA) NM_000417 + GITR TNF receptor superfamily, member 18 NM_004195 + CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 NM_001037631 + ICOS inducible T-cell co-stimulator NM_012092 + SOCS2 suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2) NM_003877 + SOCS3 suppressor of cytokine signaling 3 NM_003955 + STAT1 signal transducer and activator of transcription 1 NM_007315 + STAT3 signal transducer and activator of transcription 3 NM_003150 + SMAD3 SMAD family member 3 NM_005902 + IL-8RA/CXCR1 interleukin 8 receptor, alpha NM_000634 + IL-10RA interleukin 10 receptor, alpha NM_001558 + IL-17A interleukin 17A (IL17A) NM_002190 - CCL22 chemokine (C-C motif) ligand 22 NM_002990 - T-box 21 IL-21 T-box 21 (TBX21) interleukin 21 NM_013351 NM_021803 IL-12A interleukin 12A NM_000882 + IL-12B interleukin 12B NM_002187 - IL-23A interleukin 23 alpha subunit p19 NM_016584 + IL-27 interleukin 27 NM_145659 + IL-35 (EBI3) Epstein-Barr virus induced gene 3 NM_005755 - TGF-BR1 transforming growth factor, beta receptor I NM_004612 + TGF-BR2 transforming growth factor, beta receptor II NM_001024847 + + - 20

Łuczyński W. i inni: Zaburzenia ekspresji niektórych genów w komórkach T regulatorowych u dzieci z cukrzycą typu 1 komórkowych, cytokin oraz ich receptorów w separowanych limfocytach T regulatorowych została przeprowadzona na poziomie mrna (transkryptów) techniką ilościowego Real-Time PCR na systemie Chromo4 (BioRad). Listę ocenianych genów przedstawiono w tabeli I. Izolację całkowitego RNA z badanych komórek przeprowadzono przy użyciu gotowego zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen, Niemcy) według protokołu producenta. Stężenie otrzymanych preparatów RNA oceniono spektrofotometrycznie (QuantGen Biopharmacia). Stopień czystości preparatu od białka określono na podstawie stosunku wartości adsorbcji przy długości fal 260/280 nm. Otrzymane preparaty RNA oceniono także elektroforetycznie w 1,5% żelu agarozowym w celu sprawdzenia integralności wyizolowanego RNA. Przed właściwą reakcją Real-Time PCR przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji (ang. Reverse Transcription, RT) w celu otrzymania stabilnego kwasu nukleinowego cdna. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono wykorzystując dostępny komercyjnie zestaw SuperScript TM First-Strand Synthesis System for RT- PCR. Preparaty RNA przed reakcją RT rozcieńczono wodą w ten sposób, aby uzyskać 1,0 µg/µl RNA w roztworze. Reakcję RT-PCR prowadzono przy użyciu termocyklera PTC 200 (MJ Research, USA) zgodnie z procedurą zestawu. Otrzymane roztwory cdna przechowywano w temp. -20 C. W celu oceny ilościowej zawartości określonych transkryptów genów użyto systemu detekcji fluorescencji real-time Chromo4 TM Four-Color Real-Time Fluorescence Detection (BioRad, USA). Mierzona fluorescencja pochodziła z barwnika fluorescencyjnego SYBR Green I, będącego składnikiem QuantiTect TM SYBR Green PCR Master Mix. Do badania zastosowano gotowe startery firmy Qiagen, posiadające jednakową temperaturę przyłączania (annealing). Sekwencje tych primerów zostały objęte tajemnicą handlową formy. W celu normalizacji badań wykorzystano gen referencyjny GAPDH. Skład mieszaniny reakcyjnej: 5 µl cdna, uzyskanego po reakcji RT, 10 µl gotowego QuantiTect TM SYBR Green PCR Master Mix zawierającego polimerazę DNA HotStart-Taq, bufor reakcyjny, mieszaninę dntp, barwnik fluorescencyjny SYBR Green I, 2,5 mm MgCl 2 oraz 2 µl startera odpowiedniego genu. Warunki amplifikacji: wstępna aktywacja polimerazy HotStart-Taq: 95 0 C 15 min. denaturacja nici cdna: 95 0 C 30s, wiązanie starterów: 55 0 C 15s, synteza nici DNA : 72 0 C 30s, czytanie płytki, powtórzenie cyklu, denaturacja synteza nici DNA: 39x, krzywa topnienia odczytywanie temperatury denaturacji produktów co 2 0 C i 2s, zakończenie reakcji. Specyficzność produktów amplifikacji poszczególnych genów oceniano na podstawie wykreślonej przez aparat krzywej dysocjacji i wyznaczonych temperatur mięknięcia tych produktów (Tm). Poziom ekspresji badanego genu określono na podstawie krzywej standardowej sporządzonej z serii rozcieńczeń cdna pochodzącego od zdrowych pacjentów. Wyniki względnej ekspresji otrzymano w postaci wartości C T - treshold cycle cyklu reakcji PCR, w którym nastąpił maksymalny wzrost fluorescencji, wyznaczonym w punkcie przecięcia z linią threshold, której poziom wyznaczany jest za pomocą krzywej wzorcowej [13]. Dla każdej próbki reakcję Real-Time PCR dla każdego gen, wykonano w dwóch powtórzeniach. Analiza statystyczna Uzyskane dane wprowadzano do bazy danych w programie Microsoft Access 2007, następnie po obróbce przenoszono do programu Statistica 8.0 for Windows. Wobec braku cech rozkładu normalnego wyniki analizowano za pomocą testów nieparametrycznych. Porównania ilości mrna dla ocenianych genów w grupach badanej i kontrolnej dokonano za pomocą testu U Manna-Whitneya. Wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie. Rysunki wykonano za pomocą programu Graph- Pad 5.0. Wyniki Podobne odsetki limfocytów T regulatorowych u dzieci z cukrzycą i zdrowych Liczba krwinek białych oraz odsetek i całkowita liczba limfocytów, a także subpopulacji CD4 + nie różniły się w grupach badanej i kontrolnej (średnie wartości odpowiednio: WBC 6,07 vs 6,08 G/l, odsetek limfocytów 36,1 vs 39,0, liczba limfocytów: 2,3 vs 2,09 G/l, odsetek CD4 + : 38,3% vs 35,9%; p > 0,05). Z tego powodu dalszej analizie poddano odsetki limfocytów uznawanych w piśmiennictwie za komórki T regulatorowe. Zanotowano istotnie statystycznie niższy odsetek limfocytów CD4 + C- D25 high w grupie dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą typu 1 w porównaniu z dziećmi z grupy odniesienia (2,31 vs 4,05%, p = 0,03). Natomiast różnice w zakresie subpopulacji komórek CD4 + CD127 dim/- oraz CD4 + CD25 high CD127 dim/- nie były istotne statystycznie (15,32 vs 19,49%; 0,647 vs 0,693%, p > 0,05). 21

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):17-26 Tabela II. Wyniki ilościowej oceny ekspresji mrna w komórkach T regulatorowych za pomocą metody real-time RT PCR dla badanych genów. Różnice istotne statycznie zostały wytłuszczone Table II. The results of mrna expression with the real-time RT PCR method for assessed genes. The diferences statistically significant are bolded Symbol genu Gene symbol Grupa badana dzieci z cukrzycą typu 1 (średnia 2 - Ct ) Examined group (mean 2 - Ct ) Grupa odniesienia (średnia 2 - Ct ) Control group (mean 2 - Ct ) Analiza statystyczna Statistics FoxP3 0,135 0,137 ns CD25 0,01 0,06 ns GITR 0,128 0,115 ns CTLA-4 0,177 0,389 p < 0,05 ICOS 0,0004 0,0005 ns SOCS2 0,002 0,002 ns SOCS3 0,089 0,101 ns STAT1 0,07 0,302 p < 0,05 STAT3 0,01 0,08 ns IL-8RA/CXCR1 0,039 0,089 ns IL-10RA 0,308 0,955 p < 0,05 T-box 21 0,01 0,009 ns IL-12A 0,001 0,006 ns IL-23A 0,142 0,255 ns IL-27 0,001 0,004 ns TGF-BR1 0,01 0,05 p < 0,05 TGF-BR2 0,07 0,262 p < 0,01 SMAD3 0,03 0,08 p < 0,05 Zaburzenia ekspresji genów w komórkach T regulatorowych u dzieci z cukrzycą typu 1 Przykładową krzywą standardową oraz amplifikację wybranego genu pokazano na rycinach 1a i 1b. Wyniki uzyskane z real-time RT PCR zostały przedstawione w tabeli II. Spośród 23 ocenianych trankryptów wykryto obecność 18 w wyseparowanych komórkach CD4 + CD25 + CD127 dim/-. Poziom ekspresji mrna dla czynnika transkrypcyjnego FoxP3 był porównywalny w obu grupach (p > 0,05). Nie zanotowano wyższej ekspresji mrna w izolatach grupy badanej w porównaniu z grupą odniesienia dla żadnego z badanych genów. Obserwowano natomiast niższy, w tym w niektórych przypadkach istotny statystycznie, poziom mrna dla genów cząsteczek, receptorów i czynników transkrypcyjnych istotnych dla funkcjonowania limfocytów T regulatorowych, tj. CTLA-4, IL-10RA, TGF-βR1 i TGF-βR2 oraz STAT-1 i SMAD3 (p < 0,05). Porównanie ilości mrna dla wybranych genów pokazano na rycinie 2. Dyskusja W grupie dzieci z nowo rozpoznaną cukrzycą typu 1 ocenialiśmy odsetek komórek T regulatorowych oraz ekspresję wybranych genów kluczowych dla czynności Tregs. Wykazaliśmy brak istotnych różnic w zakresie odsetka limfocytów Tregs (poza subpopulacją CD4 + CD25 high ) pomiędzy 22

Łuczyński W. i inni: Zaburzenia ekspresji niektórych genów w komórkach T regulatorowych u dzieci z cukrzycą typu 1 Ryc. 1a. Krzywa standardowa dla genu GAPDH wyznaczona na podstawie amplifikacji uzyskanej z serii rozcieńczeń cdna pochodzącego od zdrowego pacjenta Fig. 1a. Standard curve for GAPDH gene amplification. The curve is based on values obtained for decreasing serial dilutions of the cdna from the control patient Ryc. 1b. Wykresy amplifikacji badanych prób dla genu CTLA-4 przy użyciu systemu detekcji fluorescencji Real- Time PCR Chromo4. Oś odciętych: ilość cykli reakcji amplifikacji, oś rzędnych: intensywność fluorescencji produktów amplifikacji Fig. 1b. The graph shows the amplification profiles of CTLA- 4 mrna present in clinical samples. X axis number of amplification cycles, Y axis intensity of fluorescence in arbitrary units grupą badaną a grupą odniesienia. Natomiast u dzieci z T1DM obserwowaliśmy istotne zaburzenia w ekspresji genów, m.in. CTLA-4, receptorów dla IL-10 i TGF-β oraz czynników transkrypcyjnych STAT-1 i SMAD3 w porównaniu z dziećmi zdrowymi. Od czasu odkrycia Tregs wykonano wiele badań nad ich znaczeniem w cukrzycy typu 1, jednak ich wyniki są kontrowersyjne. Większość autorów nie obserwowała różnic w zakresie liczby i odsetka limfocytów T regulatorowych pomiędzy pacjentami z T1DM a grupą kontrolną [14, 15]. Wyniki te są zgodne z uzyskanymi w naszym badaniu. Niższy odsetek subpopulacji CD4 + CD25 high wykazany w naszej obserwacji jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami innych badaczy z czasu, gdy nie odkryto jeszcze znaczenia receptora dla IL-7 (CD127) w określaniu fenotypu Tregs [16]. W znanym raporcie odnotowano wyższe odsetki limfocytów T regulatorowych u dzieci z T1DM, autorzy tego doniesienia interpretują uzyskane wyniki jako aktywację odpowiedzi regulatorowej w czasie zachorowania [17]. Podobnie aktywację limfocytów T, tj. wzrost odsetka limfocytów T z koekspresją cząsteczek HLA-DR we wczesnym okresie T1DM u dzieci obserwowała Kowalska i wsp. [18]. Jednak dla wykazania roli limfocytów T regulatorowych w patogenezie cukrzycy typu 1 istotne jest udowodnienie zaburzeń czynności Tregs, w tym efektów supresyjnych. Eksperymenty obrazujące działanie supresyjne komórek CD4 + CD25 + CD127 dim/- prawdopodobnie nie są możliwe do przeprowadzenia z powodu bardzo małej ilości tych komórek dostępnych we krwi obwodowej (w naszym badaniu ok. 0,6-0,7% limfocytów). Dotychczasowe doświadczenia były przeprowadzane z użyciem komórek CD4 + CD25 +, co w sposób istotny ogranicza ich interpretację, a przede wszystkim prowadzi do uzyskania różnorodnych wyników. Badacze próbują pośrednio ocenić funkcję Tregs, np. na podstawie ekspresji wybranych cytokin, cząsteczek lub przekaźników wewnątrzkomórkowych. Czynniki transkrypcyjne oraz cząsteczki: FoxP3, GITR, CTLA-4 oraz CD62L stanowią markery supresyjnej funkcji komórek T regulatorowych, w tym tych używanych do protekcji wysp trzustkowych. W naszym doświadczeniu ekspresja elementów kluczowych dla funkcjonowania Tregs, tj. FoxP3, GITR i ICOS, nie była zmniejszona. Natomiast wyniki dotyczące poziomów mrna dla wybranych genów w komórkach T regulatorowych wykazały zmniejszoną ekspresję CTLA-4 u dzieci 23

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):17-26 Ryc. 2. Porównanie poziomów mrna dla wybranych genów ocenianych metodą ilościową real-time RT-PCR w wyseparowanych komórkach T regulatorowych. Ilość mrna dla FoxP3 w grupach badanej i odniesienia nie różnią się. Poziom ekspresji mrna dla CTLA-4, STAT-1 oraz receptora 1 dla TGF-β1 jest niższy u dzieci z cukrzycą w porównaniu do dzieci zdrowych Fig. 2. Comparison of the mrna levels for chosen genes assessed with real-time RT PCR in separated T regulatory cells. The mrna levels for FoxP3 in the examined and control group do not differ. The mrna levels for CTLA-4, STAT-1 and TGF-β1 receptor-1 are lower in children with type 1 diabetes comparing to the healthy children z T1DM w porównaniu z grupą odniesienia. Cząsteczka CTLA-4 stanowi istotny element negatywnej regulacji w procesie aktywacji limfocytów T. Naszym zdaniem zmniejszoną ekspresję jej genu należy interpretować jako jeden z wyznaczników upośledzenia funkcji tej subpopulacji komórek. Odmienne wyniki odnotowali Lindley i wsp. [19]. Autorzy ci stwierdzili wysokie odsetki komórek Tregs z koekspresją wewnątrzkomórkową CTLA-4 u pacjentów z cukrzycą. Pozostałe wyniki badania tych autorów wyraźnie wskazują na defekt supresyjnej roli Tregs w tej grupie pacjentów. W badanej przez nas grupie pacjentów obserwowaliśmy niższą ekspresję mrna receptorów dla TGF-β1 w komórkach Tregs w porównaniu z grupą odniesienia. Rola TGF-β w T1DM jest bezsporna. Jeden z najnowszych schematów leczniczych cukrzycy typu 1 polega na podawaniu przeciwciał przeciwko limfocytom T (anty-cd3). Terapia ta zatrzymuje destrukcję komórek wysp trzustkowych, prowadząc do tolerancji immunologicznej i ustąpienia objawów niedoboru insuliny. W jednym z badań w trakcie podaży anty-cd3 stężenie TGF-β wzrastało, co według autorów świadczy o powrocie stanu immunotolerancji [20]. Jednak w tym doświadczeniu limfocyty Tregs nie były odpowiedzialne za zahamowanie rozwoju cukrzycy. W innym eksperymencie komórki Tregs posiadające na swojej powierzchni elementy wiążące TGF-β wykazywały efekt protekcyjny w stosunku do zachorowania na cukrzycę w porównaniu z brakiem tego efektu komórek bez ekspresji TGF-β [21]. Białka kodowane przez geny STAT (ang. signal transducers and activators of transcription) należą do grupy elementów biorących udział w przekazywaniu informacji z powierzchni komórek do jądra oraz w aktywacji transkrypcji innych genów. Aktywowane są w odpowiedzi na szereg cytokin, czynników wzrostu i hormonów. Dotychczas ustalono, iż pełnią one ważne funkcje regulacyjne w wielu procesach fizjopatologicznych, począwszy od odpowiedzi układu immunologicznego do regulacji 24

Łuczyński W. i inni: Zaburzenia ekspresji niektórych genów w komórkach T regulatorowych u dzieci z cukrzycą typu 1 cyklu komórkowego i transformacji nowotworowej komórek [22]. Podnoszona jest ich rola w czynności limfocytów T regulatorowych. Według najnowszych danych ekspresja STAT-1 w obecności IL-27 jest warunkiem aktywacji czynnika transkrypcyjnego FoxP3 [23]. Natomiast STAT-3 wydaje się odgrywać przeciwną rolę [24]. Podobnie czynniki transkrypcyjne SMAD3 oraz NFAT są niezbędne do aktywacji FoxpP3 [11]. SMAD3 ulegał aktywacji w komórkach wysp trzustki transfekowanych TGF-β. Komórki te produkowały duże ilości TGF-β, indukowały pojawienie się komórek T regulatorowych, jednak nie zapobiegały insulitis i zachorowaniu na cukrzycę typu 1 u myszy NOD [25]. Obserwowana przez nas zmniejszona ekspresja STAT-1 oraz SMAD3 w komórkach Tregs dzieci z cukrzycą w porównaniu z dziećmi zdrowymi może być kolejnym dowodem na upośledzenie ich funkcji. Interesujące badania dotyczące innej choroby o podłożu autoimmunologicznym, jaką jest stwardnienie rozsiane (SM), przeprowadzili Martinez-Forero i wsp. [10]. Autorzy tego cyklu doświadczeń wykazali istotne zaburzenia funkcji limfocytów T regulatorowych, w tym dysregulację przekazywania sygnału dla IL-10 w tej jednostce chorobowej. Jest to zgodne z naszymi wynikami, które wskazują na zmniejszoną ekspresję receptora dla tej immunosupresyjnej cytokiny w komórkach Tregs dzieci z cukrzycą. W naszym eksperymencie nie zanotowaliśmy różnic w ekspresji mrna dla cząsteczek SOCS2 i SOCS3 w limfocytach Tregs w grupach badanej i kontrolnej. W przypadku cząsteczki SOCS3 jej nadmierna ekspresja upośledza funkcję limfocytów T regulatorowych, zatem zmniejszenie jej produkcji byłoby pożądanym efektem w cukrzycy typu 1 [26]. Podsumowanie U dzieci chorych na cukrzycę obserwowaliśmy zbliżone do dzieci zdrowych odsetki limfocytów T regulatorowych. Stwierdzone natomiast zaburzenia ekspresji genów dla niektórych elementów wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału w limfocytach T regulatorowych mogą sugerować, iż dalsze badania nad ich rolą okażą się przydatne nie tylko w wyjaśnieniu patogenezy cukrzycy, ale staną się elementem przyszłej immunoterapii. Wskazują na to zachęcające wyniki pierwszych raportów z terapii eksperymentalnych [27]. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Achenbach P., Bonifacio E., Koczwara K. et al.: Natural history of type 1 diabetes. Diabetes, 2005:54 (suppl 2), 25-31. [2] Cnop M., Welsh N., Jonas J.C. et al.: Mechanisms of pancreatic beta-cell death in type 1 and type 2 diabetes. Diabetes, 2005:54 (suppl 2), 97-107. [3] Szewczyk L.: Postępy w diabetologii pediatrycznej. Endokrynol. Pediatr., 2004:3 (suppl 2), 5. [4] Azar S.T., Tamim J., Beyhum H.N. et al.: Type 1 (insulin-dependent) diabetes is a Th1- and Th2-mediated autoimmune disease. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 1999:6, 306-310. [5] Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M. et al.: Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J. Immunol., 1995: 155, 1151-1164. [6] Brusko T., Atkinson M.: Treg in type 1 diabetes. Cell Biochem. Biophys., 2007:48, 165-175. [7] Jaeckel E., Mpofu N., Saal N. et al.: Role of regulatory T cells for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Horm. Metab. Res., 2008: 40, 126-136. [8] Collison L.W., Workman C.J., Kuo T.T. et al.: The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature, 2007:450, 566-569. [9] Burmeister Y., Lischke T., Dahler A.C. et al.: ICOS controls the pool size of effector-memory and regulatory T cells. J. Immunol., 2008:180, 774-782. [10] Martinez-Forero I., Garcia-Munoz R., Martinez-Pasamar S. et al.: IL-10 suppressor activity and ex vivo Tr1 cell function are impaired in multiple sclerosis. Eur. J. Immunol., 2008:38, 576-586. [11] Tone Y., Furuuchi K., Kojima Y. et al.: Smad3 and NFAT cooperate to induce Foxp3 expression through its enhancer. Nat. Immunol., 2008:9, 121-122. [12] Torcia M.G., Santarlasci V., Cosmi L. et al.: Functional deficit of T regulatory cells in Fulani, an ethnic group with low susceptibility to Plasmodium falciparum malaria. PNAS, 2008:105, 646-651. [13] Livak K.J., Schmittgen T.D.: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ddCT method. Methods, 2001:25, 402-408. [14] Brusko T., Wasserfall C., McGrail K. et al.: No alterations in the frequency of FoxP3+ regulatory T-cells in type 1 diabetes. Diabetes, 2007:56, 604-612. 25

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;1(26):17-26 [15] Liu W., Putnam A.L., Xu-Yu Z. et al.: CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J. Exp. Med., 2006:203, 1701-1711. [16] Kukreja A., Cost G., Marker J. et al.: Multiple immuno-regulatory defects in type-1 diabetes. J. Clin. Invest., 2002:109, 131-140. [17] Oling V., Marttila J., Knip M. et al.: Circulating CD4+CD25high regulatory T cells and natural killer T cells in children with newly diagnosed type 1 diabetes or with diabetes-associated autoantibodies. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2007:1107, 363-372. [18] Kowalska H., Kądziela K., Wąsik M. et al.: Ocena wybranych subpopulacji limfocytów B i T u dzieci we wczesnym okresie cukrzycy insulinozależnej. Endokrynol. Diabetol. Przemiany Materiii Wieku Rozwoj., 2001:7, 7-10. [19] Lindley S., Dayan C.M., Bishop A. et al.: Defective suppressor function in CD4(+)CD25(+) T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes, 2005:54, 92-99. [20] Chen G., Han G., Wang J. et al.: Essential roles of TGF-beta in anti-cd3 antibody therapy: reversal of diabetes in non-obese diabetic mice independent of Foxp3+CD4+ regulatory T cells. J. Leukoc. Biol., 2008:83, 280-287. [21] Gregg R.K., Jain R., Schoenleber S.J. et al.: A sudden decline in active membrane-bound TGF-beta impairs both T regulatory cell function and protection against autoimmune diabetes. J. Immunol., 2004:173, 7308-7316. [22] Baśkiewicz-Masiuk M., Machaliński B.: Rola białek STAT5 w schorzeniach układu krwiotwórczego. Post. Biol. Komórki, 2003:30, 9-30. [23] Ouaked N., Mantel P.Y., Bassin C. et al.: Regulation of the foxp3 gene by the Th1 cytokines: the role of IL-27-induced STAT1. J. Immunol., 2009:182, 1041-1049. [24] Huber M., Steinwald V., Guralnik A. et al.: IL-27 inhibits the development of regulatory T cells via STAT3. Int. Immunol., 2008:20, 223-234. [25] Park L., Lee E., Lee S. et al.: TGFbeta plasmid construction and delivery for the prevention of type 1 diabetes. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2008:1150, 177-182. [26] Pillemer B.B., Xu H., Oriss T.B. et al.: Deficient SOCS3 expression in CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells and SOCS3-mediated suppression of Treg function. Eur. J. Immunol., 2007:37, 2082-2089. [27] Jaeckel E., von Boehmer H., Manns M.P.: Antigen-specific FoxP3-transduced T-cells can control established type 1 diabetes. Diabetes, 2005:54, 306-310. 26