Ćwiczenie 11 METODA RT-PCR Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych: bromek etydyny T+ EDTA Xi etanol, 96% F kwas octowy, 96% C -merkaptoetanol N, T Tris Xi UWAGI WSTĘPNE Praca z kwasami nukleinowymi (np. izolacja, reakcja PCR) wymaga zachowania szczególnej czystości, ponieważ kwasy nukleinowe łatwo ulegają degradacji. Dotyczy to głównie RNA, ze względu na powszechną obecność rybonukleaz (RNaz) enzymów katalizujących niespecyficzne rozrywanie łańcuchów rybonukleinowych. Poniżej zamieszczono kilka uwag istotnych podczas eksperymentów, w których używamy kwasów nukleinowych. Wszystkie czynności wykonujemy w czystych rękawiczkach, które przemywamy 70% etanolem. Wszystkie końcówki, probówki i szkło muszą być autoklawowanie. Izolację kwasów nukleinowych oraz przygotowanie reakcji PCR przeprowadzamy w komorze laminarnej wysterylizowanym lampą UV. Miejsce do izolacji i aparat do rozdziału elektroforetycznego przemywamy 70% etanolem. Bufory z zestawu do preparatyki kwasów nukleinowych, składniki zestawu do reakcji PCR, polimerazy pobieramy używając końcówek z filtrem. PBS sterylizujemy przez filtrowanie (filtr o średnicy porów 0.2 m); bufory z gotowych zestawów do izolacji i reakcji PCR są sterylne. Metoda łańcuchowej reakcji polimerazy poprzedzona odwrotną transkrypcją, RT-PCR (ang. reverse transcription polymerase chain reaction) służy m.in. do analizy ekspresji badanego genu. Bezpośrednim i najbardziej miarodajnym sposobem sprawdzenia, czy gen ulega ekspresji w danej komórce jest wykrycie obecności transkryptu danego genu cząsteczek mrna. Technika RT-PCR składa się z dwóch etapów: - reakcji odwrotnej transkrypcji, w której mrna przepisywane jest na cdna, - amplifikacji (wielokrotnego powielenia) cząsteczek cdna metodą klasycznej reakcji PCR. Ostatnim etapem badania ekspresji genu jest elektroforeza produktów (amplifikatów) reakcji PCR wykonywana najczęściej w żelu agarozowym. 1. PRZYGOTOWANIE RNA 1.1 IZOLACJA RNA (ZESTAW FIRMY QIAGEN) Materiał do izolacji kwasów nukleinowych stanowią skrawki tkankowe, całe narządy pobierane od zwierząt, komórki ustalonych linii komórkowych lub linii pierwotnych hodowane in vitro w naczyniach hodowlanych (szalkach Petriego, płytkach wielodołkowych lub butelkach). Zamieszczona poniżej procedura w punktach 1 4 odnosi się do komórek adherentnych hodowanych in vitro. 1. Po osiągnięciu 70 90% zarośnięcia naczynia hodowlanego (szalki Petriego o średnicy 6 cm) komórki przemyć zimną pożywką nie zawierającą surowicy a następnie zimnym sterylnym PBS*. 2. Po dokładnym odciągnięciu roztworu PBS komórki zebrać sterylnym skrobakiem do probówki typu Eppendorf o poj. 1.5 ml w 350 l buforu lizującego RLT zawierającego -merkaptoetanol. Tak zebrane komórki można przechowywać w temp. -70 C przez okres 1 miesiąca. 3. Do ekstraktów komórkowych dodać 350 l 70% etanolu, zamieszać pipetą. 4. 700 l mieszaniny nałożyć na minikolumnę do izolacji RNA. Po zwirowaniu (8000 RPM**, 15 s, RT***) kolumnę przełożyć do nowej probówki wirowniczej o poj. 2 ml. 5. Dodać 700 l buforu RW1, zwirować (8000 RPM, 15 s, RT). 6. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500 l buforu RPE, zwirować (8000 RPM, 15 s, RT). 7. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500 l buforu RPE, zwirować (8000 RPM, 2 min, RT). 8. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i zwirować w celu wysuszenia membrany (15000 RPM, 1 min, RT). 9. Kolumnę przenieść do probówki wirowniczej o poj. 1.5 ml i dodać na membranę 100 l wody wolnej od RNaz, zwirować (8000 RPM, 1 min, RT). Czynność powtórzyć nakładając na kolumnę eluat otrzymany z pierwszego wirowania. *PBS (ang. Phosphate Buffered Saline) zbuforowany roztwór soli fizjologicznej **RPM (ang. Revolutions Per Minute) liczba obrotów na minutę ***RT (ang. Room Temperature) temperatura pokojowa 1
1.2. OKREŚLENIE STĘŻENIA ORAZ CZYSTOŚCI RNA METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ Kwasy nukleinowe selektywnie pochłaniają światło ultrafioletowe (UV) wykazując maksimum absorbancji przy długości fali 260 nm. Zjawisko to znajduje zastosowanie w oznaczaniu stężenia kwasów nukleinowych, np. w preparatach kwasów nukleinowych po izolacji. Ekstrakty kwasów nukleinowych mogą być zanieczyszczone np. białkami lub odczynnikami używanymi do izolacji. W celu określenia czystości przygotowanego preparatu mierzy się OD również przy dł. fali 280 nm, stanowiącą maksimum absorbancji dla białek. Preparat uznaje się za czysty wówczas, kiedy stosunek wartości absorbancji A260/A280 dla RNA jest równy lub zbliżony do 2.0. W przypadku, gdy stosunek wartości A260/A280 jest niższy, roztwór RNA jest zanieczyszczony białkami. Wykonanie: W spektrofotometrze do mikroobjętości (Thermo Scientific Nano-Drop 2000) zmierzyć absorbancję przy dł. fali 260 i 280 nm względem próby ślepej (wody wolnej of RNaz). Spektrofotometr dla warstwy absorbującej równej 10 mm w oparciu o zadaną wartość współczynnika absorbancji (dla RNA 1 jednostka A260 równa jest 40 g/ml) przelicza zmierzoną wartość absorbancji na stężenie wyrażone w ng/µl. Wyliczona przez spektrofotometr wartość ilorazu A260/A280 świadczy o czystości preparatu. 1.3. PRECYPITACJA RNA W przypadku uzyskania preparatu RNA o bardzo małym stężeniu (często uniemożliwiającym pomiar metodą spektrofotometryczną) roztwór możemy zagęścić przez precypitację (strącanie) z użyciem środków odwadniających. Najczęściej do precypitacji używa się alkoholi: etanolu lub izopropanolu. Wydajność precypitacji kwasu nukleinowego zwiększa użycie schłodzonego alkoholu; samą precypitację też wykonuje się w niskiej temperaturze (4 C lub -20 C). Wykonanie: Przygotować sterylną probówkę typu eppendorf o poj. 0.5 ml. Do 100 l roztworu wyjściowego RNA dodać 10 l 3M CH3COONa, ph 5.2 (RT) oraz 250 l 96% etanolu (z temp. -20 C). Wymieszać dokładnie i inkubować przez 30 min w temp. -20 C. Wytrącone RNA wirować przez 10 min, 13000 RCF, RT (wirówka minispin plus, Eppendorf). Zebrać dokładnie nadsącz końcówką kapilarną a peletę przemyć 250 l 70% etanolu (RT) i zworteksować. Ponownie zwirować przez 10 min, 13000 RCF, RT (wirówka minispin plus, Eppendorf). Po dokładnym zebraniu nadsączu końcówką kapilarną peletę wysuszyć pod lampką (ok.10 min) a następnie rozpuścić w 10 l wody dejonizowanej. W celu określenia odzysku RNA po precypitacji zmierzyć jego stężenie w roztworze wyjściowym oraz precypitacie (pkt. 1.2). Określić ilość RNA w roztworze wyjściowym i precypitacie oraz procent RNA odzyskany po precypitacji. Wyniki zamieścić w tabeli 1. Skomentować czystość roztworów RNA oraz wydajność precypitacji RNA. Tab.1. Bilans precypitacji RNA. roztwór RNA A260 A280 A260/A280 stężenie RNA [ng/µl] ilość RNA w danej objętości [µg] odzysk RNA [%] wyjściowy precypitat 2
2. ODWROTNA TRANSKRYPCJA Cząsteczki kwasu mrna przed amplifikacją w reakcji PCR należy przepisać na cdna (ang. complementary DNA) w procesie odwrotnej transkrypcji z użyciem enzymu odwrotnej transkryptazy (RT, ang. reverse transcriptase). Wykonanie: W probówce typu eppendorf o poj. 0.5 ml 1 g RNA rozcieńczyć wodą wolną od RNaz do obj. 5 l. W kolejnej probówce o poj. 0.5 ml przygotować mieszaninę reakcyjną, składającą się z: buforu 10-krotnie stężonego, roztworu czterech deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dntp), krótkich fragmentów oligodeoksyrybonukleotydowych (dt23), wody wolnej od RNaz oraz enzymu odwrotnej transkryptazy. Zamieszczona poniżej tabela 2 zawiera skład mieszaniny reakcyjnej na jedną próbkę. Tab.2. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji. składniki mieszaniny objętość [ l] 1. bufor 10x stężony 2 2. 5 mm dntp 2 3. 70 M oligo dt23 0,3 4. woda wolna od RNaz 9,7 5. odwrotna transkryptaza 1. objętość całkowita 15 Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną: mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce RNA. Odwrotną transkryptazę dodać na końcu, tuż przed dodaniem mieszaniny do probówki zawierającej RNA. Po zwirowaniu, probówki umieścić w bloku grzejnym i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w tabeli 3. Tab.3. Etapy odwrotnej transkrypcji. nazwa cyklu temperatura czas [min] 1. wstępna denaturacja 65ºC 5 2. odwrotna transkrypcja 37ºC 60 3. przerwanie reakcji 95ºC 5 4. koniec reakcji 4ºC 3
3. AMPLIFIKACJA CDNA METODĄ PCR Technika PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy lub reakcja łańcuchowa polimeryzacji) zapewnia uzyskanie w przeciągu krótkiego czasu milionów miliardów kopii badanego fragmentu DNA. Miejsce syntezy w cząsteczce cdna wskazują startery krótkie sekwencje nukleotydowe komplementarne do początku i końca powielanego odcinka cdna. Proces syntezy katalizowany jest przez termostabilny enzym polimerazę DNA (najczęściej stosowana jest polimeraza Taq wyizolowana z termofilnych bakterii Thermus aquaticus). Wykonanie: Do probówki o poj. 0.2 ml dodać 2 l (300 ng) cdna. Przygotować mieszaninę odczynników do reakcji PCR jedną wspólną dla wszystkich próbek dla danego genu. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi: bufor (10-krotnie stężony), Q-solution, roztwór czterech deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dntp), MgCl2 (jony magnezu są kofaktorami polimerazy Taq), para starterów (R ang. reverse i F ang. forward), woda wolna od RNaz oraz polimeraza Taq. Zamieszczona poniżej tabela 4 zawiera skład mieszaniny na jedną próbkę. Tab.4. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR składniki mieszaniny objętość [ l] 1. bufor 10x stężony 2.5 2. Q-solution 5 3. 10 mm dntp 1.6 4. MgCl2 1 5. 20 M starterów R 1 6. 20 M starterów F 1 7. woda wolna od RNaz 7.65 8. polimeraza Taq 0.25 objętość całkowita 20 Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną (mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce cdna). Polimerazę Taq dodać na końcu, tuż przed przeniesieniem mieszaniny do probówki zawierającej matrycę. Po krótkim zwirowaniu probówki umieścić w termocyklerze PCR i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w tabeli 5. Tab.5. Etapy reakcji PCR. nazwa cyklu temperatura czas [min] 1. wstępna denaturacja 94ºC 3 2. denaturacja 94ºC 1 3. hybrydyzacja temp. zależy od starterów 1 4. wydłużanie 72ºC 2 30-35 cykli (pkty: 2 4) 5. końcowe wydłużanie 72ºC 10 6. koniec reakcji 4ºC 4
4. ELEKTROFOREZA AGAROZOWA PRODUKTÓW REAKCJI PCR Produkt reakcji PCR identyfikujemy rozdzielając uzyskany materiał w żelu agarozowym metodą elektroforezy. W celu określenia wielkości badanego genu równocześnie rozdzielmy w żelu standardy masowe fragmenty DNA o znanej wielkości wyrażonej w ilości par zasad (pz, ang. base pair, bp). Na podstawie położenia badanego genu w stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość. Rozdzielone elektroforetycznie produkty reakcji PCF wizualizujemy przy użyciu fluorochromu bromku etydyny (EtBr), który interkalując z dsdna (dwuniciowym kwasem deoksyrybonukleinowym, ang. double stranded deoxyribonucleic acid) wykazuje intensywną fluorescencję w świetle UV. Wykonanie Przygotowanie 2% żelu agarozowego Do kolby stożkowej o poj. 250 ml dodać 0.8 g agarozy oraz 40 ml buforu TAE (40mM Tris-kwas octowy, ph 8.3, 1mM EDTA). Dokładnie rozpuszczać agarozę ogrzewając w mikrofalówce przez 3 5 min. Zamieszać zawartość kolby; jeśli agaroza nie uległa rozpuszczeniu kolbę umieścić ponownie na kilka minut w mikrofalówce. Złożyć podstawę na żel z płytkami zamykającymi oraz grzebieniem do formowania studzienek. Do roztworu agarozy schłodzonego pod wodą bieżącą do temp. 50 60ºC dodać 2.5 μl bromku etydyny (uwaga! bromek etydyny ma działanie karcynogenne!). Dokładnie wymieszać a następnie wylać żel na podstawę i odczekać do zastygnięcia (30 40 min, RT). Wyjąć płytki zamykające podstawę z żelem oraz grzebień. Umieścić żel w aparacie horyzontalnym (poziomym) wypełnionym buforem TAE (ok. 300 ml). Przygotowanie próbek Do sterylnej probówki typu eppendorf o poj. 0.5 ml używając sterylnych końcówek dodać: 5 μl cdna (amplifikatu uzyskanego w reakcji PCR), 1 μl buforu do próbek 6-krotnie stężonego (Loading Dye Solution, Fermentas). Wymieszać i krótko zwirować. Rozdział elektroforetyczny Próbki nałożyć do studzienek (kieszonek) wykonanych w żelu grzebieniem. Podłączyć elektrody do zasilacza i prowadzić rozdział przez 30 min przy napięciu 100 V. Pod wpływem pola elektrycznego ujemnie naładowane kwasy nukleinowe przemieszczają się w żelu agarozowym od katody do dodatnio naładowanej anody z prędkością zależną od ich wielkości. Wizualizacja kwasów nukleinowych Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść na folię. Wynik rozdziału elektroforetycznego analizować w transiluminatorze Uvitec w świetle UV. Zalecana literatura: "Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN; W-wa 2005. "Biochemia Harpera" R.J. Murray, D.K. Granner, V.W. Rodwell, PZWL, W-wa 2008 Biologia molekularna. Krótkie wykłady" PC Hames, AG McLennan, AD Bates, MRH White, PWN, W-wa 2007 Biochemia. Krótkie wykłady" BD Hames, NM Hooper, PWN, W-wa 2005 5