WYKORZYSTYWANEIN VITRO PRZEZ ENTEROKOKI

[- MED. DOSW. MIKROBIOL., 2001, 53, 9-15 Maria Sobis-Glinkowska, Jerzy Mikucki, Pawel Lisiecki ZWIERZECE USTROJOWE ZRÓDLA ZELAZA * WYKORZYSTYWANEIN VITRO PRZEZ ENTEROKOKI Zaklad Mikrobiologii Farmaceutycznej AM w Lodzi Kierownik: dr hab. E.M. Szewczyk Dla zbioru 20 szczepów z rodzaju Enterococcus izolowanych od ludzi i zwierzat badano zdolnosc wykorzystywania zródel Fe(lII) pochodzace od zwierzat. Oceniano równiez, z których zródel Fe(III) jest pobierane za pomoca sideroforów. Enterokoki sa wzglednymi beztlenowcami i naleza do bakterii o bezwzglednym zapotrzebowaniu na Fe(III) (10). Stezenie wolnego Fe(III) w ustroju jest bardzo niskie i nie przekracza lo,18m(18). Nie wystarcza ono dla podtrzymania wzrostu enterokoków gdyz bakterie Gram-dodatnie wymagaja wyzszych jego stezen - 1,8 x 10'6 M (16). Jednym z warunków kolonizacji ustroju jest dostep do Fe(III) zwiazanego w postaci zelazoproteidów niehemowych - transferyny, laktoferyny, ferrytyny i hemosyderyny oraz hemowych - hemoglobiny i heminy, a takze mioglobiny i cytochromów. Celem niniejszej pracy bylo zbadanie czy enterokoki izolowane z materialu klinicznego od ludzi maja zdolnosc wykorzystywania zródel zelaza pochodzacych od zwierzat. MATERIAL I METODY S z c z e p y b a k t e ryj n e. W badaniach wykorzystano 20, nalezacych do róznych gatunków, szczepów enterokoków (rodzaj Enterococcus). Dwa z nich E. faecalis BD 181 i E. faecium EN 5 pochodzily z kolekcji Zakladu Mikrobiologii Farmaceutycznej, dwa - E. pseudoavium DSM 5632 i E. seriolicida DSM 6783 otrzymano z niemieckiej kolekcji drobnoustrojów. Pozostale szczepy (oznaczone symbolem B) nalezace do gatunków E. faecalis i E. faecium pochodzily z Zakladu Mikrobiologii Akademii Medycznej w Bydgoszczy (Tabela I). Szczepy przechowywano w temperaturze -70 C w bulionie odzywczym (Nutrient Broth, Difco) zawierajacym 50% roztwór glicerolu. P o z Yw k i i war u n k i h o d o w l i. Uzywano jednej serii pozywki stalej Mueller- Hintona 2 (biomerieux). Dodawano do niej kwasu etylenodiamino-diort9- hydroksyfenylo-octowego (EDDA) (Sigma) do odpowiedniego dla kazdego szczepu Praca finansowana w ramach grantu wewnetrznego Akademii Medycznej w Lodzi AM 502-13-547(55).

10 M. Sobis-Glinkowska i inni Nr 1 stezenia koncowego, które wiazac zelazo hamuje wzrost. EDDA pozbawiano zelaza i krystalizowano metoda Rogersa (13). S t a n d a ry z a c j a z a w i e s i n b a k t e ry j n y c h. Zawiesiny bakteryjne standaryzowano w kolorymetrze spektralnym Spekol (Zeiss) przy dlugosci fali swietlnej 580 nm. O zn a cz an ie wr azl iwo sci n a ED D A. Najmniejsze stezenie EDDA hamujace wzrost badanych szczepów wyznaczano metoda plytkowa. Na plytki o 0 5 cm wylewano pozywke Mueller-Hintona 2, zawierajaca wzrastajace (5-25 mm) ilosci EDDA i 10 p.l standaryzowanej zawiesiny badanego szczepu o gestosci optycznej Asso=0,05-0,1. Plytki przetrzymywanow temperaturze 4 C przez dobe, a nastepnie inkubowano w temperaturze 37 C przez 24 godziny. Kontrole wzrostu stanowil nanoszony na plytke krazek bibuly nasaczony 5 p.l FeS04 x 7H20 (BDH) o stezeniu 5 mg/mi. Z ród l a z e l a z a. Uzyto nastepujacych zródel zelaza: transferyny bydlecej, transferyny jaja kurzego, laktoferyny bydlecej, ferrytyny konskiej, heminy bydlecej, hemoglobiny bydlecej (Sigma) oraz mioglobiny konskiej i konskiego cytochromu C (Serva). Wykrywanie aktywnosci proteolitycznej. Aktywnosc proteolityczna badano metoda plytkowa, w której substratem proteolizy byla kazeina mleka. Wykrywa n i e ak tywn o sci s i d erofo row ej. Aktywnosc sideroforowa wykrywano uniwersalna metoda z Chrom Azurolem S (CAS) poslugujac sie technika plytkowa (14). Wyk orzys tyw an i e z r6 d el zel a z a. Na pozbawione jonów plytki jednorazowego uzytku o 0 12 cm (Medlab) wylewano 15 mi pozywki zawierajacej odpowiednie stezenie EDDA (Tabela I) i 50 p.l standaryzowanej zawiesiny badanego szczepu o gestosci optycznej Asso = 0,05-0,1. Dla kazdego szczepu przygotowywano dwie plytki z takim samym stezeniem chelatora i przetrzymywano je w temperaturze 4 C przez dobe. Nastepnie na powierzchnie jednej z nich nakladano paski blony dializacyjnej (Serva). Na obie plytki nakladano krazki bibulowe (Whatman 3, o 0 6mm) i nasaczano je wodnymi roztworami zródel zelaza w nastepujacych ilosciach: transferyna bydleca - 1000 p.g, transferyna jaja kurzego - 1000 p.g, laktoferyna bydleca - 1000 p.g, ferrytyna konska - 1000 p.g, hemina bydleca - 200 p.g, hemoglobina bydleca 400 p.g, mioglobina konska 400 p.g, konski cytochrom C - 400 p.g. Kontrole wykorzystania zelaza z jego zródel stanowil krazek nasaczony 1000 p.g apotransferyny (Sigma), a kontrole wzrostu krazek zawierajacy 25 p.g FeS04 x 7H20 (BDH). Plytki inkubowano w temperaturze 37 C przez 48 godzin. O wykorzystywaniu zródla zelaza swiadczyla obecnosc wokól krazka strefy wzrostu badanego szczepu. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Do badan wybrano wstepnie 56 szczepów rodzaju Enterococcus. Wszystkie szczepy nalezace do gatunków E. faecalis i E. faecium byly izolowane z materialu klinicznego od ludzi, a tylko szczepy E. pseudoavium i E. seriolicida pochodzily od zwierzat. W tym etapie badan wyselekcjonowano szczepy o odpowiedniej wrazliwosci na EDDA ustalajac jego najmniejsze stezenie hamujace wzrost. Udalo sie wylonic zaledwie 20 szczepów wrazliwych na mozliwe do osiagniecia stezenia chelatora (Tabela I).

Nr 1 Wykorzystywanie zródel zelaza przez enterokoki 11 Tabela I. Badane szczepy enterokoków Oznaczenie Gatunek Pochodzenie Najnizsze Aktywnosc Aktywnosc szczepu szczepu stezenie sideroforowa proteolityczna EDDA hamujace wzrost MIC (mg/mi) ED 181 E. faecalis ludzie 3,6 + + B 19 E. faecalis ludzie 9,4 + - B 20 E. faecalis ludzie 7,2 + - B 24 E. faecalis ludzie 8,1 + + B 28 E. faecalis ludzie 7,2 + + B 29 E. faecalis ludzie 6,8 + - B 31 E. faecalis ludzie 7,2 + + B 36 E. faecalis ludzie 7,2 + - B 45 E. faecalis ludzie 8,6 + - B 46 E. faecalis ludzie 8,1 + - B 47 E. faecalis ludzie 8,1 + - B 51 E. faecalis ludzie 8,1 + + B 52 E. faecalis ludzie 8,1 + + B 56 E. faecalis ludzie 8,1 + + B - 100 H+ E. faecalis ludzie 4,4 + + B 1 E. faecium ludzie 1,8 + + B6 E. faecium ludzie 4,4 + + EN 5 E. faecium ludzie 4,4 + + DSM 5632 E. pseudoavium zwierzeta 3,6 + + DSM 6783 E. seriolicida zwierzeta 1,8 + + Doswiadczenia przeprowadzano w dwóch wersjach: w warunkach bezposredniego kontaktu szczepu ze zródlem zelaza i po oddzieleniu go blona dializacyjna. Wzrost badanych szczepów mógl pojawiac sie tylko wokól tych egzogennych zródel zelaza, z których mogly je pobierac. Gdy szczep mial bezposredni kontakt ze zródlem zelaza, dzialac moglo kilka mechanizmów poboru tego pierwiastka: proteolityczny rozklad bialkowego nosnika i uwolnienie Fe3+, redukcja zwiazanego z nosnikiem Fe3+ do Fe2+ i jego uwolnienie, bezposrednie przeniesienie Fe3+ z nosnika na receptor powierzchni komórki oraz systemy sideroforowe (18). Natomiast gdy zródlo zelaza oddzielono od bakterii blona dializacyjna mogly one pobierac je wylacznie za posrednictwem sideroforów. Wlasciwosci proteolityczne wykazywalo 13 sposród badanych szczepów i u nich mozna bylo oczekiwac pobierania Fe(III) w wyniku proteolizy nosnika. Siedem szczepów, nalezacych do gatunku E. faecalis bylo pozbawione aktywnosci proteolitycznej. Enterokoki wytwarzaja siderofory nalezace do klasy chelatorów hydroksamowych (4) i wszystkie badane szczepy mialy aktywnosc sideroforowa, a wiec ten mechanizm

12 M. Sobis-Glinkowska i inni Nr 1 pobierania Fe(III) mógl byc przez nie wykorzystywany (Tabela I). Nie mozna jednak na podstawie wyników badan rozstrzygnac za pomoca którego z mechanizmów enterokoki pozyskiwaly zelazo. Wszystkie szczepy enterokoków wykorzystywaly badane zródla zelaza, ale rózna ich liczbe. Jezeli zelazo wykorzystywane bylo w warunkach bezposredniego kontaktu z bakteriami to z reguly pozyskiwaly je takze po oddzieleniu go blona dializacyjna (Tabela II). Mozna wiec przypuszczac, ze ze wszystkich zródel Fe(III) bylo pobierane równiez za pomoca sideroforów. Wszystkie szczepy enterokoków wykorzystywaly zelazo z transferyny i laktoferyny bydlecej oraz transferyny jaja kurzego (ovotransferyny). Transferyny i laktoferyny to glówne ustrojowe zasoby zelaza pozakomórkowego, sa wiec dla enterokoków rozwijajacych sie wlasnie w przestrzeniach pozakomórkowych latwiej dostepnymi zródlami zelaza. Ludzka transferyna i laktoferyna, a takze transferyna jaja kurzego sa bialkami homologicznymi (17). Byc moze homologia laczy równiez transferyny i laktoferyny bydlece. Homologia taka moze miec znaczenie dla wiazania tych nosników zelaza z bialkowym receptorem komórki. Neisseria meningitidis i Neisseria gon01thoeaewykorzystuja zelazo ludzkiej transferyny i laktoferyny i mimo, ze. bakterie te sa wylacznie patogenami czlowieka moga wykorzystywac równiez transferyne bydleca i jaja kurzego (7,8, 17). Posluguja sie przy tym mechanizmem niezaleznym od sideroforów poniewaz tych ostatnich nie syntetyzuja (6, 15). Haemophilus influenzae typ b, wybitnie chorobotwórczy dla czlowieka, równiez nie wytwarzajacy sideroforów, pozyskuje zelazo przez bezposredni kontakt komórki z transferyna nie tylko ludzka ale takze bydleca i królicza. Nie wykorzystuje jednak ani ludzkiej ani zadnej innej laktoferyny (9). Bordetellapertussis moze pozyskiwac zelazo z ludzkiej i licznych transferyn zwierzecych, takze ovotransferyny (12). Z tych samych zródel pozyskuja je takze gronkowce koagulazododatnie i koagulazoujemne oraz Escherichia coli (3, 10). Helicobacter pylori nie syntetyzujacy sideroforów wykorzystuje tylko ludzka laktoferyne (1). Pasteurella haemolytica równiez nie wytwarzajaca sideroforów pozyskuje zelazo tylko z transferyny bydlecej a nie wykorzystuje innych transferyn (11). Bakterie z rodzaju Actinobacil/us powodujace zakazenia u cielat, owiec i kóz pobieraja zelazo z transferyn pochodzacych od licznych gatunków zwierzat (17). Liczna grupa badanych enterokoków - 17/20 wykorzystywala zelazo konskiej ferrytyny. Nie wykorzystywalyjej 3 szczepy - E.faecalisBD 181,E. faecium B 1 i E. faecium B 6. Cytochrom C stanowil zródlo zelaza dla 13 sposród 20 badanych szczepów, a tylko nieliczne wykorzystywaly mioglobine - 8//20 i hemoglobine - 8/20 (Tabela II). W wykorzystywaniu Fe(III) hemoglobiny moze byc pomocna cytolizyna enterokoków, która lizuje liczne komórki ssaków w tym klwinki ludzkie i bydlece. Natomiast zaden z testowanych enterokoków nie wykorzystywal zelaza zwiazanego z hemina. Dotyczylo to nawet szczepów, które wykorzystywalyfe(iii) hemoglobiny, mimo iz ta wiazaca Fe(III) protoporfiryna IX jest jej grupa prostetyczna. Byc moze warunkiem pozyskania tego zelaza bylo zwiazanie grupy prostetycznej z bialkiem. Hemoglobina i hemina sa zródlami zelaza dla bardzo licznych bakterii. Najczesciej wykorzystuja je gronkowce (2), ale takze bakterie z rodzaju Neisseria, Haemophilus, Yersinia, Pasteurella czy Vibrio (5, 17).

ẓ... - Tabela II. Zwierzece ustrojowe zródla zelaza wykorzystywane in vitro przez enterokoki Hemina Hemoglobina Mioglobina Cytochrom C Transferyna Transfezynajaja Laktofetyna Ferrytyna konska Szczep bydleca bydleca bydleca konski bydleca bydleca A A B A B A B A B A B A B A B E.jaeca/isBD 181 - + + + + + + + + + + + + - - E.jaeca/is B 19.... - + + + + + + + + + + E.jaecalis B 20 - - - - - + + + + + + + + + + E.jaecalisB 24 - + + + + + + + + + + + + + + E.jaecalis B 28 -.. - - - - + + + + + + + + E.jaeca/is B 29 - - - - - + + + + + + + + + + E. faeca/is B 31 - + + + + + + + + + + + + + + E.faecalis B 36 - - - - - - - + + + + + + + + E.jaeca/is B 45 - - - -. - - + + + + + + + + E.faecalis B 46 - - - - - - - + + + + + + + + E.faeca/is B 47 - - -. - - - + + + + + + + + E.jaecalis B 5l - + + + + + + + + + + + + + + E.jaecalisB 52 - - - - - - - + + + + + + + + E.faecalis B 56 - - - - - + + + + + + + + + + E.jaecalisB 100-H+ - + + + + + + + + + + + + + + E.jaeciumB 1 - + + + + + + + + + + + + - - E. faecium B 6 - + + + + + + + + + + + + - - E. faecium 'EN 5 - - - - - + + + + + + + + + + E. pseuooavium DSM 5632 - + + + + + + + + + + + + + + E. seriolicido DSM 6783 - - - - - -. + + + + + + + + ~ ;o;- o ~ po ::I G' N,.., o' o. St. N. CI> iii N po "Ọ., N CI> N CI> ::I ; a;o;- o ~ A - w bezposrednim kontakcie ze zródlem zelaza B - po oddzieleniuzródelzelazablonadializacyjna - w

14 M. Sobis-Glinkowska i inni Nrl Cztery izolowane od ludzi szczepy gatunku E. faecalis - B 24, B 31, B 51 i B 100-1 H + wykorzystywaly 7/8 zródel Fe(III): hemoglobine, mioglobine, cytochrom C, transferyne, ovotransferyne, laktoferyne i ferrytyne. Fe(III) z 6/8 zródel pobieraly szczepy E. faecium B1 i B 6 oraz E. faecalis BD 181: hemoglobiny, mioglobiny, cytochromu C, transferyny, ovotransferyny i laktoferyny. Z 5/8 zródel Fe(III): cytochromu C, transferyny, ovotransferyny, laktoferyny i ferrytyny korzystaly szczepy E. faecalis B 19, B 20, B 29, B 56 i E. faecium EN 5. Najmniejsza liczbe zródel Fe(III), 4/8: transferyne, ovotransferyne, laktoferyne i ferrytyne wykorzystywala najliczniejsza grupa 6 szczepów izolowanych od ludzi: E. faecalis B 28, B 36, B 45, B 46 i B 52. Dwa szczepy pochodzace od zwierzat róznily sie miedzy soba liczba wykorzystywanych zródel Fe(III) ale nie odbiegaly w tej mierze znaczaco od szczepów ludzkich. Jeden szczep - E. pseudoavium DSM 5632 wykorzystywal 7/8 zródel Fe(III): hemoglobine, mioglobine, cytochrom C, transferyne, ovotransferyne, laktoferyne i ferrytyne, a E. seriolicida DSM 6783-4/8: transferyne, ovotransferyne, laktoferyne i ferrytyne. Maria Sobis-Glinkowska, Jerzy Mikucki, Pawel Lisiecki. THE ANIMAL BODY IRON SOURCES UTILIZED IN VITRO BY ENTEROCOCCI Summary Under iron restricted conditions enterococcal strains could utilize in vitro several animai body iron sources in form of bovine hemoglobin, hemin, lactoferrin and transferrin, ovotransferrin, horse myoglobin, ferritin and cytochrome C. Spectrum of utiiized iron sources was not depended on species affiiiation and origin of strains. PISMIENNICTWO 1. Guerinot ML. Microbial iron transport. Ann Rev Microbiol 1994; 48: 743-72. 2. Lisiecli P, Mikucki l. Ustrojowe zródla zelaza czlowieka wykorzystywanein vitro przez gronkowce. Med. Dosw Mikrobiol 1996; 48: 5-13. 3. Lisiecki P, Sobis-GIinkowska M, Mikucki J. Zwierzece ustrojowe zródla zelaza wykorzystywanein vitro przez gronkowce.med Dosw Mikrobiol 1997;49: 45-53. 4. Lisiecki P, WysockiP, Mikucki l. Occurrenceof siderophores in enterococci. Zbl Bakteriol 1999;298: 807-15. 5. MazoyR, LemosML. Iron-bindingproteins and heme compoundsas iron sources for Vibrio anguillarum. Curr Microbiol 1991; 23: 221-26. 6. McKenna WR, Mickelsen PA, SparlingPF i inni. Iron uptake from lactoferrin and transferrin by Neisseria gonorrhoeae. Infect Immun 1988; 56: 785-91. 7. Mickelsen PA, Sparling PF. AbiIity of Neisseriagonorrhoeae,Neisseria meningitidis and comensal Neisseriaspecies to obtain iron from transferrin and iron compounds. Infect Immun 1981;33: 555-64. 8. Mickelsen PA, Blackman E, Sparling PF. AbiIity of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria men ingitidis and comensal Neisseria species to obtain iron from lactoferrin. Inect Immun 1982; 35: 915-20. 9. Morton Dl, Williams P. Siderophore-independent acquisition of transferrin-bound iron by Haemophilusinfluenzae type b. J Gen Microbiol 1990;136: 927-33. 10. Neilands IB, Konopka K, Schwyn B i inni. Comparative biochemistry of microbial iron assimiiation. W: Iron transport in microbes, plants and animals. Red. G. WinkeIman, D. van der Helm, J. B. NeiIands, VCH VerIagsgeseIIschaft, Weinheim, 1.987,3-33.

Nr 1 Wykorzystywanie zródel zelaza przez enterokoki 15 11. Ogunnariwo JA, Schryvers AB. Iron acquisition in Pasteurella haemolytica: expression and identification of a bovine-specific transferrin receptor. Infect Immun 1990; 58: 2091-97. 12. Redhead K, Hill T, Chart H. Interaction of lactoferrin and transferrin with the outer membrane of Bordetella pertussis. J Gen Microbiol1987; 133: 891-98. 13. RogersHJ. Iron-bindingcatechols and virulence in Escherichiacoli. Infect Immun 1973; 7: 445-56. 14. Schwyn B, Neilands JB. Universal chemical assay for detection and determination of siderophores. Anal Biochem 1987; 160: 47-56. 15. Tsai J, Dyer DW, Sparling PF. Lass of transferrin receptor activity in Neisseria meningitidis corelates with inability to use transferrin as an iron source. Infect Immun 1988; 56: 3132-38. 16. Weinberg ED. Iron witholding: a defense against infection and neoplasia. Physiol Rev 1984; 64: 65-102. 17. Williams P, Griffiths E. Bacterial transferrin receptors-structure, function and contribution to virulence. Med Microbiol Immunol1992; 181: 301-22. 18. Wooldridge KG, Williams PH. Iron uptake mechanisms of pathogenic bacteria. FEMS Microbiol Rev 1993; 12: 325-48. Otrzymano:20 XI 2000 r. Adres Autora: 90-235 Lódz, ul. Pomorska 137,Zaklad MikrobiologiiFarmaceutycznejAM.