Organizmy modelowe - drożdże Saccharomyces cerevisiae i nie tylko
Co można badać na drożdżach? } Praktycznie wszystkie podstawowe aspekty biologii molekularnej, biologii komórki, genetyki 2
Transdukcja sygnału
To czego nie można badać na drożdżach } Różnicowanie i rozwój } Neurobiologia } Regulacja przez małe niekodujące RNA (sirna, mirna) } Alternatywny splicing 4
Drożdże i cykl komórkowy Nobel dla drożdży 5
Drożdże i cykl komórkowy Nobel 2001 6
Cykl komórkowy 7
Mutanty cdc S. cerevisiae } Cykl komórkowy podobny do wyższych Eukaryota } Fazy G1, S, G2, M i wrzeciono podziałowe } Lee Hartwell zastosowanie genetyki drożdży do badania cyklu komórkowego (1970-73) } Mutanty temperaturowrażliwe (ts), analizowane za pomocą mikroskopii (zdjęcia poklatkowe) } populacja zatrzymuje się w tej fazie, której dotyka mutacja } stwierdzenie, której fazy cyklu dotyczy defekt w mutancie 8
Mutanty cdc S. cerevisiae http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2001/hartwell-lecture.pdf 9
Mutanty wee i cdc u S. pombe } Podziały komórki skoordynowane z wzrostem komórek } Mutant wee komórki zaczynają się dzielić, kiedy są jeszcze małe zaburzona kontrola startu cyklu 10
Regulacja cyklu } wee1 inhibitor cyklu; } cdc25, cdc2 aktywatory } mutant typu wee dominujący (konstytutywna aktywność) } utrata funkcji duże komórki 11
Regulacja cyklu komórkowego 12
Od drożdży do człowieka } mutację cdc2 S. pombe można odwrócić wprowadzając na plazmidzie ludzki gen CDK1 (Cyclin Dependent Kinase) 13
Drożdże i transkrypcja Kolejny Nobel dla drożdży 14
Drożdże i transkrypcja 15
Drożdże i transkrypcja 16
Drożdże i transkrypcja 17
Drożdże i transkrypcja Łatwość hodowli przydatne w projektach oczyszczania i krystalizacji białek 18
19 Drożdże i mitochondria
Profil metaboliczny S. cerevisiae } Fakultatywne aeroby } Efekt Pasteura tlen hamuje fermentację, ale } Efekt Crabtree w obecności glukozy (C 6 ) fermentacja anaerobowa nawet w obecności tlenu } Glukoza hamuje oddychanie } Etanol jest następnie wykorzystywany (jeżeli nadal jest tlen) } Strategia akumulacja i konsumpcja 20
S. cerevisiae i mitochondria co szczególnego? } Przeżywa bez funkcji oddechowej (fakultatywny tlenowiec, fermentacja) } Mutanty z defektywnym oddychanie, petite (lata 1960.) } Przeżywa bez genomu mitochondrialnego ( petite positive ) glukoza (fermentacja) glicerol (oddychanie) 21
Fenotyp petite u S. cerevisiae } Zmiany w mtdna } ρ 0 całkowita utrata mtdna } ρ - częściowa utrata mtdna, znaczne delecje i reamplifikacja } mit - - mutacje punktowe, prawidłowa struktura genomu } Zmiany w ndna mutanty pet 22
Oddziaływania jądrowo mitochondrialne nucleus mitochondrion Unidirectional gene transfer and adaptation Development of evolutionary novelties Gene loss as a result of redundancy with the nuclear genome or functional substitution } Proteom mitochondrium ~500-800 białek } 8-9 kodowane w mtdna } Ponad 150 genów jądrowych niezbędnych do utrzymania mitochondrialnego systemu genetycznego 23
Ekspresja genomu mitochondrialnego S. cerevisiae Inner membrane Matrix III IV V Cox1 Cox2 Cox3 Atp6 Atp8 Atp9 RNA polymerase Cob Rpo4 1 Mtf1 24 trnas Translation mtdna Transcription 21S rrna Cob, Cox1, Cox2, Cox3, Atp6, Atp8, Atp9, Var1 LSU SSU Translation 15S rrna Var1 24 9S RNA + Rpm2 RNase P Mitochondrial ribosome Slide by Bartosz Zapisek, 2011.
Problem analiz wysokoprzepustowych Geny pet (niezbędne do oddychania) Merz & Westermann, 2009 25
Nie tylko S. cerevisiae } S. cerevisiae był od dziesiątków lat standardowym modelem genetyki mitochondrialnej } metabolizm fakultatywnie aerobowy } przeżywa bez mtdna (petite positive) } Pod wieloma względami jest nietypowy } przeżywa bez mtdna (petite positive) } nietypowa organizacja, ekspresja i replikacja mtdna } brak genów kompleksu I (dehydrogenaza NADH) w mtdna } genom po epizodzie duplikacji całego genomu (WGD) i utracie redundantnych paralogów 26
27 Drożdże jako model dla genetyki człowieka
Genomy S. cerevisiae H. sapiens ~1,2 x 10 7 bp ~3 x 10 9 bp ~6500 genów ~25 000 genów ~1800 genów wykazuje homologie z genami H. sapiens (30%) ~ 4000 genów wykazuje homologie z genami S. cerevisiae (13%) Wiele podstawowych funkcji komórki jest zachowanych. Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i ludzkich (np. Ras, Oxa1) 28
Przykładowe drożdżowe modele chorób } Progerie Wernera i Blooma } Choroby związane z defektami naprawy DNA (HNPCC, ataksja-telangiektazja) } Ataksja Friedreicha } Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej (PEO) } Choroby wywołane mutacjami w mtdna (NARP) } Poszukiwanie leków za pomocą drożdży 29
Zespół Wernera Przyczyna: mutacje genu WRN kodującego helikazę DNA z rodziny RecQ } } } Normalny rozwój w dzieciństwie. Przedwczesne starzenie rozpoczyna się wraz z wiekiem dojrzewania. Niski wzrost, owrzodzenia, zwapnienia, siwienie włosów. } Pacjenci dożywają średnio 47 lat. } Przyczyną śmierci z reguły choroba nowotworowa, albo schorzenia sercowonaczyniowe. 30
Zespół Blooma } } } Opóźniony wzrost, karłowatość. Zaburzenia pigmentacji skóry. Predyspozycje do wczesnego (ok. 25 r. ż.) występowania wielu różnych nowotworów. } Z reguły nie dożywają 40-50 lat (1/3 nie dożywa 25 lat). Przyczyna: mutacje genu BLM kodującego kolejną helikazę DNA z rodziny RecQ 31
Zaburzenia w zespołach Wernera i Blooma } Utrata stabilności genomu } Zaburzenia w okolicach telomerów (WRN) } Zwiększona częstość wymiany chromatyd siostrzanych (BLM) } Zwiększona częstość zaburzeń kariotypowych } Zwiększona częstość mutacji genów 32
SGS1 model drożdżowy } Gen SGS1 jest drożdżowym homologiem genów WRN i BLM. } Fenotyp delecji SGS1: } } } zwiększona rekombinacja mitotyczna (zwłaszcza subtelomerowa) zaburzenia segregacji chromosomów zaburzenia mejozy } Białko Sgs1p jest zaangażowane w hamowanie nieuprawnionej rekombinacji i utrzymywanie stabilności genomu. } Ludzkie geny BLM i WRN częściowo komplementują fenotyp delecji SGS1 33
HNPCC (zespół Lyncha) } HNPCC - dziedziczny rak jelita grubego niezwiązany z polipowatością } Około 5% wszystkich raków jelita grubego } Mutacje w genach kodujących białka zaangażowane w naprawę niedopasowanych nukleotydów (mismatch repair) } Podwyższona częstość mutacji, zwłaszcza niestabilność traktów z powtórzeniami } Najczęściej mutacje genów hmsh2 i hmlh1 34
Drożdżowy model HNPCC W mutantach drożdżowych wzrost spontanicznej mutagenezy Alfred & Borts (2007) Biochem Soc Trans, 35:1525-28 Dla dokładniejszego zbadania efektu konkretnych mutacji ludzkich stworzono hybrydowe geny, w których fragmenty genu S. cerevisiae zastępuje się pochodzącymi z genów człowieka tak, by zachować funkcję w drożdżach (tzw. humanizowanie drożdży). 35
Ataksja Friedreicha } Choroba układu nerwowego i mięśni } } } zaburzenia czucia obniżone napięcie mięśniowe kardiomiopatia, deformacje kręgosłupa i stóp } Autosomalna recesywna; 1/50 000 } Mutacja dynamiczna w genie frataksyny } Akumulacja żelaza w mitochondriach: } } } Zaburzenia systemów naprawczych mtdna Zaburzenia w oddychaniu Stres oksydacyjny 36 Bramwell: Atlas of Clinical Medicine
YFH1 drożdżowy homolog frataksyny } Białko wiążące żelazo } Mitochondrialny magazyn żelaza } Detoksykacja nadmiaru żelaza } Włączanie żelaza do centrów Fe-S 37
YFH1 drożdżowy homolog frataksyny } Fenotyp delecji: } defekt oddychania mitochondrialnego } zwiększona wrażliwość na stres oksydacyjny } akumulacja żelaza w mitochondriach: 10-krotnie większe stężenie od szczepu dzikiego } zależna od żelaza oksydacyjna degradacja centrów Fe-S } Ludzki gen kompensuje delecję genu drożdżowego 38 Cavadini i wsp., (2000), Hum Mol Genet, 9:2523-30
Zaburzenia komunikacji jądrowomitochondrialnej } Mutacje w genach kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie mtdna } ANT1 (transporter ADP/ATP) } POLG (polimeraza DNA) } Choroby dziedziczone autosomalnie, objawiają się delecjami w mtdna lub deplecją mtdna 39
PEO } PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej) } Postać dominująca (adpeo) lub recesywna (arpeo) } Objawy } opadanie powiek (ptosis), } niezdolność do poruszania gałkami oczu, } ogólne osłabienie mięśni, } zaburzenia neurologiczne, 40
Mutacje i modele drożdżowe } POLG (mitochondrialna polimeraza DNA) } drożdżowy homolog MIP1 } ANT1 (mitochondrialny transporter ATP/ADP } drożdżowy homolog AAC2 41
h"p://tools.niehs.nih.gov/polg
Homologia POLG i MIP1 } Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu mitochondrialnego } } } spontaniczne delecje mutacje punktowe całkowita utrata mitochondrialnego DNA 43
Choroby wywołane mutacjami w mtdna } Np. NARP Neurogenic Ataxia Retinitis Pigmentosa } Mutacja w genie ATP6 } W komórkach 70-90% zmutowanego DNA } Obniżona aktywność syntezy ATP 44
Drożdżowe modele chorób mitochondrialnych S. cerevisiae jedyny organizm modelowy, u którego można wprowadzać DNA do mitochondriów ukierunkowana mutageneza mtdna 45 Rak, M. et al. J. Biol. Chem. 2007;282:34039-34047
46 Długowieczność i starzenie
Długowieczność drożdży } Zastosowanie drożdży S. cerevisiae jako modelu zjawisk związanych ze starzeniem proponowano od lat 60. (Mortimer & Johnson) } Dwa mechanizmy } starzenie replikatywne limit podziałów komórki-matki (~30) } starzenie chronologiczne przeżywalność w fazie spoczynkowej hodowli (wyczerpane źródła energii) 47
Mechanizmy kontrolujące długowieczność mogą być konserwowane w ewolucji 48
Drożdże i biologia systemów Drożdże w XXI wieku 49
Poszukiwanie interakcji genetycznych } Oddziaływania łagodzące (np. supresja) } selekcja bezpośrednia } Oddziaływania syntetyczne } syntetyczna letalność: } pojedyncze mutacje gen1 i gen2 nie są letalne, ale podwójny mutant gen1, gen2 nie przeżywa } syntetyczne wzmocnienie } pojedyncze mutacje gen1 i gen2 słaby fenotyp, podwójny mutant gen1, gen2 silny fenotyp (np. spowolnienie wzrostu) 50
Ujęcie ilościowe Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25 51
SGA } } } } } Synthetic Gene Array Kolekcja delecji, krzyżowana z badanym genem Sporulacja, Selekcja haploidów MATa Selekcja pojedynczych i podwójnych mutantów 52 Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437
SGA 53 http://www.utoronto.ca/boonelab/sga_technology/index.shtml
dslam Diploid-based synthetic lethality analysis with microarrays (dslam) 54
Wyniki sieci interakcji genetycznych 55
56 Costanzo i wsp., (2010) Science 327, 425
57 Ewolucja eksperymentalna
Ewolucja eksperymentalna } Możliwość prowadzenia wielu hodowli równolegle przez wiele pokoleń 58
Ewolucja wielokomórkowości } Selekcja w hodowlach S. cerevisiae w kierunku szybkiego opadania osadu } Pojawiają się grupy komórek ( płatki śniegu ) 59
Ewolucja wielokomórkowości wyjściowe - jednokomórkowe po 14 pokoleniach selekcji po 60 pokoleniach selekcji 60
Ewolucja specjalizacji } Pod koniec w zgrupowaniach pojawił się podział funkcji niektóre komórki inicjują programowaną śmierć by ułatwić podział grupy przez fragmentację Evolution of programmed cell death in snow!ake yeast 61
Podział kolonii
Podział kolonii