AUTOREFERAT. Dr Aleksandra Grabowska-Joachimiak

AUTOREFERAT Dr Aleksandra Grabowska-Joachimiak Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa Wydział Rolniczo-Ekonomiczny Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Kraków 2014 1

1. Imię i nazwisko: Aleksandra Grabowska-Joachimiak 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej Magister biologii - Wydział Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, 1994. Tytuł pracy magisterskiej: Badania fluorescencyjne chromatyny roślin. Studium metodyczne Doktor nauk biologicznych w zakresie biologii, specjalność: cytologia roślin - Wydział Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, 2001. Tytuł rozprawy doktorskiej: Struktura kariotypu Melandrium album (Mill.) Garcke i Melandrium rubrum (Weigel) Garcke ze szczególnym uwzględnieniem chromosomów płci 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych 1996-2003 - asystent; Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, Wydział Rolniczo- Ekonomiczny, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. 2003 - do chwili obecnej - adiunkt; Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, Wydział Rolniczo-Ekonomiczny, Uniwersytet Rolniczy (wcześniej Akademia Rolnicza) im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. *W latach 1994-1996 pracowałam na stanowisku asystenta w Pracowni Alergologii i Immunologii Wojewódzkiego Specjalistycznego Zespołu Opieki Zdrowotnej w Krakowie. 2

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego: Charakterystyka i pochodzenie złożonego systemu chromosomów płci XX/XY1Y2 w świetle badań kariotypu u wybranych dwupiennych gatunków Angiospermae Osiągnięcie naukowe stanowi cykl publikacji powiązanych tematycznie, wymienionych w pkt 4b. b) autor/autorzy, rok wydania, tytuł publikacji, wydawnictwo 1. Grabowska-Joachimiak A, Sliwinska E, Piguła M, Skomra U, Joachimiak A. 2006. Genome Size in Humulus lupulus L. and H. japonicus Siebold & Zucc. (Cannabaceae). Acta Societatis Botanicorum Poloniae 75: 207-214. udział własny: 60% (IF 2006 = 0.148, punkty MNiSW=15) 2. Grabowska-Joachimiak A, Mosiolek M, Lech A, Góralski G. 2011. C-Banding/DAPI and in situ Hybridization Reflect Karyotype Structure and Sex Chromosome Differentiation in Humulus japonicus Siebold & Zucc. Cytogenetic and Genome Research 132: 203-211. udział własny: 70% (IF 2011 =1.533, punkty MNiSW=20) 3. Grabowska-Joachimiak A, Kwolek D, Kula A, Marciniuk P. 2012. Fluorescent Banding Pattern and Species-Specific DNA Marker in Rumex thyrsiflorus Fingerh. Cytogenetic and Genome Research 137: 70-77. udział własny: 65% (IF 2012 =1.839, punkty MNiSW=20) 3

4. Grabowska-Joachimiak A, Kula A, Książczyk T, Chojnicka J, Sliwinska E, Joachimiak AJ. 2014. Chromosome landmarks and autosome-sex chromosome translocations in Rumex hastatulus, a plant with XX/XY1Y2 sex chromosome system. Chromosome Research, DOI: 10.1007/s10577-014-9446-4 udział własny: 50% (IF 2013 =2.688, punkty MNiSW=25) We wszystkich ww. pracach byłam autorem korespondencyjnym. Sumaryczny impact factor (IF) dla ww. prac = 6.208 Łączna liczba punktów MNiSW (wg wykazu z 2013) = 80 Łączna liczba obcych cytacji = 27 c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Wprowadzenie Zagadnienia związane z chromosomową determinacją płci u roślin okrytozalążkowych, a w szczególności struktura i ewolucja heteromorficznych chromosomów płci stanowią najistotniejszą część moich zainteresowań badawczych. Wpisują się one w szeroki nurt badań z zakresu biologii ewolucyjnej, koncentrujących się wokół kwestii powstania i kształtowania rozdzielnopłciowości organizmów. Większość prac z tego zakresu dotyczy organizmów zwierzęcych (głównie ssaków), co jest jak najbardziej zrozumiałe ze względu na powszechnie występującą u nich rozdzielnopłciowość i zaawansowany wiek chromosomów płci (ponad 200 mln lat). Odmienną sytuację obserwujemy u roślin okrytozalążkowych, wśród których pełną rozdzielnopłciowość (dwupienność) stwierdzono u ok. 6% gatunków, a liczba dwupiennych gatunków, u których opisano występowanie heteromorficznych, czyli strukturalnie rozróżnialnych chromosomów płci ograniczona jest do ok. 20. Do tej nielicznej grupy należą przedstawiciele 6 rodzajów, z 4 rodzin: Coccinia grandis, Trichosanthes dioica /Cucurbitaceae/; Silene latifolia, S. dioica, S. diclinis /Caryophyllaceae/; Cannabis sativa, Humulus lupulus, H. japonicus /Cannabaceae/ oraz kilkanaście gatunków z rodzaju Rumex /Polygonaceae/ (Jamilena et al. 2008; Charlesworth 2008; Navajas-Pérez et al. 2009a; Ming et al. 2011; Navajas-Pérez 2012; Kumar 4

et al. 2014). Wiek heteromorficznych chromosomów płci u najlepiej jak dotąd zbadanych Rumex acetosa oraz Silene latifolia ocenia się na nie więcej niż 10-20 mln lat (Sola-Campoy et al. 2012; Filatov 2012). Wśród badaczy panuje więc przekonanie, że ze względu na młody wiek ewolucyjny, to właśnie roślinne chromosomy płci stanowią doskonały model badawczy, umożliwiający poszerzenie wiedzy na temat wczesnych etapów ewolucji chromosomów płci oraz mechanizmów determinacji płci (Charlesworth 2008; Charlesworth 2013). Badania chromosomów płci u roślin kwiatowych zostały zapoczątkowane w latach dwudziestych ubiegłego wieku, po zidentyfikowaniu po raz pierwszy w roku 1923, heteromorficznych chromosomów płci u trzech dwupiennych przedstawicieli Angiospermae tj. u bieńca białego Melandrium album (= Silene latifolia), szczawiu zwyczajnego Rumex acetosa oraz chmielu zwyczajnego Humulus lupulus. Intensywny rozwój tych badań nastąpił pod koniec XX w. wraz z rozwojem zaawansowanych metod cytogenetycznych, w tym technik z zakresu cytogenetyki molekularnej. Rośliny wykształciły strategie chromosomowej determinacji płci analogiczne do tych, które znamy ze świata zwierząt, a więc: system aktywnego chromosomu Y, w którym płeć męską determinuje obecność chromosomu Y (jak u ssaków) oraz system X:A oparty na stosunku liczby chromosomów X do liczby kompleksów autosomalnych (jak u Drosophila i Caenorhabditis). W przypadku tej drugiej, wartość stosunku X:A 1 warunkuje powstanie osobnika płci żeńskiej, natomiast wartość X:A 0,5 determinuje płeć męską. Osobniki interseksualne powstają przy wartościach między 0,5 a 1 (Parker & Clark 1991; Charlesworth & Guttman 1999; Ainsworth 2000; Vyskot & Hobza 2004). U roślin wyróżnia się dwa podstawowe systemy chromosomów płci: 1) prosty, starszy ewolucyjnie system XX/XY stwierdzony u Silene latifolia, S. dioica, Humulus lupulus, Cannabis sativa, Coccinia grandis, Trichosanthes dioica, Rumex acetosella, R. suffruticosus, R. graminifolius, R. paucifolius, R. hastatulus (cytotyp Texas), 2) system złożony XX/XY1Y2, występujący u Humulus japonicus oraz u kilkunastu gatunków Rumex, w tym u Rumex acetosa, R. thyrsiflorus, R. hastatulus (cytotyp North Carolina). U wszystkich wymienionych gatunków płcią heterogametyczną jest płeć męska (Matsunaga & Kawano 2001; Jamilena et al. 2008; Ming et al. 2011; Kumar et al. 2014). Poza tym dla Humulus lupulus var. cordifolius oraz Silene diclinis podawano występowanie złożonego systemu X1X1X2X2/X1Y1X2Y2 (Parker & Clark 1991; Howell et al. 2009). 5

Geneza dwupienności i jej najbardziej zaawansowanej formy związanej z występowaniem heteromorficznych chromosomów płci jest od lat szeroko dyskutowana. Ewolucja dwupienności zachodziła u Angiospermae niezależnie i wielokrotnie, a głównym naciskiem selekcyjnym wpływającym na jej częstość w różnych taksonach była ochrona przed samozapyleniem. Zgodnie z najczęściej przytaczanym modelem, dwupienność wyewoluowała nie bezpośrednio z hermafrodytyzmu, lecz przypuszczalnie poprzez żeńskodwupienność (w populacji występują osobniki żeńskie i obupłciowe), natomiast chromosomy płci wyróżnicowały się z pary homologicznych autosomów, na skutek dwóch niezależnych mutacji: recesywnej w kierunku męskiej sterylności oraz dominującej w kierunku żeńskiej sterylności. Powstały w ten sposób pierwotne chromosomy płci (proto-x oraz proto-y), które zawierały geny determinujące płeć, ale pozostawały nierozróżnialne na poziomie cytologicznym, były więc homomorficzne. Dopiero popierane przez dobór naturalny stopniowe ograniczenie rekombinacji mejotycznej na znacznej ich długości, doprowadziło do wykształcenia chromosomów heteromorficznych (Charlesworth 1991; Charlesworth & Guttman 1999; Charlesworth 2002; Bachtrog 2006, 2011; Ming et al. 2011). Ewolucyjną konsekwencją supresji rekombinacji była degeneracja genetyczna chromosomu Y (insercje transpozonów, gromadzenie tandemowych sekwencji repetytywnych, akumulacja szkodliwych mutacji, utrata funkcjonalnych genów), aż w końcu delecja zdegenerowanych fragmentów (Charlesworth 1991, 2002, 2008; Charlesworth & Charlesworth 2000; Bachtrog 2006, 2011; Jamilena et al. 2008; Ming et al. 2011; Sola-Campoy et al. 2012). Wspomniane procesy degeneracyjne, których cytologicznym przejawem jest silna heterochromatynizacja chromosomu Y oraz znaczna redukcja jego rozmiarów zostały dowiedzione u zwierząt (ssaki, Drosophila melanogaster). U przebadanych pod tym kątem roślin, degeneracja genetyczna Y nie została jeszcze w pełni wyjaśniona i pozostaje raczej w sferze postulatów, niż potwierdzonych faktów. Warto wspomnieć, że roślinne chromosomy Y są z reguły jednymi z największych w kompleksie, a obserwowana w ich obrębie akumulacja sekwencji repetytywnych (rozproszonych lub tandemowych) może, jak się sugeruje, dotyczyć jedynie obszarów międzygenowych lub intronów (Armstrong & Filatov 2008; Charlesworth 2008). Niewykluczone również, że jedną z przyczyn braku zaawansowanych zmian degeneracyjnych jest stosunkowo krótki czas ewolucji roślinnych chromosomów płci oraz, co wydaje się kluczowe, wzmożona ekspresja genów na poziomie haploidalnym (gametofitowym) (Bachtrog 2011; Bergero & Charlesworth 2011; Chibalina & Filatov 2011, Filatov 2012). 6

Biorąc pod uwagę wyniki dotychczasowych badań, przyjmuje się, że chromosomy płci u roślin okrytozalążkowych reprezentują różne stadia ewolucji (Vyskot & Hobza 2004; Jamilena et al. 2008; Ming et al. 2011; Charlesworth 2013). Na wczesnym etapie ewolucji są cytologicznie nierozróżnialne (homomorficzne) chromosomy płci u Asparagus officinalis oraz u Spinacia oleracea, u których ograniczenie rekombinacji dotyczy jedynie locus kontrolującego determinację płci (sex-determining locus). U Carica papaya, gatunku którego chromosomy płci również są homomorficzne, stwierdza się już obecność niedużych rozmiarów (6-7 Mpz), nierekombinującego, częściowo zdegenerowanego rejonu MSY (male specific region) w chromosomie odpowiadającym chromosomowi Y (proto-y). Mapowanie genetyczne wykazało w obrębie MSY akumulację sekwencji transpozonowych i utratę niektórych genów (Ming et al. 2007, 2011), sugerowano również pewne oznaki heterochromatynizacji tego rejonu (w postaci drobnych heterochromatic knobs, obserwowanych w chromosomach pachytenowych) (Zhang et al. 2008). Pojawienie się wspomnianych zmian stanowiło niewątpliwie wynik lokalnego zahamowania rekombinacji pomiędzy chromosomami X i Y, których wiek u C. papaya oszacowano na ok. 2-3 mln lat (Gschwend & Ming 2012). Konsekwencją stopniowego powiększania się rejonu nierekombinującego (progresywnej supresji rekombinacji) było wyróżnicowanie heteromorficznych chromosomów płci np. u Silene latifolia czy Rumex acetosa. U S. latifolia, rekombinacja pomiędzy heteromorficznymi chromosomami X i Y ograniczona jest do niewielkiego rejonu pseudoautosomalnego (PAR). Jak ustalono, geny wpływające na rozwój cech męskich (rozwój pręcików i pyłku) oraz geny hamujące żeńskość znajdują się w obrębie nierekombinującej części chromosomu Y. Niestety żaden z wyizolowanych do tej pory genów nie okazał się być nadrzędnym genem determinującym płeć męską, genem męskospecyficznym (male-specific), związanym z chromosomem Y (Y-specific). Ponadto, stwierdzono, że każdy z nich, łącznie z genem SlAP3Y (typu MADS box), odpowiadającym za dojrzewanie męskich pąków kwiatowych ma swój odpowiednik na chromosomie X bądź na autosomie (Matsunaga et al. 2003; Sola-Campoy et al. 2012). Chromosomy płci u S. latifolia wyewoluowały wg różnych autorów 10-20 mln lat temu, a jak podaje Filatov (2012), wiek chromosomu Y jest u tego gatunku porównywalny do najmłodszego rejonu chromosomu Y u człowieka (tzw. stratum 4), który jest prawie całkowicie zdegenerowany i nie zawiera żadnych funkcjonalnych genów. Tymczasem u S. latifolia olbrzymia większość z opisanych genów związanych z chromosomem Y nie utraciła funkcji (Bergero and Charlesworth 2011; 7

Chibalina i Filatov 2011). Co więcej, chromosom ten w przeciwieństwie do chromosomu Y u człowieka jest największy w kompleksie i nie wykazuje heterochromatynizacji (Grabowska- Joachimiak & Joachimiak 2002). W świetle dotychczasowych badań, najbardziej zaawansowany etap ewolucji chromosomów płci u roślin reprezentuje Rumex acetosa. Chromosomy Y (Y1 i Y2) u tego gatunku zbudowane są w dużej mierze z wysokorepetytywnych tandemowych sekwencji DNA, zorganizowanych w heterochromatynowe bloki (Ruiz-Rejon et al. 1994; Shibata et al. 1999; Mariotti et al. 2009; Navajas-Pérez et al. 2009a,b), co może sugerować ich znaczną degenerację, porównywalną do obserwowanej w świecie zwierząt. Kwestia degeneracji chromosomu Y na poziomie cytologicznym, w odniesieniu do konkretnych, badanych przeze mnie gatunków zostanie przeanalizowana w dalszej części niniejszego autoreferatu. Jak już wspomniałam, moja praca naukowa koncentruje się głównie wokół zagadnień dotyczących struktury i ewolucji chromosomów płci u roślin okrytozalążkowych. Należę do jedynej i bardzo nielicznej grupy badawczej w Polsce zajmującej się tego typu problematyką. Niedługo po podjęciu przeze mnie pracy w Katedrze Hodowli Roślin i Nasiennictwa, na Wydziale Rolniczym Akademii Rolniczej w Krakowie (obecnie Wydz. Rolniczo-Ekonomiczny UR), gdzie aktywnie uczestniczyłam w zorganizowaniu pracowni cytogenetyki roślin, rozpoczęłam badania nad budową kariotypu oraz strukturą chromosomów płci u dwóch dwupiennych przedstawicieli rodzaju Silene. Były to: S. latifolia oraz S. dioica, gatunki reprezentujące prosty system chromosomów płci XX/XY oraz determinację płci opartą na obecności aktywnego chromosomu Y. Otrzymane wyniki stanowiły podstawę mojej pracy doktorskiej i w zasadniczej części zostały opublikowane w Genome w 2002 r. Ich krótkie omówienie zamieszczono w pkt. 5 autoreferatu. Po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych w zakresie biologii, rozwijałam swoje zainteresowania roślinnymi chromosomami płci, a na obiekty badań wybrałam, biorąc między innymi pod uwagę profil uczelni na której pracuję, rośliny o znaczeniu użytkowym tj. dwa gatunki chmielu: chmiel zwyczajny Humulus lupulus (XX/XY) i ozdobny chmiel japoński Humulus japonicus (XX/XY1Y2), oraz Rumex acetosa (XX/XY1Y2), Rumex thyrsiflorus (XX/XY1Y2) i R. hastatulus (XX/XY oraz XX/XY1Y2). Ten ostatni, w odróżnieniu od R. thyrsiflorus, reprezentuje odrębną, słabo spokrewnioną z R. acetosa linię ewolucyjną i stanowi, ze względu na wykształcenie dwóch systemów chromosomów płci, wyjątkowo 8

interesujący obiekt badań. Oprócz szczawiu zwyczajnego R. acetosa, który podobnie jak Silene latifolia uznawany jest za gatunek modelowy, pozostałe z wymienionych należały do słabo zbadanych pod względem organizacji kariotypu i struktury chromosomów płci. W szczególności istniało niewiele informacji na temat strukturalnych właściwości polimorficznego systemu chromosomów płci XX/XY1Y2, który jak się sugeruje ma wtórny charakter i powstał z systemu XX/XY na drodze translokacji pomiędzy autosomami i chromosomami płci (Ohno 1967; Navajas-Pérez 2012). Stąd też przeprowadzenie analiz cytogenetycznych u blisko spokrewnionych gatunków (H. lupulus i H. japonicus) lub odmian (dwie rasy chromosomowe R. hastatulus) charakteryzujących się występowaniem obydwu systemów chromosomów płci (XX/XY oraz XX/XY1Y2) wydawało mi się szczególnie interesujące i pożądane. Realizacja zaplanowanych badań wiązała się z opracowaniem i stosowaniem różnorakich zabiegów agrotechnicznych, umożliwiających uprawę roślin stanowiących materiał badawczy na poletkach doświadczalnych i w warunkach szklarniowych. Szczególnie w przypadku chmielu zwyczajnego i amerykańskiego gatunku szczawiu R. hastatulus okazało się to trudne i wymagało długiego czasu od podjęcia tematu do rozpoczęcia właściwych analiz cytogenetycznych. Na podstawie uzyskanych wyników przygotowano cykl oryginalnych prac twórczych, które przedstawiam tutaj jako osiągnięcie naukowe, wymagane przy ubieganiu się o stopień doktora habilitowanego. Podstawowe zamierzenia i cele badań, których wyniki stanowią osiągnięcie naukowe wnioskodawcy Nadrzędnym zamierzeniem, którym kierowałam się w trakcie realizowanych przeze mnie badań było poznanie cytogenetycznych właściwości złożonego systemu chromosomów płci (XX/XY1Y2) u Angiospermae. W swoich badaniach zwróciłam szczególną uwagę na mechanizmy prowadzące do jego powstania i dalszego różnicowania się. Obydwa zagadnienia były słabo poznane, np. rearanżacje chromosomów, prowadzące do przekształcenia systemu prostego (XX/XY) w system złożony XX/XY1Y2 były jedynie postulowane, nigdy jednak nie przedstawiono przekonywujących dowodów na ich zajście. 9

Brakowało też jakichkolwiek informacji, czy ewentualnym rearanżacjom towarzyszyły zmiany w ilości jądrowego DNA. Szczególnie interesujące było sprawdzenie, czy nagromadzenie heterochromatyny w chromosomach Y u gatunków należących do grupy R. acetosa jest zjawiskiem wyjątkowym, czy też stanowi specyficzną właściwość systemu XX/XY1Y2. W tym celu należało wziąć pod uwagę wszystkie taksony Angiospermae, u których niezależnie wyewoluował ten system, a więc, poza przedstawicielem grupy R. acetosa, także H. japonicus i R. hastatulus. Próbowałam też znaleźć odpowiedź na pytanie, czy procesy mikroewolucyjne, (a więc zachodzące w stosunkowo krótkim czasie) mogą doprowadzić do wykrywalnych na poziomie cytologicznym zmian w budowie chromosomów płci u bardzo blisko spokrewnionych ze sobą gatunków. Realizacji tego zamierzenia posłużyły następujące cele szczegółowe: A) Porównanie ogólnej struktury kariotypu oraz określenie wielkości genomu u męskich i żeńskich osobników chmielu japońskiego Humulus japonicus (system XX/XY1Y2) oraz chmielu zwyczajnego Humulus lupulus (system XX/XY), B) analiza budowy kompleksu chromosomowego H. japonicus (ilość i lokalizacja heterochromatyny, FISH z wybranymi sekwencjami), umożliwiająca znalezienie cytologicznych markerów chromosomów płci oraz ewentualnych śladów rearanżacji chromosomowych które ukształtowały genom tej rośliny, C) poszukiwanie różnic (i/lub podobieństw) w strukturze autosomów i chromosomów płci oraz w budowie męsko-specyficznych sekwencji powtórkowych u dwóch blisko spokrewnionych ze sobą przedstawicieli sekcji Acetosa w rodzaju Rumex posiadających system XX/XY1Y2: Rumex thyrsiflorus i gatunku modelowego Rumex acetosa, D) dokładna analiza budowy kariotypu u różniących się systemem chromosomów płci cytotypów R. hastatulus, mająca nas celu wyjaśnienie, w jaki sposób doszło do przekształcenia systemu XX/XY w system XX/XY1Y2 u tego gatunku. Humulus lupulus i najbliżej z nim spokrewniony H. japonicus należą do rodziny konopiowatych Cannabaceae obejmującej dwa rodzaje: Humulus (chmiel) oraz Cannabis (konopie) - jedynej rodziny wśród okrytozalążkowych, której wszyscy przedstawiciele to rośliny dwupienne posiadające heteromorficzne chromosomy płci. Biorąc pod uwagę 10

wartość użytkową, zarówno chmiel zwyczajny jak i konopie siewne (C. sativa) przez lata spotykały się ze znacznie większym zainteresowaniem badaczy niż chmiel japoński, który w Europie uprawiany jest jedynie ze względu na swoje walory dekoracyjne jako ozdobne pnącze. Informacje na temat organizacji kariotypu, a w szczególności struktury chromosomów płci u tego gatunku były bardzo skąpe. Wiadomo było, że w przeciwieństwie do H. lupulus i C. sativa (system XX/XY i 2n=20 dla obydwu płci) reprezentuje on złożony system chromosomów płci - XX/XY1Y2 i charakteryzuje się odmienną (niższą) somatyczną liczbą chromosomów wynoszącą 2n=16 (14A + XX) u osobników żeńskich oraz 2n=17 (14A + XY1Y2) u męskich (Jacobsen 1957; Parker 1990; Parker & Clark 1991; Sakamoto et al. 1998; Shephard et al. 1999, 2000; Karlov et al. 2003). Brakowało natomiast jakichkolwiek danych porównawczych na temat wielkości kompleksu chromosomowego i ilości DNA u obydwu gatunków Humulus. Dane tego typu były niezbędne dla rozstrzygnięcia, czy różnicowaniu się kariotypu H. japonicus (redukcji liczby chromosomów i zmianie systemu chromosomów płci) towarzyszyła eliminacja części materiału chromosomowego, czy też powstał on wskutek prostej jego reorganizacji (fuzji chromosomowych). Nie było także informacji na temat różnic w ilości DNA pomiędzy osobnikami męskimi i żeńskimi, które przy braku molekularnych markerów płci mogłyby ułatwić szybką diagnostykę płci u tych roślin. Diagnostyka tego typu byłaby szczególnie przydatna w przypadku chmielu zwyczajnego, ponieważ z plantacji uprawnych eliminuje się osobniki męskie ze względu na znaczne obniżenie wielkości i jakości plonów szyszek chmielowych spowodowane przypadkowymi przepyleniami. Wczesna możliwość rozpoznania roślin męskich, zanim jeszcze osiągną zdolność do kwitnienia, ułatwiła by hodowlę i uprawę tego gatunku. W pierwszej z prac wchodzących w skład mojego osiągnięcia [poz. 4b.1] odniosłam się do tych właśnie nierozstrzygniętych zagadnień. W ramach badań przeprowadzono klasyczną analizę kariotypu, uwzględniającą pomiary chromosomów barwionych konwencjonalnie metodą Feulgena oraz we współpracy z prof. Elwirą Śliwińską (Katedra Genetyki, Fizjologii i Biotechnologii Roślin; Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy w Bydgoszczy) wykonano pomiary ilości jądrowego DNA metodą cytometrii przepływowej. Analizą objęto wybrane okazy dwóch botanicznych odmian Humulus lupulus: euopejskiej H. lupulus var. lupulus (osobniki żeńskie pochodziły z kolekcji IUNG w Puławach, męskie z populacji naturalnej) i amerykańskiej H. lupulus. var. neomexicanus (żeńskie osobniki pochodzące z kolekcji IUNG w Puławach), jak również męskie i żeńskie okazy H. japonicus (odmiana komercyjna). 11

Na podstawie uzyskanych wyników wykryto różnice w wielkości (długości) podstawowego żeńskiego (A+X) kompleksu chromosomów oraz w ilości jądrowego DNA pomiędzy analizowanymi odmianami H. lupulus (2n=20), nie stwierdzając równocześnie zasadniczych różnic w morfologii chromosomów (w strukturze ich kompleksów chromosomowych). Względna długość poszczególnych chromosomów (wyrażona jako % całkowitej długości podstawowego żeńskiego kompleksu chromosomów - A+X) była u obydwu odmian zbliżona. Ponadto ustalono, że względna różnica w wielkości (długości) męskiego (A+Y) i żeńskiego (A+X) kompleksu chromosomów u H. lupulus var. lupulus wynosząca 3,24% (na poziomie diploidalnym 1,62%), jak też różnica w ilości 2C DNA = 0,075 pg, (1,34%) pomiędzy męskimi i żeńskimi osobnikami jest nieznaczna i wynika z różnicy w długości pomiędzy chromosomem X, zidentyfikowanym przeze mnie jako piąty chromosom w kompleksie, a najmniejszym chromosomem Y (2,3 µm vs. 1,76 µm). U drugiego z analizowanych gatunków chmielu, czyli u H. japonicus stwierdziłam 14,5% (na poziomie diploidalnym 7,26%) różnicę długości pomiędzy męskim (A+Y1Y2), a żeńskim (A+X) podstawowym kompleksem chromosomowym, wynikającą niewątpliwie z obecności u osobników męskich dwóch dużych rozmiarów chromosomów Y. Względna różnica w zawartości jądrowego DNA pomiędzy męskimi i żeńskimi okazami wynosiła 9,79%. Chmiel japoński w stosunku do badanych odmian chmielu zwyczajnego charakteryzował się nie tylko krótszym podstawowym kompleksem chromosomów, ale też wyraźnie niższą zawartością 2C DNA. Biorąc pod uwagę odmienne systemy chromosomów płci (XX/XY u H. lupulus i XX/XY1Y2 u H. japonicus) oraz różnice w długości chromosomów płci u obydwu gatunków chmielu, zawartość jądrowego DNA określono w odniesieniu do pojedynczego żeńskiego kompleksu chromosomów (A+X). Uzyskane wyniki (2C DNA = 2,799 pg u H. lupulus var. lupulus; 3,032 pg u H. lupulus var. neomexicanus oraz 1,604 pg u H. japonicus) dostarczyły dowodu na to, że różnicowanie się kariotypu u H. lupulus i H. japonicus (2n=20 vs. 2n=16/17) było procesem polegającym nie tylko na prostej reorganizacji materiału chromosomowego, ale związanym z wyraźną eliminacją jądrowego DNA. W pracy tej ustalono także, że u triploidalnego chmielu zwyczajnego nie dochodzi do żadnych zmian ilości DNA w genomie, co jest zjawiskiem rzadkim, ponieważ u większości roślin poliploidyzacji towarzyszy eliminacja DNA, przez co genomy tych roślin są zwykle mniejsze niż genomy wyjściowych diploidów (zjawisko genome downsizing ). Praca była cytowana nie tylko przez autorów zainteresowanych genetyką Humulus, ale i zajmujących się ewolucją chromosomów płci u roślin. 12

Wyniki przedstawione powyżej stały się dla mnie impulsem do kontynuowania badań nad chmielem, a dokładniej nad chmielem japońskim. Brak informacji na temat struktury wewnętrznej chromosomów płci u tego gatunku oraz trudności z jakimi zetknęłam się podczas konwencjonalnej analizy kariotypu, związane z identyfikacją chromosomów X, Y1, Y2 w obrębie kompleksu, skłoniły mnie do podjęcia analiz zmierzających do szczegółowej charakterystyki chromosomów H. japonicus z wykorzystaniem różnicowego barwienia chromatyny oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami 5S i 45S rdna. Obiecujące wydawało mi się również wykorzystanie FISH z sondą na sekwencje telomeryczne w celu ujawnienia śladów ewentualnych fuzji chromosomowych, które mogły doprowadzić u chmielu japońskiego do redukcji liczby chromosomów (2n=16/17) w trakcie ewolucji z kariotypu wyjściowego (2n=20). Wyniki przeprowadzonych w tym zakresie badań zostały opublikowane w pracy Grabowska-Joachimiak et al. 2011 [poz. 4b.2]. Dokładną analizę struktury kariotypu H. japonicus w głównej mierze umożliwiła zastosowana przeze mnie metoda różnicowego barwienia chromosomów C-banding/DAPI, która ujawniła dystrybucję segmentów chromatyny zbudowanej z repetytywnych sekwencji DNA, bogatych w pary A-T. Segmenty te rozmieszczone były głównie terminalnie, z wyjątkiem autosomów pary 3 (przycentromerowo) i autosomów pary 7 (interkalarnie, w obrębie obydwu ramion). Szczególnie korzystne okazało się zastosowanie ww. metody w odniesieniu do chromosomów płci. Chromosomy te (X, Y1, Y2), chociaż największe w kompleksie, są u chmielu japońskiego, ze względu na duże podobieństwo morfologiczne, bardzo trudne do odróżnienia zarówno między sobą jak i od pary najdłuższych autosomów. Analiza rozmieszczenia DAPI-pozytywnych segmentów wykazała, że każdy z chromosomów płci posiada odmienny wzór prążkowy, umożliwiający ich identyfikację. Silnie fluoryzujące prążki zlokalizowane były subtelomerycznie: na końcu jednego ramienia chromosomu X oraz na końcach obydwu ramion chromosomu Y1. Chromosom Y2 był natomiast ich pozbawiony. Alexandrov i współpracownicy (2012), odnieśli się do przedstawionych tu wyników barwienia met. C-banding/DAPI i stosując fluorescencyjną hybrydyzację in situ, odkryli w obrębie wyznaczonych subtelomerycznych, DAPI-pozytywnych segmentów występowanie wysokorepetytywnych sekwencji HJSR (udział par AT=63,4%). Prowadząc obserwacje mikroskopowe wybarwionych różnicowo męskich płytek metafazowych u H. japonicus, zwróciłam ponadto uwagę na silniejszą fluorescencję męskich chromosomów płci (Y1 i Y2), 13

co następnie potwierdziłam przeprowadzając pomiary densytometryczne. Silniejsza fluorescencja chromosomów Y nie tylko ułatwia ich identyfikację w preparatach cytologicznych, ale przede wszystkim świadczy o nagromadzeniu w ich obrębie powtarzalnych sekwencji DNA bogatych w pary A-T. Sekwencje te w odróżnieniu jednak od sytuacji opisanej u modelowego gatunku Rumex acetosa oraz u kilku innych przedstawicieli Rumex z systemem XX/XY1Y2 (Shibata et al. 1999, 2000; Mariotti et al. 2009; Navajas-Pérez et al. 2009a,b) nie formowały u H. japonicus wyraźnie wyodrębnionych, dużych bloków hetrochromatynowych, ale były rozproszone na całej długości męskich chromosomów płci. Uzyskany wynik świadczący o wzbogaceniu chromosomów Y u tego gatunku w repetytywne sekwencje DNA dostarczył pierwszych danych na temat cytologicznych przejawów ich degeneracji. Wykorzystana w omawianych badaniach kariotypu fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (przeprowadzona we współpracy z dr Magdaleną Mosiołek z Gregor Mendel Institute w Wiedniu) ujawniła u chmielu japońskiego obecność sekwencji 5S rdna na jednej (7) parze autosomów, 45S DNA na dwóch parach (5 i 6) oraz typowo zlokalizowane sekwencje telomeryczne. Co interesujące, telomeryczne sygnały zaobserwowałam również w obrębie dłuższych ramion jednej pary dużych autosomów. Taka lokalizacja sekwencji telomerycznych potwierdziła udział fuzji chromosomowych w powstaniu kariotypu H. japonicus i umożliwiła zaproponowanie koncepcji, wyjaśniającej w jaki sposób doszło do redukcji liczby chromosomów i wykształcenia systemu XX/XY1Y2 u tego gatunku. Zasugerowano, że mógł on powstać z systemu XX/XY na drodze translokacji jednego z autosomów na chromosom X: pierwotny chromosom Y stał się chromosomem Y1, podczas gdy drugi (nietranslokowany) autosom stał się chromosomem Y2 (neo-y). Zmianom tym towarzyszyła dodatkowo fuzja dwóch autosomów (której śladem są interstycjalnie zlokalizowane sekwencje telomeryczne), co w sumie doprowadziło do redukcji liczby autosomów z 18 do 14. Wszystkie przedstawione wyżej wyniki były całkiem nowe dla nauki i były cytowane przez autorów zajmujących się problematyką ewolucji chromosomów płci u roślin. Mimo iż po raz pierwszy wykazano cytologiczną degenerację chromosomów Y u H. japonicus, dowiedziono zajścia rearanżacji chromosomowych, zidentyfikowano chromosomy płci (a nawet poszczególne ich ramiona) i dokładniej scharakteryzowano budowę kariotypu tego gatunku, nie udało się przedstawić bezdyskusyjnych dowodów na translokację autosomu na chromosom X, kluczowych dla 14

ostatecznego wyjaśnienia szczegółów przekształcenia systemu XX/XY w system XX/XY1Y2 u Humulus. Kolejny etap prowadzonych przeze mnie badań dotyczył dwóch dwupiennych, posiadających heteromorficzne chromosomy płci gatunków szczawiu: Rumex thyrsiflorus oraz R. hastatulus, a uzyskane wyniki zostały opublikowane w dwóch pracach - [poz. 4b. 3-4]. Badania realizowano w ramach projektu MNiSW/NCN nr N N303 598139 [wykaz poz. II I5], którego byłam kierownikiem. W liczącym około 200 przedstawicieli rodzaju Rumex (obejmującym 4 podrodzaje: Rumex, Acetosella, Platypodium i Acetosa) występują gatunki hermafrodytyczne oraz gatunki poligamiczne, żeńskodwupienne i dwupienne, reprezentujące różne stadia rozdzielnopłciowości. Dwupienność pojawiła się tu ok. 15-16 milionów lat temu, a dwupienne gatunki posiadające heteromorficzne chromosomy płci należą do podrodzaju Acetosella oraz podrodzaju Acetosa, podzielonego na dwie sekcje: Acetosa i Americanae (Navajas-Pérez et al. 2005a). Sugeruje się, że złożony system chromosomów płci XX/XY1Y2 w rodzaju Rumex, występujący u gatunków z podrodzaju Acetosa pojawił się dwukrotnie i niezależnie: u europejskich przedstawicieli z sekcji Acetosa oraz u Rumex hastatulus - przedstawiciela sekcji Americanae (Navajas-Pérez et al. 2005a; Navajas-Pérez 2012). Na podstawie badań filogenetycznych, prowadzonych w oparciu o analizę jądrowego i chloroplastowego DNA (Navajas-Pérez et al. 2005a) stwierdzono, że wśród dwupiennych gatunków szczawiu posiadających chromosomy płci można wyróżnić dwie monofiletyczne grupy: 1) obejmującą starsze ewolucyjnie gatunki z systemem chromosomów płci XX/XY, u których płeć męska determinowana jest przez chromosom Y np. R. suffruticosus, x=8; R. acetosella, x=7; 2) skupiającą gatunki młodsze ewolucyjnie z systemem chromosomów płci XX/XY1Y2 np. R. acetosa i inne gatunki z sekcji Acetosa (x=7), z determinacją płci zależną od wartości stosunku X:A. Rozdział pomiędzy nimi nastąpił prawdopodobnie przed 12-13 milionami lat (Navajas-Pérez et al. 2005a, Cuñado et al. 2007; Navajas-Pérez 2012). Szczególną pozycję w tym systemie zajmuje R. hastatulus, gatunek reprezentowany przez dwa cytotypy (rasy chromosomowe): Texas z systemem XX/XY (x=5) i North Carolina z systemem XX/XY1Y2 (x=4) (Smith 1964; Navajas-Pérez 2012). Według Navajas-Pérez i współpracowników (2005a, 2009b) ewolucja podstawowej liczby chromosomów w rodzaju 15

Rumex, przebiegała od ancestralnej x=10 (pierwotna liczba chromosomów typowa dla gatunków hermafrodytycznych i poligamicznych) do x=7 (liczba występująca u większości gatunków dwupiennych), z przejściowym stadium x=9 (gatunki żeńskodwupienne i niektóre poligamiczne) oraz x=8 (R. suffruticosus). Do skrajnej jej redukcji doszło właśnie u R. hastatulus (cytotyp North Carolina, x=4). Od kilkunastu lat rodzaj Rumex uznawany jest za doskonały obiekt badań nad powstaniem i ewolucją rozdzielnopłciowości, systemów chromosomów płci oraz systemów determinacji płci u roślin. Dokładne poznanie struktury kariotypu u wszystkich dwupiennych przedstawicieli Rumex, stanowi podstawowy kierunek tego typu analiz. Niewątpliwie najlepiej poznanym w rodzaju Rumex, modelowym gatunkiem w badaniach budowy i ewolucji chromosomów płci u roślin jest szczaw zwyczajny R. acetosa. Badania porównawcze, polegające na analizie różnic w organizacji kariotypu oraz różnic w budowie chromosomów płci pomiędzy R. acetosa, a innymi gatunkami Rumex stanowią w ostatnim czasie trzon badań nad ewolucją złożonego systemu chromosomów płci u Angiospermae (Navajas-Pérez et al. 2005a, 2006, 2009a; Cunado et al. 2007; Mariotti et al. 2009; Navajas- Pérez 2012). Dotychczasowe analizy prowadzone w tym kierunku, dotyczyły jak do tej pory bliskich, ale wyraźnie odrębnych w odniesieniu do R. acetosa gatunków. Brakowało natomiast danych na temat kariotypu form mu filogenetycznie najbliższych, należących do sekcji Acetosa jak np. R. thyrsiflorus, ale też taksonów znacznie oddalonych, z siostrzanej do Acetosa sekcji Americanae (np. R. hastatulus). Dla uzyskania pełniejszego wglądu w ewolucję kariotypu i systemu XX/XY1Y2 w obrębie tego rodzaju, konieczne było więc uzupełnienie wiedzy na ten temat u kolejnych jego przedstawicieli. Rumex thyrsiflorus i R. hastatulus, które wybrałam jako obiekty analiz cytogenetycznych, były bardzo słabo poznane pod względem struktury chromosomów. Poza informacjami na temat ogólnych cech ich kariotypu (liczba i morfologia chromosomów), uzyskanymi w latach 60-tych, 70-tych i 80- tych ubiegłego wieku (Żuk 1963, 1969, 1970a,b; Smith 1963, 1964; Bartkowiak 1971; Wilby & Parker 1988), dane na temat szczegółów budowy ich autosomów i chromosomów płci nie były dostępne. Rumex thyrsiflorus, czyli szczaw rozpierzchły posiada podobnie jak szczaw zwyczajny R. acetosa, złożony system chromosomów płci XX/XY1Y2 oraz tę samą somatyczną liczbę chromosomów: u osobników męskich 2n=15 (12A+XY1Y2), u żeńskich natomiast 2n=14 (12A+XX). Jest on jednym z najbliższych krewnych R. acetosa i ze względu na znaczne 16

podobieństwo morfologiczne bywa z nim mylony. Niezwykle przydatne mogło więc okazać się znalezienie dla R. thyrsiflorus chromosomowych i molekularnych gatunkowospecyficznych markerów, ułatwiających badania taksonomiczne, populacyjne i ewolucyjne. Stało się to głównym założeniem zaplanowanych przeze mnie badań, których rezultaty zaprezentowano w pracy Grabowska-Joachimiak et al. 2012 [poz. 4b.3]. Poza klasycznym barwieniem chromosomów R. thyrsiflorus z użyciem orceiny octowej zastosowałam dwie metody różnicowego, fluorescencyjnego barwienia chromosomów: C- banding/dapi oraz CMA 3 /DA/DAPI. Metody te, nie stosowane wcześniej w odniesieniu do tego gatunku umożliwiły dokładną analizę jego kompleksu chromosomowego i opracowanie kariotypu prążkowego. Wyniki analizy porównano zarówno z oryginalnymi, jak i wcześniejszymi danymi dotyczącymi struktury kompleksu chromosomowego R. acetosa, jako gatunku modelowego w badaniach nad ewolucją złożonego systemu chromosomów płci u roślin. Barwienie różnicowe C-banding/DAPI ujawniło u R. thyrsiflorus lokalizację segmentów heterochromatyny wzbogaconej w pary A-T. Szereg takich wyraźnych, DAPI-pozytywnych segmentów było obecnych w obrębie ramion obydwu chromosomów Y (Y1, Y2), dając w preparatach efekt ich wzmożonej fluorescencji. Chromosom X charakteryzował się występowaniem słabiej fluoryzującego, niekiedy trudnego do zaobserwowania prążka w okolicy centromeru. DAPI-pozytywne segmenty zlokalizowane były interkalarnie na dłuższych ramionach atosomów pary 2 oraz przy końcu krótszych ramion autosomów pary 1 i 6. Metodę CMA 3 /DA/DAPI wykorzystano głównie dla łatwiejszej identyfikacji poszczególnych chromosomów R. thyrsiflorus oraz w celu określenia lokalizacji segmentów chromatyny bogatej w pary G-C, pozytywnie barwiącej się chromomycyną A3 (CMA3). W tym przypadku, obecność jasno fluoryzujących prążków obserwowano zawsze w rejonach satelitów 2 i 5 pary autosomów, jak również interstycjalnie na dłuższych ramionach 4 pary autosomów. Odpowiadały one obszarom występowania sekwencji rdna. Analiza porównawcza wykazała duże podobieństwo w strukturze chromosomów płci szczawiu rozpierzchłego i szczawiu zwyczajnego oraz niewielkie różnice w budowie ich kompleksów autosomalnych. Uzyskane rezultaty sugerują, iż odziedziczone po wspólnym przodku chromosomy płci nie uległy u tych gatunków zmianom (na poziomie cytologicznym), chociaż mikroewolucji i specjacji towarzyszyły drobne (szczegółowo przeze mnie scharakteryzowane) zmiany w obrębie autosomów. Generalnie, stwierdzono występowanie większej liczby C- banding/dapi i CMA3-pozytywnych prążków w obrębie autosomów R. thyrsiflorus. 17

Najbardziej uderzająca, najważniejsza różnica dotyczyła ostatniej, najmniejszej pary autosomów. U R. thyrsiflorus wyposażona była ona zawsze w duży, DAPI-pozytywny segment heterochromatyny na końcu krótszego ramienia. Obecność tego segmentu powodowała, że ramię to było wyraźnie dłuższe niż odpowiadające mu ramię najmniejszego autosomu u analizowanych w celach porównawczych okazów R. acetosa. Ten dodatkowy strukturalny element w kariotypie R. thyrsiflorus może służyć jako chromosomowy marker ułatwiający odróżnienie obydwu porównywanych genomów. Jak wcześniej wspomniano (Wprowadzenie), wielu autorów uznaje chromosomy Y u R. acetosa za zheterochromatynizowane. Niestety, do tej pory nierozstrzygniętą kwestią pozostaje, czy budująca je heterochromatyna jest heterochromatyną konstytutywną, czy też fakultatywną (Żuk 1969; Lengerova & Vyskot 2001; Mosiołek et al. 2005). Jak dotąd bowiem nie udało się u Rumex acetosa (ani u żadnego z analizowanych przedstawicieli rodzaju) otrzymać pozytywnych wyników barwienia metodą prążków C (C-banding), która jest najbardziej uznaną metodą identyfikacji heterochromatyny konstytutywnej. Wiadomo natomiast z całą pewnością, że w obrębie obydwu chromosomów Y u szczawiu zwyczajnego występują rejony akumulacji tandemowych sekwencji repetytywnych zorganizowanych w heterochromatynowe bloki, wykazujące silną fluorescencję pod wpływem DAPI (Shibata et al. 1999, 2000; Navajas-Pérez et al. 2005b, 2006; Mariotti et al. 2009). Badania z zakresu cytogenetyki molekularnej, które u R. acetosa zapoczątkowali Shibata i współpracownicy (1999, 2000), wykazały, że opisane przez nich repetytywne sekwencje satelitarnego DNA: RAYSI i RAE180 lokują się właśnie w obrębie DAPI-pozytywnych prążków Y chromosomów u tego gatunku. Podobnie zlokalizowane są, opisane nieco później homologiczne do RAYSI męsko-specyficzne sekwencje RAYSII i RAYSIII. Stwierdzono, że Y-specyficzne sekwencje RAYS, jakkolwiek różnią się długością, mają wspólne pochodzenie, bowiem wszystkie wywodzą się od bazalnej sekwencji o długości 120 pz. Co interesujące, o ile sekwencje RAYSI i RAYSIII występują w obu Y chromosomach R. acetosa, o tyle sekwencja RAYSII o długości 700 pz występuje wyłącznie w chromosomie Y1 (Mariotti et al. 2009). Sekwencja RAE180 jest charakterystyczna nie tylko dla chromosomów Y, ale jej obecność stwierdzono również w obrębie jednej pary autosomów (Shibata et al. 2000; Cunado et al. 2007). Badania ujawniły podobną lokalizację wymienionych powyżej wysokorepetytywnych tandemowych sekwencji DNA także u innych gatunków Rumex z systemem XX/XY1Y2, z sekcji Acetosa (Cunado et al. 18

2007; Navajas-Pérez et al. 2006, 2009a,b). Dotychczasowe analizy wykazały ponadto, że o ile sekwencja RAE180 występuje u wszystkich, europejskich i amerykańskich dwupiennych przedstawicieli rodzaju Rumex (może więc być uznawana za filogenetyczny marker pojawienia dwupienności w obrębie całego rodzaju), to występowanie sekwencji RAYSI ograniczone jest wyłącznie do euroazjatyckich gatunków z systemem XX/XY1Y2 (jej powstanie wiąże się z wyodrębnieniem tej linii ewolucyjnej) (Navajas-Pérez 2012). W omawianej pracy [poz. 4b.3], oprócz wyników analiz cytogenetycznych, przedstawiono także rezultaty analiz molekularnych przeprowadzonych u R. thyrsiflorus i R. acetosa we współpracy z dr Dagmarą Kwolek (Zakład Cytologii i Embriologii Roślin UJ). Wykryte na ich podstawie różnice pomiędzy obydwoma gatunkami dotyczyły budowy męsko-specyficznej powtórkowej sekwencji RAYSII, lokującej się w obrębie chromosomu Y1. Amplifikacja tej sekwencji z użyciem odpowiednich starterów ujawniła zgodnie z oczekiwaniami, obecność pojedynczego produktu (~700 pz) u męskich osobników R. acetosa, natomiast dwóch produktów (~600pz i ~700 pz) u męskich osobników R. thyrsiflorus. Obecność pojedynczego, dłuższego produktu (~700 pz) stwierdzono także u R. arifolius, drugiego z najbliżej spokrewnionych z R. acetosa gatunków. Sekwencjonowanie wykazało, że krótszy, obecny tylko u R. thyrsiflorus produkt amplifikacji różni się od dłuższych, wspólnych produktów dużym indelem o długości 110 pz, w pozycji 318-428. Fragment ten stanowić może marker molekularny bardzo przydatny w dalszych analizach nad różnicowaniem się chromosomów płci u R. thyrsiflorus oraz w badaniach nad mieszańcami pomiędzy R. thyrsiflorus i innymi gatunkami Rumex z sekcji Acetosa. Ostatnia z prac [poz. 4b.4], która zamyka cykl publikacji, stanowiących moje osiągnięcie naukowe, przedstawia wyniki badań nad Rumex hastatulus. Jest to endemiczny, północnoamerykański gatunek szczawiu, który jako jedyny wśród roślin dwupiennych posiadających heteromorficzne chromosomy płci, wykształcił dwa ich systemy prosty i złożony. System prosty jest typowy dla cytotypu Texas (T), u którego somatyczna liczba chromosomów dla obojga płci wynosi 10 (8A+XX/XY). System złożony XX/XY1Y2 występuje w cytotypie North Carolina (NC), z 2n=8 (6A+XX) u osobników żeńskich oraz 2n=9 (6A+XY1Y2) u męskich (Smith 1963, 1964). Według Navajas-Pérez et al. (2005a) złożony system chromosomów płci u tego gatunku, należącego do sekcji Americanae jest znacznie młodszy niż u R. acetosa i innych przedstawicieli sekcji Acetosa. Wyewoluował on z systemu XX/XY ok. 19

600,000 lat temu (Quesada del Bosque et al. 2011). Współwystępowanie dwóch różnych systemów chromosomów płci w obrębie jednego gatunku, jak również ich względnie młody wiek, stwarzają unikalną możliwość śledzenia wczesnych etapów ewolucji systemu XX/XY1Y2 u roślin. Warto tu nadmienić, że kwestia pochodzenie złożonego systemu chromosomów płci w rodzaju Rumex nie była do tej pory wyjaśniona. Istniały na ten temat różne (przeciwstawne) hipotezy, zakładające powstanie systemu XX/XY1Y2 na drodze translokacji pomiędzy autosomami i chromosomami płci (Smith 1964) lub też na skutek podziału (w centromerze) pierwotnego (ancestralnego) chromosomu Y (Ruiz-Rejon et al. 1994). Przeprowadzone analizy filogenetyczne i molekularne nie przyniosły jednoznacznej odpowiedzi, która z tych koncepcji jest właściwa. Zadawalające rozwiązanie tej kwestii w przypadku gatunków z grupy R. acetosa może się nie udać, głównie z tego powodu, że brak dziś w tej grupie gatunku z prostym, a więc wyjściowym systemem XX/XY, który mógłby stanowić materiał porównawczy w tego typu badaniach. Gatunek taki należy więc uznać za wymarły, a co za tym idzie, nie jesteśmy w stanie nawet stwierdzić, jaką posiadał liczbę chromosomów. W przypadku R. hastatulus, w związku z redukcją liczby chromosomów w cytotypie North Carolina (XX/XY1Y2, 2n=9/8; x=4) oraz obecności cytotypu Texas (XX/XY, 2n=10, x=5), pierwsza z hipotez jest nie tylko bardziej prawdopodobna, ale i możliwa do sprawdzenia. Smith (1964) opierając się na pomiarach klasycznie barwionych chromosomów u przedstawicieli obydwu ras chromosomowych tego gatunku zasugerował, że system złożony w cytotypie North Carolina powstał z wyjściowego systemu XX/XY (występującego w cytotypie Texas) na skutek dwóch sukcesywnych translokacji pomiędzy chromosomami płci X i Y a parą małych autosomów. Nieliczne badania cytogenetyczne R. hastatulus, polegające głównie na konwencjonalnej analizie kariotypu nie dostarczyły jednak rozstrzygających dowodów na poparcie tej hipotezy. Prowadzone w ostatnich latach badania molekularne u przedstawicieli rodzaju Rumex, dotyczące lokalizacji wysokorepetywnej, męsko-specyficznej sekwencji RAYSI wykazały, że w przeciwieństwie do wszystkich innych gatunków z systemem XX/XY1Y2, nie jest ona obecna w chromosomach Y u R. hastatulus. Co więcej, chromosomy te są również kompletnie pozbawione sekwencji RAE180, której występowanie jest u tego gatunku ograniczone jedynie do autosomów. Jak podają Quesada del Bosque i współpracownicy (2011) oraz Navajas-Pérez (2012), brak akumulacji sekwencji satelitarnego DNA oraz brak DAPI- 20

pozytywnych, heterochromatynowych regionów w obrębie chromosomów Y u R. hastatulus świadczą o ich euchromatynowym charakterze. Próba określenia rearanżacji chromosomowych, które mogły doprowadzić u R. hastatulus do powstania złożonego systemu XX/XY1Y2 oraz zweryfikowanie wcześniejszych (bardzo słabo udokumentowanych) doniesień o braku cytologicznych objawów degeneracji chromosomów Y u tego gatunku, były główną intencją podjętych przeze mnie badań. Szczegółową analizę budowy kariotypu oraz struktury chromosomów płci u R. hastatulus (cytotyp Texas XX/XY i cytotyp North Carolina XX/XY1Y2) przeprowadzono z zastosowaniem metody C-banding/DAPI oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z sondami 5S oraz 35S rdna (we współpracy z dr Tomaszem Książczykiem z Instytutu Genetyki Roślin PAN w Poznaniu). Wstępną identyfikację płci badanych osobników oraz analizę, która obejmowała pomiary długości chromosomów, ustalenie położenia centromeru i wyróżnienie typów chromosomowych wykonano na preparatach barwionych błękitem toluidyny. U męskich i żeńskich okazów należących do obydwu ras chromosomowych dokonano także pomiarów ilości jądrowego DNA metodą cytometrii przepływowej. Badania te przyniosły wiele interesujących, zupełnie nowych wyników, które umożliwiły wyjaśnienie większości wyżej zarysowanych kwestii: - barwienie różnicowe z zastosowaniem met. C-banding/DAPI ujawniło wyraźne DAPIpozytywne segmenty heterochromatynowe, położone interstycjalnie w obrębie obydwu ramion chromosomu Y (cytotyp Texas). W przypadku cytotypu North Carolina, chromosom Y1 posiadał dwa duże interkalarne, A-T bogate segmenty rozlokowane po jednym na każdym z ramion, na chromosomie Y2 drobniejsze prążki tego typu były widoczne jedynie w obrębie dłuższego ramienia, - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z 5S i 35S rdna (double FISH) wykazała w rasie chromosomowej Texas występowanie sześciu sygnałów hybrydyzacyjnych na czterech małych autosomach (para 3 i 4): sekwencje 35S rdna zlokalizowane były na krótszych ramionach chromosomów pary 3 i 4, sekwencje 5S rdna w obrębie dłuższych ramion chromosomów pary 3. W rasie North Carolina zaobserwowano cztery miejsca hybrydyzacji: 35S rdna na dwóch najmniejszych autosomach (para 3), 5S rdna w obrębie krótszych ramion chromosomów płci (X oraz Y2), 21

- zróżnicowane wybarwienie chromosomów Y1 i Y2 oraz rozmieszczenie sekwencji 5S rdna znacznie ułatwiło odróżnienie chromosomów płci (oraz ich poszczególnych ramion) w cytotypie North Carolina, - względna różnica długości pomiędzy męskim, a żeńskim kompleksem chromosomów wynosiła na poziomie diploidalnym: 7.16% (cytotyp Texas), 8.10% (cytotyp North Carolina). Obydwie rasy różniły się jedynie nieznacznie zawartością jądrowego (2C) DNA w przypadku osobników męskich i żeńskich różnica ta była niewielka i bardzo zbliżona (3.5% oraz 3.4%). Analiza wyników C-banding/DAPI oraz FISH wykazała, że: W porównaniu z cytotypem Texas kompleks chromosomowy cytotypu North Carolina charakteryzuje się: brakiem dwóch autosomów (które zidentyfikowano jako trzecią parę autosomów rasy Texas), inkorporacją sekwencji 5S rdna w obręb chromosomów płci (X i Y2) oraz utratą dwóch loci 35S rdna. Należy podkreślić, że obecność sekwencji rdna, a w szczególności loci 5S rdna na chromosomach płci u roślin jest zjawiskiem wyjątkowym. Występowanie rdna (głównie 35S rdna) opisano dotychczas u Angiospermae jedynie w taksonach reprezentujących niezróżnicowane (homomorficzne) chromosomy płci tj. u Asparagus officinalis (Deng et al. 2012) i Spinacia oleracea (Lan et al. 2006) oraz u wątrobowca Marchantia polymorpha (Nakayama et al. 2001). We wszystkich tych przypadkach jednak rdna został odziedziczony po wyjściowej parze autosomów (nie znalazł się w chromosomach płci wskutek translokacji), a analogiczne sekwencje występują także w autosomach. Tak więc, dzięki przeprowadzonym badaniom, R. hastatulus okazał się nie tylko jedynym gatunkiem wśród roślin okrytozalążkowych z rdna zlokalizowanym w obrębie heteromoficznych chromosomów płci, ale i jedynym, u którego rdna uległ przeniesieniu z autosomów do chromosomów płci. W ten sposób, cały obecny w kariotypie tego gatunku 5S rdna znalazł się na chromosomach płci i wykształcił się zupełnie unikalny, genetycznie zbalansowany system, w którym zarówno okazy męskie jak i żeńskie zawierają skupienia sekwencji 5S rdna. Chromosomy Y u obydwu cytotypów R. hastatulus wykazują obecność DAPIpozytywnych segmentów heterochromatynowych. Rezultat ten przeczy wcześniejszym doniesieniom (Quesada del Bosque et al. 2011, Navajas- Perez 2012) o euchromatynowym charakterze chromosomów Y u tego gatunku, opartych 22