Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 6, zeszyt 4, 204-209, 2013 Wpływ modyfikacji procedury FISH na wynik oznaczenia amplifikacji genu HER2 w diagnostycznym materiale histopatologicznym ANNA MALICKA-DURCZAK 1, 2, KONSTANTY KORSKI 2 1, 2, 3, ANDRZEJ MARSZAŁEK Streszczenie Rak piersi jest najczęstszym nowotworem u kobiet. Rozwój onkologii oraz nowych metod diagnostycznych przyczynił się do określenie czynników mających wpływ na leczenie. Z tego też powodu przed zakładami patomorfologicznymi stanęło zadanie wiarygodnego określenia statusu HER2. W niektórych przypadkach ocena preparatów jest utrudniona, gdyż materiał nie jest reprezentatywny. Celem pracy była ocena wpływu modyfikacji metody FISH na wynik w trudnym diagnostycznie materiale histopatologicznym. Stwierdzono, że niektóre materiały histopatologiczne nie nadają się do oceny statusu HER2 z zastosowaniem standardowego protokołu FISH. W takich przypadkach należy do każdego materiału podejść indywidualnie. Zastosować odpowiednią modyfikację metody FISH, co prowadzi do uzyskania wyniku, a tym samym do określenia właściwego leczenia dla pacjenta. Stwierdzono również, że różnorakie czynniki, w tym utrwalenie, opracowanie materiału mają wpływ na dużą zmienność jakości materiału histopatologicznego. Słowa kluczowe: rak piersi, HER2, FISH Wstęp Rak piersi jest najczęstszym nowotworem u kobiet w Polsce, jak również w Europie i Stanach Zjednoczonych [1]. Rozwój onkologii, nowych metod diagnostycznych, w tym biologii molekularnej i postęp w leczeniu raka piersi, jaki dokonał się w ostatnim 15-leciu, przyczynił się do określenie czynników mających wpływ na leczenie. Oznaczenie statusu HER2 (nadekspresji receptora i/lub amplifikacji genu HER2 ) jest w raku piersi niezwykle ważne, z powodu korelacji tego czynnika z rokowaniem oraz przewidywaną odpowiedzią na leczenie hormonoterapii i chemioterapii [2, 3]. W praktyce najważniejszym uzasadnieniem dla oceny stanu HER2 jest możliwość stosowania w terapii trastuzumabu (herceptyna). Zakłada się, że u chorych na raka piersi z nadekspresją HER2, zaburzenie onkogenu odpowiedzialnego za produkcję tego receptora błonowego, tj. amplifikacja genu HER2, leży u podstaw karcinogenezy [4]. Autorzy wielu doniesień podają, że w około 25-30% przypadków raka piersi ilość białka receptorowego w komórkach nowotworowych jest wyraźnie większa (nawet kilkaset razy większa). Z tego też powodu przed zakładami patomorfologicznymi stanęło zadanie wiarygodnego określenia stanu HER2. Stan HER2 można określić oceniając ekspresję białka (receptora HER2) zlokalizowanego w błonie komórkowej lub amplifikację genu HER2, oceniając liczbę kopii genu HER2. Możliwa jest również ocena mrna, jak też uwolnionego białka receptorowego w surowicy krwi [5]. Standardowymi metodami oznaczania stanu HER2 według rekomendacji Amerykańskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (ASCO) od 2000 roku jest metoda immunohistochemiczna (IHC) z zastosowaniem przeciwciał mono- lub poliklonalnych oraz metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) [6]. Eksperci na Konferencji dotyczącej leczenia pierwotnego raka piersi w St Gallen w 2009 r. potwierdzili konieczność oznaczania statusu HER2 przy użyciu dwóch podstawowych metod: IHC i FISH, stosując kryteria przyjęte przez Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej (ASCO) i Kolegium Patologów Amerykańskich (CAP)[7]. Zalecono algorytm definiujący wartości dodatnie, niejednoznaczne i ujemne zarówno dla ekspresji białka HER2, jak i amplifikacji genu (ryc. 1) W przypadkach o stanie granicznym receptora HER2 (IHC score 2+) zalecana jest ocena metodą hybrydyzacji in situ (np. FISH, CISH, SISH). Istotą oceny tych metod jest policzenie kopii genu HER2 oraz liczby centromerów chromosomu 17, na którym gen HER2 jest położony. Stosunek pomiędzy tymi liczbami, tzw. wskaźnik ratio decyduje o wykazaniu obecności amplifikacji genu HER2 lub braku. Ocenę amplifikacji genu HER2 i jej interpretacji przedstawiono w tabeli 1. W przypadku metody CISH (chromogenicznej hybrydyzacji in situ) oznacza się jedynie liczbę kopii genu HER2, średnia liczba kopii tego genu powyżej 6 oznacza amplifikację (wynik pozytywny). 1 Zakład Patologii Nowotworów, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu 2 Wielkopolskie Centrum Onkologii, Poznań 3 Zakład Patomorfologii, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Bydgoszcz
Wpływ modyfikacji procedury FISH na oznaczenie amplifikacji genu HER2 w materiale histopatologicznym 205 Ryc. 1. Algorytm dla oceny badania IHC i FISH wg Wolffa i wsp. Wskaźnik ratio < 1,8 1,8-2,2 > 2,2 2,0 lub więcej w badaniu powtórnym metodą FISH Tabela 1. Ocena amplifikacji genu HER2 i interpretacja wyniku Obecność amplifikacji brak amplifikacji genu HER2 amplifikacja wątpliwa amplifikacja genu HER2 amplifikacja genu HER2 Interpretacja wyniku wynik negatywny wynik niejednoznaczny, graniczny (wymaga powtórnej oceny amplifikacji) wynik pozytywny wynik pozytywny Należy podkreślić, że dla uzyskania wiarygodnych rezultatów oznaczenia genu HER2 niezwykle ważna jest jakość uzyskanych preparatów dlatego też badania te powinien wykonywać wyszkolony i doświadczony diagnosta, wg standaryzowanej procedury. W niektórych przypadkach ocena preparatów jest utrudniona, materiał nie jest reprezentatywny. Celem pracy była ocena wpływu modyfikacji metody FISH na wynik w trudnym diagnostycznie materiale histopatologicznym. Materiał i metoda Materiał stanowiły bloczki histopatologiczne pochodzące od 78 pacjentek z rakiem piersi. We wszystkich przypadkach występował rak przewodowy naciekający. W 45 przypadkach materiał pochodził z biopsji gruboigłowej, a w 33 z resekcji narządu pobranego chirurgicznie. Wszystkie materiały według informacji z poszczególnych ośrodków miały być utrwalane za pomocą obojętnej, zbuforowanej formaliny i zatopione w parafinie. Materiały (bloczki parafinowe, w 10 przypadkach tylko szkiełka podstawowe z materiałem histopatologicznym) pochodził z zakładów patologii szpitali publicznych głównie z regionu wielkopolskiego oraz lubuskiego i zachodniopomorskiego. Metoda FISH z zastosowaniem Path Vysion HER2 DNA Probe Przeprowadzono badania amplifikacji genu HER2 z zastosowaniem procedury Path Vysion HER2 DNA Probe. Z wszystkich bloczków parafinowych wykonano skrawki o grubości 4-5 μm za pomocą rutynowych metod histopatologicznych i nałożono je na szkiełka podstawowe (Super Frost Plus). Badanie FISH przeprowadzono wg standardowego protokołu FISH dla HER2 zalecanego przez producenta tj. Abbott/Vysis. W skrócie procedura zakłada, aby tkanka poddana została działaniu enzymów proteolitycznych (proteinaza K), w celu strawienia białek budujących błonę komórkową, co uniemożliwia wniknięcie sondy DNA do wnętrza jąder komórkowych. Na odpowiednio przygotowaną tkankę nanosi się roztwór sondy DNA, składającej się z mieszaniny 2 sond molekularnych: jednej komplementarnej do genu HER2 i wyznakowanej fluorochromem Spectrum Orange, drugiej odpowiadającej sekwencji obszarowi centromeru chromosomu 17. i znakowana barwnikiem SpectrumGreen. Następnie preparaty poddaje się denaturacji i hybrydyzacji. Do identyfikacji jąder komórkowych stosuje się DAPI lub jodek propidyny (ryc. 2).
206 A. Malicka-Durczak, K. Korski, A. Marszałek Ryc. 2. Przykłady oznaczenia amplifikacji genu HER2 metodą FISH z zastosowaniem zestawu Path Vysion HER2 DNA Probe KIT, a) materiał nie do oceny (brak sygnałów pochodzących od genu HER2 oraz centromeru chromosomu 17), b) brak amplifikacji, c) amplifikacja genu HER2 Interpretacja przeprowadzona została z zastosowaniem zaleceń ASCO/CAP. Sygnały hybrydyzacji liczono w 40 jądrach komórkowych z każdego materiału. W niektórych przypadkach doliczano dodatkowo 20 jąder komórkowych ze względu na dużą heterogenność guzów. Ocenie poddano wyłącznie jądra z wyraźnie widoczną granicą. Nakładające się jądra nie zostały uwzględnione (liczone) [8, 9]. W przypadku materiałów niediagnostycznych w celu zwiększenia efektywność metody zastosowano następujące modyfikacje metody FISH: wydłużono czas wstępnego trawienia (Pretreatment Solution) do 40 min, wydłużono lub skrócono czas trawienia enzymatycznego proteinazą, podwyższono temperaturę denaturacji (76EC), obniżono temperaturę buforu posthybrydyzacyjnego, skrócone czasu inkubacji w buforze post-hybrydyzacyjnym. Wyniki Z ogólnej liczby 78 przypadków 10 materiałów nie nadawało się do ponownego wykonania oznaczenia statusu HER2 metodą FISH z modyfikacjami. W tej grupie 7 przypadków pochodziło z biopsji gruboigłowej, a w 3 przypadkach materiał pochodził z resekcji narządu pobranego chirurgicznie. Głównymi przyczynami niemożności wykonania oznaczenia były: niereprezentatywności materiału, brak materiału do oceny, brak utkania inwazyjnego guza, niewystarczająca liczba jąder komórkowych do oceny, autoliza materiału. Pozostała część materiałów pochodząca z 68 przypadków była odpowiednia do przeprowadzenia powtórnego oznaczenia amplifikacji genu HER2 metodą FISH z modyfikacjami. W 9 przypadkach zastosowano wydłużenie czasu wstępnego trawienia z 30 do 40 minut przy użyciu roztworu Pretreatment Solution. Zastosowanie tej modyfikacji nie przyczyniło się do uzyskania lepszych rezultatów w ocenie preparatów. Pomimo zmiany procedury preparaty nie nadawały się do oceny. W 18 przypadkach wydłużono czas trawieniu enzymatycznego stosując proteazę. Wprowadzono modyfikację polegającą na zastosowaniu 40-minutowego trawienia proteazą. W tej grupie po zastosowaniu modyfikacji preparaty z połowy przypadków nadawały się do oceny. W 3 przypadkach zastosowano skrócenie czasu trawienia tkanki. W tych przypadkach modyfikacja nie przyczyniła się do zwiększenia poprawy możliwości oceny preparatów. Podwyższenie temperatury denaturacji z 72 do 76EC wykonano w 15 przypadkach. Zastosowanie takiej modyfikacji nie doprowadziło do uzyskania większej liczby pozytywnych rezultatów. Warunki płukania pohybrydyzacyjnego zostały przetestowane poprzez: a) obniżenie temperatury buforu posthybrydyzacyjnego z 72E do 70EC (15 przypadków) oraz b) skrócenie czasu inkubacji w buforze posthybrydyzacyjnym z 5 minut do 3 minut (19 przypadków). Obniżenie temperatury przyczyniło się do poprawy uzyskanego wyniku w 4 przypadkach. Natomiast skrócenie czasu inkubacji zwiększyło intensywność sygnałów obserwowanych w mikroskopie fluorescencyjnym w 9 przypadkach. Szczegółowy rozkład przypadków z zastosowanie modyfikacji metodą FISH przedstawiono w tabeli 2. Stwierdzono, że przeprowadzone modyfikacje metody FISH przyczyniły się do uzyskania większej liczby oznaczeń pozwalających na właściwą ocenę głównie w przypadkach z materiałów pochodzących z resekcji chirurgicznej guza. Porównanie tych przypadków z materiałem pochodzących od pacjentów, u których wykonano biopsję gruboigłową, wykazało, że drobny materiał biopsji nie nadawał się do oceny. Porównanie wpływu modyfikacji na uzyskany wynik w zależności od użytego materiału histopatologicznego przedstawiono w tabeli 3. Ze względów proceduralnych i potrzeb diagnostycznych w 8 przypadkach do ponownej oceny amplifikacji genu HER2 uzyskano dodatkowy materiał, w postaci innego bloczka histopatologicznego pochodzącego z pierwotnego guza. Wykorzystanie dodatkowego materiału w 8 przypadkach pozwoliło na ocenę 5 z nich. Dyskusja W przypadku planowania wdrożenia terapii raka piersi niezwykle ważne jest oznaczenie amplifikacji genu HER2
Wpływ modyfikacji procedury FISH na oznaczenie amplifikacji genu HER2 w materiale histopatologicznym 207 Modyfikacje metody FISH Tabela 2. Rozkład przypadków z zastosowaniem modyfikacji metody FISH Ogólna liczba Biopsja gruboigłowa (45) Resekcja chirurgiczna guza (33) Materiał diagnostyczny oceniony Materiał niediagnostyczny nieoceniony Ogólna liczba Materiał diagnostyczny oceniony Materiał niediagnostyczny nieoceniony Wydłużenie czasu przedtrawienia (Pretreatment Solution) do 40 min. 5 0 5 4 0 4 Wydłużenie czasu trawienia enzymatycznego 8 3 5 10 6 4 Skrócenie czasu trawienia enzymatycznego 3 0 3 0 0 0 Podwyższenie temperatury denaturacji (76EC) 10 0 10 5 0 5 Obniżenie temperatury buforu post-hybrydyzacyjnego 8 1 7 7 3 4 Skrócenie czasu inkubacji w buforze post-hybrydyzacyjnym 10 4 6 9 5 4 Inna kostka 1 1 0 7 4 3 Tabela 3. Porównanie wpływu modyfikacji na wynik w zależności od materiału histopatologicznego Materiał po modyfikacji procedury FISH Biopsja gruboigłowa (45) (100%) Resekcja chirurgiczna guza (33) (100%) Materiał oceniony 9 (20%) 18 (54,5%) Materiał nieoceniony 29 (64,5%) 12 (36,5%) Mateirał nieoceniony (brak możliwości ) 7 (15,5%) 3 (9%) Inna kostka 1 4 i/lub nadekspresji białka, z powodu korelacji tych czynników z rokowaniem i przewidywaną odpowiedzią na leczenie. Znaczące korzyści, ale i wysoki koszt oraz możliwa kardiotoksyczność trastuzumabu sprawiają, że potrzebny jest dokładny i wiarygodny test służący do oceny statusu HER2 [8, 10]. Testem z wyboru służącym do oznaczania nadekspresji receptora HER2 jest badanie immunohistochemiczne. Badanie to powinno być wykonywane w laboratoriach, w których przestrzegane są standaryzowane procedury wykonywania testów diagnostycznych. Wszystkie przypadki o niejednoznacznym wyniku badania immunohistochemicznego powinny być weryfikowane poprzez ocenę amplifikacji genu wystandaryzowaną metodą FISH. Prawidłowo wykonany preparat metodą FISH powinien zawierać nienachodzące na siebie jądra komórek nowotworu inwazyjnego raka piersi, sygnały pochodzące z genu HER2 oraz sygnały pochodzące z obszaru centromeru chromosomu 17. W kilku przypadkach ocena nie była możliwa. Przyczyną był brak tkanki nowotworowej w bloczku parafinowym każde kolejne skrojenie zmniejsza jej zawartość. W niniejszej pracy stosując wystandaryzowaną procedurę FISH zalecaną przez producenta dla zestawu Path Vysion HER2 DNA Probe w części ocenionych przypadków nie uzyskano preparatów do oceny, lub materiał był trudny do oceny. Problem dotyczył głównie: słabo uwidocznionych jąder komórkowych, silnej autofluorescencji, bardzo słabych lub braku sygnałów pochodzących z genu HER2 oraz z obszaru centromeru chromosomu 17, braku możliwości policzenia sygnałów w 40 jądrach komórek raka gruczołu piersiowego. Z tego też powodu przeprowadzono powtórnie oznaczenie amplifikacji genu HER2 metodą FISH z modyfikacjami. Oznaczenie statusu HER2 metodą FISH uważane jest za dokładniejsze i bardziej miarodajne niż barwienie metodą immunohistochemiczną (podczas określania potencjalnych pacjentów do leczenia trastuzumabem) [11]. FISH jest metodą, w której zastosowany jest obiektywny system oceny wyników (stosunek liczby kopii genu HER2 do liczby kopii centromerów chromosomu 17. w jądrze komórki), co czyni wynik bardziej wiarygodnym niż to jest w przypadku subiektywnego określania wyniku uzyskanego metodą immunohistochemiczną. Tak samo jak w przypadku metody immunohistochemicznej, stosowanie metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ wiąże się z pewnymi ograniczeniami. Przyczyną trudności w ocenie preparatów oznaczanych metodą FISH mogą być: zbyt długi czas trawienia preparatu (komórki nadtrawione) lub zbyt krótki czas trawienia (komórki niedotrawione ) (ryc. 3), niespecyficzne wiązanie się sondy może być spowodowane niedostatecznym jej wypłukaniem, natomiast brak sygnałów pochodzących od genu HER2 czy centromerów chromosomu 17 może być wynikiem pozostawienia części komórki w bloczku, który był skrojony na mikrotomie w celu sporządzenia preparatu.
208 A. Malicka-Durczak, K. Korski, A. Marszałek Ryc. 3. Przykłady trudności interpretacji wyniku oznaczenia genu HER2 metodą FISH, a) materiał nadtrawiony, b) materiał niedotrawiony W przypadku czasu płukania pohybrydyzacyjnego zaobserwowano, że zwiększenie czasu płukania do 5 minut znacząco obniża jakość procesu w niektórych próbkach. W praktyce zauważa się, że różne czynniki mają wpływ na dużą zmienność jakości materiału. Kontrowersje budzą próby oceny ekspresji HER2 w materiałach niediagnostycznych. W innych przypadkach, które są trudne w ocenie, należy zadać pytanie, w jaki sposób optymalnie zmodyfikować warunki przeprowadzonego testu oznaczenia amplifikacji genu HER2. Uzyskane wyniki w przytoczonej pracy potwierdzają istotny związek pomiędzy właściwą obróbką histopatologiczną z guzów raka piersi a jakością uzyskanych preparatów wykonanych metodą FISH. Metodyka tworzenia preparatów histopatologicznych opiera się na sekwencji schematyzowanych działań przedlaboratoryjnych i laboratoryjnych. Mają one ogromny wpływ na jakość uzyskanych preparatów histopatologicznych oraz preparatów wykonywanych metodą FISH. Materiał z bloku operacyjnego do zakładu histopatologii powinien być dostarczony w czasie krótszym niż godzina, aby zapobiec wystąpieniu komórkowych zmian nekrotycznych, gniciu i degeneracji. Po pobraniu wycinek powinien trafić do płynu utrwalającego. Za uniwersalny utrwalacz uznawany jest powszechnie 10% roztwór formaliny w stosunku objętości 1 : 10 (1 objętość guza; 10 objętość formaliny) [8, 9]. Liczne firmy dostarczające odczynniki do celów diagnostycznych (Shandon, BioOptica, Thermo itp) oferują gotowy do użycia roztwór 10% formaliny do celów histopatologicznych lub koncentrat utrwalacza do rozcieńczenia. Inne utrwalacze mogą powodować degradację DNA i obecność dużego tła spowodowanego autofluorescencją w obrazie [12]. Na jakość uzyskanych preparatów ma wpływ nie tylko rodzaj użytego utrwalacza, ale również czas utrwalania materiału. Czas utrwalania zależy od rodzaju zastosowanego płynu, rodzaju tkanki oraz wielkości wycinka. Optymalny czas utrwalania materiału w formalinie wynosi od 6 do 48 godzin [8]. Przedłużone utrwalanie nie jest wskazane, może bowiem spowodować kruchość preparatu, konsekwencją zbyt krótkiego czasu jest natomiast nieprawidłowy obraz wielu struktur komórkowych. Oznacza to, że materiał powinien być opracowywany i wkładany do kasetek histopatologicznych najpóźniej na drugi dzień od umieszczenia go w pojemniku z buforowaną formaliną. Skrawki wkładane do kasetek nie powinny być grubsze niż 3 mm, tak aby ograniczyć zgniatanie skrawka w trakcie dalszej obróbki. Powinny zajmować nie więcej niż 2/3 światła kasetki, co zapewnia swobodny przepływ odczynników w trakcie przeprowadzania materiału w procesorze tkankowym. Zatapianie skrawków w oczyszczonej parafinie powinno odbywać się w optymalnej temperaturze: 56 do 58EC. W świetle przedstawionych powyżej danych należy zadać pytanie, czy wyżej wymienione wytyczne zawsze są spełnione? Poza materiałem tkankowym do badań metodą FISH może służyć także materiał cytologiczny z biopsji aspiracyjnych cienkoigłowych, utrwalony i zatopiony również w bloczkach parafinowych [12]. Standardowa grubość skrawków do badania FISH powinna wynosić 4-5 :m. Krojenie zbyt cienkich skrawków powoduje skrojenie jąder, a w rezultacie utratę DNA. Jądra, które mają średnicę mniejszą niż połowa przeciętnej średnicy jąder komórek nowotworowych, nie powinny podlegać interpretacji. Sygnały powinny być widoczne przynajmniej w 75% komórek. Liczenia sygnałów dokonuje się jedynie w jądrach nienachodzących na siebie, niezniszczonych o pełnych granicach. W przypadku guzów heterogennych zlicza się sygnały w komórkach pochodzących z różnych miejsc, a w szczególności miejsc o maksymalnej ekspresji. Ocena preparatów uzyskanych techniką FISH wymaga dużego doświadczenia w umiejętności odróżniania komórek nowotworowych od prawidłowych oraz komórek raka naciekającego i komórek raka przedinwazyjnego, a także umiejętności pomijania artefaktów [13]. Wyniki przedstawionych w obecnym opracowaniu badań przedstawiają wpływ przygotowania tkanki przed barwieniem na efekt oznaczenia amplifikacji genu HER2 metodą FISH. Niewłaściwe utrwalenie, płukanie, suszenie, ogrzewanie, krojenie preparatów lub zanieczyszczenie innymi tkankami bądź płynami może wpływać na hybrydyzację. Również różnice w przygotowaniu i opracowaniu materiału tkankowego (utrwalanie, zatapianie), a także czas jego przechowywania w różnych ośrodkach zakładów patologii, uniemożliwiają wiarygodną interpretację obra-
Wpływ modyfikacji procedury FISH na oznaczenie amplifikacji genu HER2 w materiale histopatologicznym 209 zów mikroskopowych. Utrudniona ocena preparatów może być spowodowana również dziedzicznymi nieprawidłowościami samej tkanki guza raka piersi. Wnioski 1) Istnieje możliwości uzyskania odpowiednich do oceny materiałów w przypadkach pierwotnie niediagnostycznych. 2) Najczęstszymi powodami braku możliwości oceny materiałów wykonanych metodą FISH jest niewłaściwe przygotowanie materiału na wstępnym etapie. 3) Wymagane jest wprowadzenie stałego przedlaboratoryjnego opracowania materiału. Piśmiennictwo [1] Krajowy Rejestr Nowotworów Raporty na podstawie danych Centrum Onkologii. 02.10.2013, http://85.128.14.124/krn [2] Reis-Filho J.S., Tutt A.N.J. (2008) Triple negative tumours: a critical review. Histopathology 52(1): 108-118. [3] Ross J.S., Slodkowska E.A., Symmans W.F. i wsp. (2009) The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti- HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 14(4): 320-368. [4] Leary A.F., Hanna W.M., van de Vijver M.J. i wsp. (2009) Value and limitations of measuring HER-2 extracellular domain in the serum of breast cancer patients. J. Clin. Oncol. 27(10): 1694-1705. [5] Monego G., Arena V., Maggiano N. i wsp. (2007) Borderline HER-2 breast cancer cases: histochemical versus real-time PCR analysis and impact of different cut-off values. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 67(4): 402-412. [6] Bast R.C., Ravdin P., Hayes D.F. i wsp. (2001) 2000 update of recommendations for the use of tumor markers in breast and colorectal cancer: clinical practice guidelines of the American Society of Clinical Oncology. J. Clin. Oncol. 19(6): 1865-1878. [7] Goldhirsch A., Ingle J.N., Gelber R.D. i wsp. (2009) Thresholds for therapies: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the primary therapy of early breast cancer 2009. Ann. Oncol. 20(8): 1319-1329. [8] Wolff A.C., Hammond M.E.H., Schwartz J.N. i wsp. (2007) American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J. Clin. Oncol. 25(1): 118-145. [9] Materiały informacyjne Path Vysion HER-2 DNA Probe 15.10.2013. http://www.abbottmolecular.com/us/products/ oncology/fish/breast-cancer-pathvysion-her2.html. [10] L. Harris, H. Fritsche, R. Menneli wsp. (2008) Aktualizacja zaleceń Amerykańskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (ASCO) na rok 2007 dotyczących stosowania markerów nowotworowych w raku piersi. J. Clin. Oncol. 4. [11] Gown A.M., Goldstein L.C., Barry T.S. i wsp. (2008) High concordance between immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization testing for HER2 status in breast cancer requires a normalized IHC scoring system. Mod. Pathol. 21(10): 1271-1277. [12] Hicks D.G., Tubbs R.R. (2005) Assessment of the HER2 status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization: a technical review with interpretive guidelines. Hum. Pathol. 36(3): 250-261. [13] Krasińska L., Jassem J. (2003) Kliniczne znaczenie zaburzeń HER2 w raku piersi z uwzględnieniem metod ich oznaczania. Nowotwory 53: 68-73. J Anna Malicka-Durczak Zakład Patologii Nowotworów Wielkopolskie Centrum Onkologii ul. Garbary 15, 61-866 Poznań e-mail: anna.malicka@wco.pl The effects of modification to the FISH procedure in the assessment of HER2 gene amplification in histopathological diagnostics material Breast cancer is the most common malignancy among women. Developments in oncology and new diagnostic methods have led to the identification of factors affecting further treatment. Because of this, histopathology departments are faced with the task of reliably assessing the status of the HER2. In some cases, the assessment is made more problematic by poor representativeness of the tested material. The purpose of this study was to assess the effects of modification to the FISH test procedure on the results of diagnostically difficult histopathology specimens. It was found that some specimens are inadequate for HER2 assessment using standard FISH procedures. It is necessary to approach such cases individually. Application of appropriate modifications to the FISH procedure may lead to a useful result and thus, to the definition of a treatment regime for the patient. It was also found that various factors, including the fixation and processing of specimens, are involved in the broadly varying quality of histopathological materials. Key words: breast cancer, HER2, FISH