Anna Zimoch * Andrzej Jarmoluk ** Aspekty stosowania substancji bioaktywnych jako składników jadalnych powłok ochronnych mięsa i kiełbas Wstęp Technologia płotków, czyli przeszkód, jest powszechnie stosowana jako system kombinowanego utrwalania produktów żywnościowych, polegający na wykorzystaniu synergistycznego działania wielu czynników, powodujących hamowanie rozwoju drobnoustrojów, z których każdy działając pojedynczo jest mało skuteczny. Przeszkodami są parametry inaktywujące mikroorganizmy, jak np. aktywność wody (aw), ph czy potencjał redox (Eh), czy dodatek substancji bioaktywnych, które mogą uszkodzić kilka lub przynajmniej jeden z mechanizmów homeostatycznych mikroorganizmów. Na tej teorii oparłam koncepcję artykułu, gdzie substancje bioaktywne spełniają rolę takiej przeszkody. Celem badań było zaprojektowanie i wytworzenie biologicznie aktywnych jadalnych hydrozoli, które, po naniesieniu na powierzchnie produktów żywnościowych, tworzyłyby powłoki chroniące je przed zmianą barwy, nadmierną ususzką bądź zepsuciem. Do produkcji powłok wykorzystano kolejne substancje bioaktywne: chitozan, lizozym i nanokoloid srebra w ilościach dozwolonych do stosowania do żywności. Do oceny zmienności barwy, ze względu na to, iż jest ona jednym z najistotniejszych parametrów w ocenie jakości produktów spożywczych, także mięsa zastosowano metodę kolorymetrii odbiciowej, mierząc barwę parametrycznie w skali 3 wektorowej L*a*b*, gdzie parametr L* oznacza jasność barwy w zakresie od 0 do 100. Parametr a* reprezentuje barwę zieloną dla wartości ujemnych, natomiast barwę czerwoną dla wartości dodatnich w skali od 150 do + 100. Parametr b* zawiera się pomiędzy barwą niebieską dla war- * Dr inż., Katedra Technologii Surowców Zwierzęcych i Zarządzania Jakością, Wydział Nauk o Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, anna.zimoch@up.wroc.pl ** Dr hab. inż., prof. nadzw., Katedra Technologii Surowców Zwierzęcych i Zarządzania Jakością, Wydział Nauk o Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, andrzej.jarmoluk@up.wroc.pl
252 Anna Zimoch, Andrzej Jarmoluk tości ujemnych, a barwą żółtą dla dodatnich w skali od -150 do +100. Określenie ubytków przechowalniczych kiełbas pokrytych eksperymentalnymi hydrozolami oparto o pomiary ubytków masy w funkcji czasu. Stwierdzono, iż na zmianę parametrów barwy wpływ ma udział chitozanu i lizozymu w składzie powłoki oraz czas przechowywania eksperymentalnych kiełbas. Z kolei istotność stężenia chitozanu, nanokoloidalnego srebra oraz czasu przechowywania wykazano wobec strat masy kiełbas powstałych wskutek przechowywania. 1. Materiały i metody Do sporządzania eksperymentalnych hydrozoli wykorzystano chitozan (Low Molecular Weight) o niskiej masie cząsteczkowej, i DD 75-85% (Sigma-Aldrich), który rozpuszczano w 2% wodnym roztworze kwasu DL mlekowego (85% syrop Sigma). Jako substancję bioaktywną zastosowano lizozym (L) izolowany z białka jaja kurzego o stopniu aktywności enzymatycznej 2000 [U/mg białka] (Ovopol Nowa Sól). Dodatkowo do składu doświadczalnych biokompozytów użyto niejonowej formy nanokoloidu srebra, o wielkościach cząstek metalu w przedziale 10-60 nm i stężeniu 50 ppm, firmy Nano-Tech z Józefowa. Substancję bazową zoli stanowiła hydroksypropylometylocelluloza (HPMC) preparat Walocel HM 100 PA 2208 FG, firmy Dow Wolff Cellulosics. Hydroksypropylometylocelulozę (HPMC), stanowiącą przy wytwarzaniu eksperymentalnych biokompozytów bazowy składnik polisacharydowy, rozpuszczano w wodzie destylowanej, ogrzewanej podczas mieszania w łaźni wodnej do temperatury 70 C. Po 12 godzinach uzupełniano odparowaną część wody i wstawiano do chłodni o temperaturze 4 C. W tych samym czasie przygotowano zol chitozanu (CH), który rozpuszczano w 2% wodnym roztworze kwasu mlekowego. Następnie sporządzano podstawowy roztwór lizozymu. Tak przygotowane zole i roztwory substancji mieszano w odpowiednich proporcjach tak aby uzyskać finalne stężenia składników pokazane w tablicy 1 [Zimoch, Jarmoluk, 2010]. Pomiary parametrów barwy, pokrytego eksperymentalnymi zolami ochronnymi i przechowywanego chłodniczo mięsa wołowego (temperatura 4 o C), wykonano przy użyciu kolorymetru odbiciowego MINOLTA CR- 400. Mięso pokrywano zolem poprzez zanurzenie i pakowano próżniowo do woreczków z folii PAPE, na wkładce adsorbującej wodę (firmy Pamona). Pomiary prowadzono co 24 godziny przez trzy kolejne dni, a następnie od szóstego do dziesiątego dnia przechowywania. Urządzenie kalibrowano
Aspekty stosowania substancji bioaktywnych jako składników jadalnych 253 bezpośrednio przed pomiarem wobec wzorca bieli C o następujących współczynnikach: Y = 94,2; x = 0,313; y = 0,320. Wyniki przedstawiono w systemie L*a*b*. Tablica 1. Układ doświadczenia (plan cząstkowy -3 czynniki/3 poziomy o minimalnym stopniu uwikłania) Czynniki zmienności Stałe składniki Wariant Chitozan Lizozym Nanokoloid Ag [ppm] 1. 0 0 2. 0 0,5 2 3. 1 1 4. 0 2 5. 1 0,5 1 6. 1 0 7. 0 1 8. 2 0,5 0 9. 1 2 Źródło: Opracowanie własne. HPMC 0,5 Glicerol 25 (w stosunku do s. m. polimerów) Do oznaczenia ubytków masy produktów pokrytych eksperymentalnymi powłokami ochronnymi podczas przechowywania wykorzystano kiełbasę śląską. Batony pokrywano roztworem eksperymentalnych zoli, metodą zanurzeniową a następnie przechowywano w warunkach chłodniczych (temperatura 4 o C), bez dostępu światła. Kiełbasy ważono po 0, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 dniach przechowywania. 1.1. Analiza statystyczna wyników Wyniki doświadczenia określającego zmienność barwy mięsa poddano analizie wariancji, przy poziomie istotności p<0,05, wnioskując o istotności różnic w oparciu o test Duncana. Analizę statystyczną wyników z ususzki kiełbas przeprowadzono według metody płaszczyzny odpowiedzi RSM - Response Surface Methodology [Khuri A.I., Cornell J.A., 1996], która pozwala określić zależność między analizowanymi czynnikami na podstawie wyznaczenia współczynników równania kwadratowego o następującej postaci (1): Y = const + 3 3 2 β i X i + β ii X i + i= 1 i= 1 i= 1 j= i+ 1 gdzie: Y wyróżnik doświadczenia, β X ij i X j (1)
254 Anna Zimoch, Andrzej Jarmoluk Xi, Xj poziomy czynników niezależnych doświadczenia,?0,?i,?ii,?ij współczynniki równania regresji wyznaczone dla doświadczalnych powłok. Obliczenia statystyczne wykonano przy użyciu programu Statistica v.6.1. 2. Omówienie wyników 2.1. Zmienność fizycznych parametrów barwy mięsa pokrytego powłokami ochronnymi Oceniając zmienność barwy chłodniczo przechowywanych próbek mięsa stwierdzono, iż jasność (L*) mięsa zmienia się istotnie po naniesieniu na jego powierzchnię eksperymentalnych zoli. Zmienność ta jest zależna od ilościowo-jakościowego składu tworzących zol biokomponentów (tablica 2). Wraz ze wzrastającym udziałem poszczególnych składników następuje rozjaśnienie barwy mięsa, jednak największe jasności odnotowano zerowego dnia składowania (tablica 2). Próbkę o największym nasyceniu barwy czerwonej (a*), stanowił wariant kontrolny tj. przechowywany bez powłoki ochronnej. Nie wykazano istotności wpływu dodatku chitozanu i srebra na zmienność wartości tego parametru barwy, jednak zauważono, iż brak lizozymu w powłoce ochronnej odzwierciedlał się utrzymaniem bardziej czerwonej barwy mięsa (tablica 2). Analizując zmienność parametru b* (udział barwy żółtej w ogólnym jej tonie) zauważono, iż odcień żółty mięsa zwiększa się dla próbek pokrywanych roztworami filmów ochronnych. Tablica 2. Zmienność parametrów barwy L a*b* mięsa na przykładzie doświadczalnych zoli Efekty główne Parametr L* kontrola chitozan lizozym nanokoloid Ag [ppm] 0 44,94 b 0 44,96 a 0 45,77 b 1 46,05 a 0,5 45,91 b 1 45,45 ab 2 45,31 b 1 45,44 ab 2 45,08 a 43,30 c czas [dni] 0 47,61 d 1 45,00 ab 2 44,63 a 3 44,42 a 6 44,81 ab 7 44,74 ab 8 44,45 a 9 45,42 bc 10 45,91 c
a* Aspekty stosowania substancji bioaktywnych jako składników jadalnych 255 kontrola b* kontrola 0 10,52 a 0 11,00 ab 0 10,44 a 1 10,59 a 0,5 10,16 c 1 10,80 a 2 10,81 a 1 10,75 a 2 10,68 a 11,33 b 0 1,58 a 0 2,17 c 0 1,93 a 1 2,29 c 0,5 1,80 ac 1 1,55 a 2 1,68 a 1 1,58 a 2 2,07 a 0,87 b 0 10,18 c 1 10,94 ab 2 11,15 b 3 10,85 ab 6 11,08 ab 7 10,62 abc 8 10,54 abc 9 10,50 ac 10 10,50 ac 0 5,67 e 1-0,62 b 2-0,06 ab 3 1,57 c 6 0,47 a 7 2,30 d 8 3,00 d 9 2,21 c 10 0,53 a a-e różnice istotne statystycznie dla kolumn w obrębie czynników przy p 0,05 Źródło: Opracowanie własne. Zmiana parametrów barwy jest związana głównie z dodatkiem chitozanu, który ma odcień żółty, lizozymu z odcieniem bieli oraz z czasem przechowywania, podczas którego zmianom ulega czerwony barwnik mięsa mioglobina. Podobnie jak miało to miejsce w badaniach własnych, również badania Jo i współpracowników wykazały, iż kiełbasy z udziałem chitozanu cechują się jaśniejszą barwą [Jo i inni, 2001]. Znaleziono także doniesienia literaturowe, gdzie próbki mięsa zawierające chitozan cechowały się niższą wartością parametru L* niż kontrolne [Darmadji, Izumimoto, 1994]. Zmniejszenie wartości parametru (a*) w ocenie barwy mięsa powodowane jest głównie utlenianiem się barwników hemowych - mioglobiny, która przy niskim ciśnieniu cząstkowym tlenu ulega w czasie przechowywania przemianie do metmioglobiny. Naukowcy pod kierunkiem Youn zanotowali natomiast wzrost tonu czerwieni w kiełbasach wytwarzanych z chitozanem [Youn i inni, 1999], co potwierdza także Georgantelis, który zauważył synergistyczny efekt oddziaływania chitozanu i ekstraktu roz-
256 Anna Zimoch, Andrzej Jarmoluk marynu na wzrost wartości parametru a* burgerów wołowych [Georgantelis D. i inni, 2007]. 2.2. Zmienność ususzki przechowalniczej kiełbas pokrytych powłokami ochronnymi Zmienność wartości ubytków masy kiełbas pokrytych powłokami ochronnymi, przeanalizowano metodą powierzchni odpowiedzi. Stwierdzono istotność wpływu chitozanu (w zależności liniowej), a także nanokoloidu srebra oraz czasu przechowywania (w korelacji liniowej i kwadratowej) na zmiany masy przechowywanych wędlin (tablica 3). Współczynnik dopasowania modelu do wyników tego testu jest wysoki i wynosi 0,953 (tablica 3). Wykazano, że najistotniejszym czynnikiem warunkującym ubytki przechowalnicze jest czas chłodniczego składowania kiełbas. Tablica 3. Ocena efektów głównych wyznaczona na podstawie wartości współczynników równań regresji dla ubytku masy kiełbas podczas przechowywania Ubytek masy kiełbas [g] współczynnik współczynniki regresji dopasowania modelu R 2 R β 0 (średnia/stała) 180,700* β 1 (Chitozan L) 5,873* β 2 (Lizozym L) -0,001 β 3 (Nanokoloid Ag L) 10,484* β 4 (Czas L) -9,264* β 11 (Chitozan Q) 1,099 β 22 (Lizozym Q) -0,000 β 33 (Nanokoloid Ag Q) -6,907* β 44 (Czas Q) 0,235* * istotność efektu statystycznego dla p 0,05 Źródło: Opracowanie własne. 0,953 0,948 Ubytek przechowalniczy w przypadku wszystkich przetworów mięsnych jest problemem, z którym zmagają się technolodzy. Jednak w niektórych sytuacjach zabieg ten jest celowy i służy nadaniu produktowi odpowiednich cech sensorycznych. Po siedmio dniowym okresie przechowywania batony kiełbasy śląskiej pokrywane eksperymentalnymi zolami nie wykazywały żadnych sensorycznie odczuwalnych oznak zepsucia,. Pro-
Aspekty stosowania substancji bioaktywnych jako składników jadalnych 257 dukt uległ znacznemu obkurczeniu, wskutek utraty wilgoci i we wrażeniach sensorycznych przypominał kiełbasę trwałą. Zakończenie Wykazano, że możliwym jest wytwarzanie jadalnych powłok ochronnych do żywności z biokompozytów, zawierających jako substancje biologicznie aktywne chitozan, lizozym i nanokoloidalne srebro. Powłoki naniesione na powierzchni kiełbas umożliwiają prowadzenie ich odwodnienia z kontrolowaną dynamiką, eliminując również powstawanie wykwitów krystalicznych. Na żadnej z kiełbas pokrytych eksperymentalnymi hydrozolami nie obserwowano procesu oszronienia lub śluzowacenia mikrobiologicznego ich powierzchni. Stosowanie powłok ochronnych może się przyczynić do zapewnia wzrostu poziomu gwarantowanego bezpieczeństwa żywnościowego konsumentów i wysokiej jakości przy chłodniczym składowaniu mięsa i jego przetworów. Praca współfinansowana przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, 2007-2013, projekt pt. Innowacyjne technologie produkcji biopreparatów na bazie nowej generacji jaj (OVOCURA) Literatura 1. Darmadji P., Izumimoto M. (1994), Effect of chitosan in meat preservation, Meat Science, 38. 2. Georgantelis D., Blekas G., Katikou P., Ambrosiadis I., Fletouris J. (2007), Effect of rosemary extract, chitosan and α-tocopherol on lipid oxidation and colour stability during frozen storage of beef burgers, Meat Science, 75. 3. Jo J., Lee J. W., Byun M.W. (2001), Quality properties of pork sausage prepared with water-soluble chitosan oligomer, Meat Science, 59. 4. Khuri A.I., Cornell J.A. (1996), Response surfaces: designs and analyses. Second Edition, Revised and expanded, Marcel Dekker Inc. New York Basel Hong Kong. 5. Youn S.K., Park S.M., Kim Y.J., Ann D.H. (1999), Effect on storage property and quality in meat sausage by added chitosan, Journal of Chitin and Chitosan, 4. 6. Zimoch A., Jarmoluk A. (2010), Biopolimerowy biokompozyt o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, patent, PL 393258A.
258 Anna Zimoch, Andrzej Jarmoluk Streszczenie Teoria płotków, czyli przeszkód jest powszechnie stosowana, przy tworzeniu systemów kombinowanego utrwalania produktów żywnościowych polegających na wykorzystaniu synergistycznego działania wielu czynników, powodujących hamowanie rozwoju drobnoustrojów. Przeszkodami są czynniki inaktywujące mikroorganizmy, takie jak np. aktywność wody (aw), ph czy potencjał redox (Eh), czy dodatek substancji bioaktywnych, które mogą uszkodzić kilka lub przynajmniej jeden z mechanizmów homeostatycznych mikroorganizmów. W oparciu o tę teorię opracowano biokompozytowy hydrozol, zawierającego w swym składzie takie substancje bioaktywne jak: chitozan, lizozym i nanokoloid srebra. Substancje te zastosowano w 3 różnych stężeniach w zolach, wytwarzanych na bazie hydroksypropylometylocelulozy. Eksperymentalne biokompozyty oceniono pod kątem stabilizowania barwy mięsa pokrytego hydrozolami oraz standaryzacji procesu podsuszania kiełbas podczas ich chłodniczego przechowywania. Słowa kluczowe chitozan, lizozym, nanosrebro, barwa mięsa, ususzka Applicability of chitosan, lysozyme and nanocolloidal silver as a components of edible coatings for meat and sausages stored and refrigerated (Summary) Hurdles Technology or barriers is commonly used as a system of combined preservation of food products that can exploit the synergistic action of many factors, resulting in inhibition of microbial growth, each acting alone is not very effective. Barriers are the parameters that inactivate microorganisms, such as water activity (aw), ph and redox potential (Eh), or addition of bioactive substances that can damage some, or at least one of the homeostatic mechanisms of microorganisms. Taking advantage of this theory has been developed hydrosol composition, containing bioactive substances: chitosan, lysozyme and nanocolloidal silver. These substances are used in three different concentrations in the sol of hydroxypropyl methylcellulose as a base. Preservation of meat color covered by experimental hydrosols and effectiveness of dryness process of sausage dipped in hydrosols and stored in 4 o C were evaluated. Keywords chitosan, lysozyme, nano silver, meat color, dryness